CH682401A5

CH682401A5 - Immobilized enzymes.

Info

Publication number: CH682401A5
Application number: CH2713/91A
Authority: CH
Inventors: Volker Dr Kerscher; Hermann Dr Plainer; Bruno Dr Sproessler
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1990-09-15
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 1993-09-15
Also published as: NL9101531A; FR2666812A1; FR2666812B1; DK159891A; IT1250017B; DE4029374A1; DK159891D0; ITTO910697A1; ITTO910697A0

Description

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20 20th

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CH 682 401 A5 CH 682 401 A5

Beschreibung description

Die Erfindung betrifft Enzyme, die auf Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter immobilisiert sind und die sich insbesondere für die Anwendung in organischen Medien eignen. The invention relates to enzymes which are immobilized on natural substance particles of predominantly cellulose character and which are particularly suitable for use in organic media.

Schon frühzeitig wurde erkannt, welche Vorteile eine Träger-Fixierung von Enzymen beim technischen Einsatz mit sich bringt. In erster Linie sind hier die meist problemlose Wiederverwendbarkeit bei gewöhnlich geringerem Aktivitätsverlust, die Gewinnung enzymfreier Umsetzungsprodukte und die Möglichkeit einer kontinuierlichen Verfahrensführung zu nennen. Besonders aktuell ist die Immobilisierung, wenn Enzyme in organischen Medien zur Anwendung kommen sollen (vgl. A. M. Klibanow et al. in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 22, 3192 (1985); Kazandjian et al. Biotechnology and Bioengineering Vol. XXVill, pp. 417—421 (1986): It was recognized at an early stage what advantages a fixation of enzymes has in technical applications. First of all, the mostly problem-free reusability with usually less loss of activity, the extraction of enzyme-free reaction products and the possibility of a continuous process management are to be mentioned here. Immobilization is particularly topical if enzymes are to be used in organic media (cf. AM Klibanow et al. In Proc. Nat. Acad. Sei. USA 22, 3192 (1985); Kazandjian et al. Biotechnology and Bioengineering Vol. XXVill , pp. 417-421 (1986):

Dabei handelt es sich durchweg um teure Enzyme (wie z.B. Lipasen hoher Spezifität, Esterasen, Phospholipasen usw.), deren Wiederverwendbarkeit eine ökonomische Notwendigkeit darstellt. Weiter spielt dabei eine Rolle, dass bei Reaktionen im organischen Medium ein geringer Wassergehalt in der Reaktionszone notwendig ist. Ein Immobilisât erlaubt durch seine meist definierte Wasseraufnahme (überwiegend als «Quellverhalten» zu erfassen) eine genaue Einstellung des notwendigen Wassergehalts. Die Reaktionen im organischen Medium verlangen im allgemeinen eine möglichst grosse Grenzfläche zwischen dem organischen Medium, in dem sich das Substrat befindet und dem Enzym. Für solche heterogenen Reaktionsbedingungen bietet ein ausgewählter Träger mit möglichst hoher geometrischer Oberfläche den idealen Reaktionsort. Dagegen sind Enzymträger für homogene Reaktionen bei denen auf eine hohe innere Oberfläche (Porenvolumen) geachtet wird für diesen Reaktionsweg meist ungeeignet. Wie bereits erwähnt, haben sich eine Reihe von Enzymen, insbesondere vom Typ der Hy-drolasen, als wirksam im organischen Medium erwiesen. These are all expensive enzymes (such as high specificity lipases, esterases, phospholipases, etc.), the reusability of which is an economic necessity. Another factor that plays a role here is that a low water content in the reaction zone is necessary for reactions in the organic medium. Due to its mostly defined water absorption (mainly to be recorded as "swelling behavior"), an immobilizer allows the required water content to be set precisely. The reactions in the organic medium generally require the largest possible interface between the organic medium in which the substrate is located and the enzyme. For such heterogeneous reaction conditions, a selected support with the highest possible geometric surface offers the ideal reaction site. In contrast, enzyme carriers for homogeneous reactions in which attention is paid to a high inner surface (pore volume) are usually unsuitable for this reaction path. As already mentioned, a number of enzymes, in particular of the hydrolase type, have been found to be effective in the organic medium.

Möglichenweise lassen sich noch weitere Enzyme bzw. Enzymgruppen erfolgreich im organischen Medium einsetzen. Als paradigmatisch für die technischen Voraussetzungen der vorliegenden Erfindung und die vorliegende Problematik sei im folgenden die Klasse der Lipasen (Glycerinester-Hydrolasen, E.C. 3.1.1.3) angeführt. (Vgl. P. Gramatica in «Chimia oggi» 1989. pg. 9; M. Schneider, E. H. Reimer-des in Forum Mikrobiologie 9/87 pg. 302.) It is possible that other enzymes or enzyme groups can be successfully used in the organic medium. In the following, the class of lipases (glycerol ester hydrolases, E.C. 3.1.1.3) is mentioned as a paradigmatic for the technical requirements of the present invention and the present problems. (See P. Gramatica in "Chimia oggi" 1989. pg. 9; M. Schneider, E. H. Reimer-des in Forum Mikrobiologie 9/87 pg. 302.)

Mittels immobilisierter Lipasen lassen sich im organischen Medium unter geeigneten Bedingungen Umesterungen, Veresterungen, Alkohoiysen, Acidolysen und Hydrolysen durchführen. Derartige Reaktionen spielen in der Fettindustrie eine grosse Rolle. Es handelt sich dabei um ausgereifte technische Verfahren basierend auf eingehend untersuchten chemischen Prozessen. By means of immobilized lipases, transesterifications, esterifications, alcoholysis, acidolysis and hydrolysis can be carried out in the organic medium under suitable conditions. Such reactions play a major role in the fat industry. These are sophisticated technical processes based on carefully examined chemical processes.

Für entsprechende biologische Prozesse besteht überwiegend (noch) kein Bedarf, es sei denn, es werden an das Verfahrensprodukt höhere Ansprüche (z.B. Reinheit, Farbe, Stereospezifität u.ä.) gesteilt. Zwei Produkte seien stellvertretend für derartige spezielle Enzyme genannt: There is (still) no need for corresponding biological processes, unless higher demands are placed on the process product (e.g. purity, color, stereospecificity, etc.). Two products are representative of such special enzymes:

- Ein auf Ionenaustauscher adsorbierte Mucor mihei-Lipase (LIPOZYME® der Fa. Novo) - A Mucor mihei lipase (LIPOZYME® from Novo) adsorbed on ion exchangers

- Mittels Acetonfäliung auf Diatomeen-Erde niedergeschlagene Lipase (vgl. GB-C 1 577 933) - Lipase deposited on diatomaceous earth by acetone precipitation (see GB-C 1 577 933)

Ein grosstechnischer Einsatz von wertvollen Enzymen - wiederum seien als Beispiel Lipasen genannt - durch den sich die etablierten chemischen Verfahren hätten ersetzen lassen, ist bislang stets an den wirtschaftlichen Gegebenheiten - Lipasen sind auch nach der Immobilisierung viel zu teuer -und an den schwierigen Umsetzungsbedingungen - meist handelt es sich um heterogene Systeme -gescheitert. Es kann daher auch nicht überraschen, dass aus den vielerlei Vorschlägen für enzymati-sche Synthesen bislang kein industrieller Prozess hervorgegangen ist, zudem das Problem der Wiederverwendung des Enzyms grossenteils ungelöst ist. Somit bestand nach wie vor ein Bedarf an wohlfeiler, auf Trägermaterial immobilisierter Lipase. Es wurde nun gefunden, dass erfindungsgemäss immobilisierte Enzyme den Anforderungen der Technik in besonderem Masse nahekommen. Die Erfindung betrifft adsorptiv immobilisierte Enzyme E, die auf Enzymträgern ET bestehend aus unmodifizierten Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter wie Holzmehl, Cellulosefasern oder Baumwoll-Linters aufgebracht sind. A large-scale use of valuable enzymes - again lipases as an example - by which the established chemical processes could have been replaced has so far always been due to the economic circumstances - lipases are much too expensive even after immobilization - and due to the difficult reaction conditions - mostly are heterogeneous systems - failed. It is therefore not surprising that so far no industrial process has emerged from the many proposals for enzymatic syntheses, and that the problem of reusing the enzyme is largely unsolved. Thus there was still a need for inexpensive lipase immobilized on a carrier material. It has now been found that enzymes immobilized according to the invention come particularly close to the requirements of technology. The invention relates to adsorptively immobilized enzymes E which are applied to enzyme carriers ET consisting of unmodified natural substance particles of predominantly cellulose character, such as wood flour, cellulose fibers or cotton linters.

Die erfindungsgemäss anzuwendenden Naturstoffpartikel haben in der Regel eine Teilchengrösse im Bereich 0,01-1 mm. Im Stand der Technik hatte man zur Fixierung andere Wege eingeschlagen. The natural product particles to be used according to the invention generally have a particle size in the range of 0.01-1 mm. In the prior art, other approaches had been taken for fixation.

Cellulose und Lignin sind nach aufwendiger Modifizierung beispielsweise durch Perjodatoxidation und reduktive Aminierung als reaktive Enzymträger beschrieben worden (vgl. PCT Int. Appi. 8 102 860; Fen-gxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). Kovalente Enzymbindung an Celluiose wird in sehr allgemeiner Form auch in der GB-A 1 407 488 vorgeschlagen. An Celluloseperlen kovalent gebundene ß-Maltase wird z.B. von H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 2Q> 383 (1978) beschrieben. After extensive modification, cellulose and lignin have been described, for example, by periodate oxidation and reductive amination as reactive enzyme carriers (cf. PCT Int. Appi. 8 102 860; Fen-gxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). In a very general form, covalent enzyme binding to cellulose is also proposed in GB-A 1 407 488. Ss-Maltase covalently bound to cellulose beads is e.g. by H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 2Q> 383 (1978).

Bei den erfindungsgemässen Enzymträgern ET handelt es sich im Unterschied zum Stand der Technik um nicht chemischmodifizierte Naturstoffpartikel. Die die Naturstoffpartikel bildenden Fasern sind demnach nicht chemisch-reaktiv. In contrast to the prior art, the enzyme carriers ET according to the invention are non-chemically modified natural product particles. The fibers forming the natural product particles are therefore not chemically reactive.

Die Enzyme (siehe «Die Enzyme» im folgenden) werden vorzugsweise aus wässrigem Medium auf die Enzymträger ET aufgebracht. Vorteilhafterweise bedient man sich dabei der aus der DE-A The enzymes (see “The Enzymes” below) are preferably applied to the ET enzyme carrier from an aqueous medium. Advantageously, one uses the one from DE-A

2 2nd

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3 515 252 bekannten Methode, d.h. der Kupplung in Gegenwart einer relativ hohen Salzkonzentration, gegebenenfalls auch bei leicht erhöhten Temperaturen. Sulfate und Phosphate, aber auch andere aussalzende Salze sind hierfür am besten geeignet. 3,515,252 known method, i.e. the coupling in the presence of a relatively high salt concentration, possibly also at slightly elevated temperatures. Sulfates and phosphates, but also other salting salts, are best suited for this.

Die Anwendung der erfindungsgemäss immobilisierten Enzyme findet jedoch zweckmässig im organischen Milieu OM statt, vorzugsweise in Gegenwart von Spuren von Wasser. Als Anhalt seien 0,0004-1 Gew.-% Wasser bezogen auf das organische Milieu angegeben. However, the enzymes immobilized according to the invention are expediently used in the organic environment OM, preferably in the presence of traces of water. 0.0004-1% by weight of water, based on the organic environment, is given as a guide.

Die Enzyme E The enzymes E

Als zu immobilisierende Enzyme E eignen sich industriell anzuwendende Enzyme, inbesondere wenn deren Einsatz in organischem Medium praktikabel ist. Suitable enzymes E to be immobilized are industrial enzymes, in particular if their use in an organic medium is practical.

Genannt seien insbesondere die Klassen der Hydrolasen (z.B. E.C.3, insbesondere E.C.3.1., E.C. 3.2.1; E.C.3.4) der Isomerasen (z.B. E.C.5, insbesondere E.C.5.3.1), der Oxidoreductasen (E.C.1, insbesondere E.C.1.1; E.C.1.10; E.C.1.11; E.C.1.13) und der Transferasen (E.C.2, insbesondere E.C.2.1; E.C.2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973; Kirk-Othmer, Encyclope-dia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol. 9, 148-240, pg. 175-178 ff, 1980). Speziell erwähnt seien beispielsweise die Esterasen (E.C.3.1.1), Proteasen (E.C.3.4.12; E.C.3.4.21; E.C.3.4.22; E.C.3.4.23; E.C.3.4.24) Dehydrogenasen (E.C.1.1.1, 1.1.3), Peroxidasen (E.C.1.11.1) Glycosyltransferasen (E.C.2.4) und insbesondere die Lipasen (E.C.3.1.1.3), die Phospholipasen vom Typ A2 (E.C.3.1.1.4), B (E.C.3.1.1.5), C (E.C. 3.1.4.3) und D (E.C.3.1.4.4), die Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4), Peroxidase (E.C.1.11.1.6), Lipoxidase (E.C.1.13.11.12) Hexosyltransferasen (E.C.2.4.1) und Pentoxytransferasen (E.C.2.4.2). Zu den Enzymen sei im einzelnen ausgeführt: The classes of hydrolases (for example EC3, in particular EC3.1., EC 3.2.1; EC3.4) of isomerases (for example EC5, in particular EC5.3.1) and oxidoreductases (EC1, in particular EC1.1; EC 1.10; EC1.11; EC1.13) and the transferases (EC2, especially EC2.1; EC2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973; Kirk-Othmer, Encyclope-dia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol. 9 , 148-240, pg. 175-178 ff, 1980). The esterases (EC3.1.1) and proteases (EC3.4.12; EC3.4.21; EC3.4.22; EC3.4.23; EC3.4.24) dehydrogenases (EC1.1.1, 1.1.3 ), Peroxidases (EC1.11.1) glycosyltransferases (EC2.4) and especially the lipases (EC3.1.1.3), the phospholipases of type A2 (EC3.1.1.4), B (EC3.1.1.5), C (EC 3.1. 4.3) and D (EC3.1.4.4), glucose oxidase (EC1.1.3.4), peroxidase (EC1.11.1.6), lipoxidase (EC1.13.11.12) hexosyltransferases (EC2.4.1) and pentoxytransferases (EC2.4.2) . Regarding the enzymes, the following is detailed:

A) Lipasen (E.C.3.1.1.3) A) Lipases (E.C.3.1.1.3)

Wie allgemein üblich seien als Lipasen Carboxylesterasen bezeichnet, die normalerweise Glycerin-ester in wässriger Emulsion spalten. Sie unterscheiden sich insofern von anderen Carboxylesterasen, die das Substrat in wässriger Lösung spalten. As is generally the case, carboxyl esterases, which normally cleave glycerol esters in an aqueous emulsion, are referred to as lipases. They differ from other carboxylesterases in that they cleave the substrate in aqueous solution.

a) Pankreas-Lipasen a) Pancreatic lipases

Der pankreatische Enzymkomplex enthält neben Lipasen meist Esterasen sowie Proteasen und Amy-lasen als technisch wichtige Begleitenzyme. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7-8,5 der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5-9,5. In addition to lipases, the pancreatic enzyme complex mostly contains esterases as well as proteases and amylases as technically important accompanying enzymes. The pH optimum (compared to olive oil) is in the range 7-8.5, the activity range is pH 6.5-9.5.

Lipasen sind i.a. sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleitprotea-sen. Lipases are generally very unstable, especially with regard to proteolytic degradation by accompanying proteases.

ß) Mikrobiologische Lipasen z.B. aus Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (z.B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Pénicillium sp. (z.B. P. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae). ß) microbiological lipases e.g. from Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (e.g. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Pénicillium sp. (e.g. P. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae).

Diese Lipasen weisen in der Regel mindestens ein pH-Optimum bei pH > 7,0 auf. Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zulässt, Verwendung u.a. in der Abfallbeseitigung, Lederindustrie und in der Ernährungsbranche. These lipases generally have at least one optimum pH at pH> 7.0. As far as their instability permits, lipases are used, among other things. in waste disposal, leather industry and in the food industry.

In herkömmlicher Weise wird die Aktivitätsbestimmung von Lipasen mit Olivenöl als Substrat durchgeführt, ferner mit Triacetin und Tributyrin. [Vgl. M. Sémériva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971); Phar-maceutical Enzymes, edited by R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)]. The activity determination of lipases is carried out in a conventional manner with olive oil as a substrate, furthermore with triacetin and tributyrin. [See. M. Semiva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971); Pharmaceutical Enzymes, edited by R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)].

Soweit die fettspaltende Aktivität in Kilo-Lipase-Units (Einheit = KLCA) ausgedrückt wird, wird unter den Standardbedingungen: 40 Grad C, pH = 5,5 mit Tributyrin als Substrat gearbeitet. (Vgl. M. Sémériva, oben zitierte Literaturstelle.) Insofar as the fat-cleaving activity is expressed in kilo-lipase units (unit = KLCA), tributyrin is used as the substrate under the standard conditions: 40 degrees C, pH = 5.5. (See M. Sémériva, reference cited above.)

B) Katalasen/Hydroperoxidasen (E.C.1.11.1.6) B) Catalases / Hydroperoxidases (E.C.1.11.1.6)

a) aus tierischem Gewebe z.B. aus Leber a) from animal tissue e.g. from liver

ß) aus Pflanzen z.B. aus Meerrettich ß) from plants e.g. from horseradish

7) aus Mikroorganismen z.B. aus Micrococcus lysodeicticus 7) from microorganisms e.g. from Micrococcus lysodeicticus

Katalasen finden üblicherweise Anwendung zur Peroxid-Bleichung und in der Milchindustrie. Catalases are usually used for peroxide bleaching and in the milk industry.

C) Proteasen (E.C.3.4; Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. 2, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industriai Aspects of Biochemistry, Vol. 2Ü (l), PP 23-46, North Holland 1974.) C) Proteases (E.C.3.4; Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. 2, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industriai Aspects of Biochemistry, Vol. 2Ü (l), PP 23-46, North Holland 1974.)

a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise a) Rennin (E.C. 3.4.23.4) a) of animal origin, such as a) Rennin (E.C. 3.4.23.4)

ß) Pankreas-Proteasen β) pancreatic proteases

Pancreatin, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7-10) Pancreatin, especially trypsin, chymotrypsin (pH range approx. 7-10)

Pepsin (E.C.3.4.23.1) (pH-Wirkungsbereich ca. 1,5-4,0) Pepsin (E.C.3.4.23.1) (pH range about 1.5-4.0)

3 3rd

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CH 682 401 A5 CH 682 401 A5

Kathepsin (E.C.3.4.23.5) Kathepsin (E.C.3.4.23.5)

Wirkungsbereich ca. 4.0-5,0 Area of effect approx. 4.0-5.0

b) pflanzlichen Ursprungs a) Papain (E.C.3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-8,0 b) of vegetable origin a) papain (E.C.3.4.22.1) pH-effective range approx. 5.0-8.0

ß) Ficin (E.C.3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-9,0. ß) Ficin (E.C.3.4.22.3) pH range of action approx. 4.0-9.0.

7) Bromelain (E.C.3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-7,0 7) Bromelain (E.C. 3.4.22.4 and 3.4.22.5) pH range of action approx. 5.0-7.0

c) mikrobiellen Ursprungs (vgl. L. Keay in «Process Biochemistry», 1971, 17-21. c) of microbial origin (cf. L. Keay in “Process Biochemistry”, 1971, 17-21.

a) aus Bacillus-Arten wie B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides. a) from Bacillus species such as B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.

ß) aus Streptococcus-Arten ß) from Streptococcus species

7) aus Streptomyces-Arten wie Streptomyces fradiae, S.griseus, S.rectus 7) from Streptomyces species such as Streptomyces fradiae, S.griseus, S.rectus

8) aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus flavus-oryzae, A.niger, A.saitoi, A.usamii e) aus Mucor- und Rhizopus-Arten wie Mucor pusillus, M.miehei 8) from Aspergillus species such as Aspergillus flavus-oryzae, A.niger, A.saitoi, A.usamii e) from Mucor and Rhizopus species such as Mucor pusillus, M.miehei

I) Endothia-Arten wie Endothia parasitica il) aus Trametes-Arten wie Trametes sanguinea I) Endothia species such as Endothia parasitica il) from Trametes species such as Trametes sanguinea

Ausser der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäss dem Angriffsort (Exo-versus Endo-Enzyme) und aufgrund der «Active Site» der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzyme) Anwendung. Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen Gesichtspunkten i) Alkalische Proteasen, mit Wirkungsoptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13, insbesondere ali-kalische Bakterienproteasen (E.C.3.4.21.) (die zumeist dem Serin-typ angehören) und alkal. Pilzprote-asen ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0-9,0 insbesondere neutrale Bakterienprotease (E.C.3.4.24.) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Bacillus-Proteasen, Pseudomonas-Proteasen, Streptomyces-Proteasen, Aspergillus-Proteasen. In addition to the differentiation according to origin, the differentiation according to the place of attack (exo-versus endo-enzymes) and the “active site” of the proteases (serine proteases that are inhibited by DFP, sulfhydryl enzymes) are also used. Furthermore, the pH dependence of the enzyme activity is of considerable practical importance. A distinction is therefore made mainly from a practical point of view i) alkaline proteases, with an optimum activity in the range from pH 7.5 to 13, in particular alkaline bacterial proteases (EC3.4.21.) (Which mostly belong to the serine type) and alkaline. Fungal protein ases ii) Neutral proteases, with an optimum activity in the range of pH 6.0-9.0, in particular neutral bacterial protease (EC3.4.24.) (Which belong to the metalloenzymes) and fungal proteases, for example Bacillus proteases, Pseudomonas proteases, Streptomyces proteases, Aspergillus proteases.

iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0-5,0 (E.C.3.4.23) insbesondere saure Pilzproteasen, z.B. aus Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pénicillium spp., Mucor spp., und Impex lacteus und Endothitia parasitica iii) Acidic proteases with optimal activity in the range of pH 2.0-5.0 (E.C. 3.4.23), in particular acidic fungal proteases, e.g. from Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pénicillium spp., Mucor spp., and Impex lacteus and Endothitia parasitica

Proteasen finden u.a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleischabbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung. Proteases can be found in leather production, in detergents and in cleaning, in desizing, in cheese production, in meat degradation and in the stabilization of beer industrial application.

Genannt seien als alkalische Proteasen insbesondere die Subtilisine, alkalische Bakterienproteinasen vom Serin-Typ, die im pH-Bereich 9-10 stabil und gegen Perborat einigermassen unempfindlich sind. Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson-Haemoglobin-Methode (M. L. Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (die Löh-lein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) als «LVE» (Löhlein-Volhard-Einheit) bestimmt. Unter einer Löhlein-Volhard-Ein-heit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut. Weiter werden im folgenden für die Aktivitätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme Einheiten verwendet, die aus der Anson-Methode abgeleitet sind. Diese werden als «Proteinase-Units (Haemoglobin)» UHb bezeichnet. Eine UHb entsprichit der Enzymmenge, welche die Freisetzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Haemoglobin äquivalent 1 uMol Tyrosin pro Minute bei 37 Grad C (gemessen bei 280 nm) katalysiert. (1 mUHb = 10-3 UHb). The subtilisins, alkaline bacterial proteinases of the serine type, which are stable in the pH range 9-10 and are somewhat insensitive to perborate, may be mentioned as alkaline proteases. The proteolytic activity of enzymes is customarily determined by the Anson-Hemoglobin method (ML Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) or by the Löhlein-Volhard method (the Löh-lein-Volhard method for determination of the proteolytic activity, Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) as "LVE" (Löhlein-Volhard unit). A Löhlein-Volhard unit is to be understood as the amount of enzyme which, under the specific conditions of method 1.725 mg of casein, and in the following we use units derived from the Anson method to determine the activity of the enzymes active in the acidic range, which are referred to as “proteinase units (hemoglobin)” UHb. A UHb corresponds to the amount of enzyme which catalyzed the release of trichloroacetic acid-soluble fragments from hemoglobin equivalent to 1 µmol tyrosine per minute at 37 degrees C (measured at 280 nm) (1 mUHb = 10-3 UHb).

D) Phospholipasen D) Phospholipases

Unter Phospholipasen sei wie üblich die Gruppe von Hydrolasen verstanden, die Phospholipide hydrolytisch spalten und zwar entweder die Carbonsäure-Esterbindung (Phospholipasen A & B) oder die Phosphorsäure-Esterbindung (Phospholipase C & D). Lecithinspaltende Phospholipasen werden auch als Lecithinasen bezeichnet. As usual, phospholipases are understood to mean the group of hydrolases which hydrolytically cleave phospholipids, namely either the carboxylic acid ester bond (phospholipases A & B) or the phosphoric acid ester bond (phospholipase C & D). Lecithin-cleaving phospholipases are also referred to as lecithinases.

Die Unterscheidung wird allgemein nach dem Angriffspunkt getroffen. Die Phospholipasen A trennen aus Lecithin (bzw. Kephalin) eine Fettsäure ab, wobei Lysolecithin (bzw. Lysokephalin) zurückbleibt. Phospholipase Ai spaltet endständige Fettsäuren ab. Phospholipase A2 (E.C. 3.1.1.4) mittelständige, meist ungesättigte, die im Falle von Arachidonsäure zu Prostaglandinen metabolisiert werden können. The distinction is generally made according to the point of attack. The phospholipases A separate a fatty acid from lecithin (or kephalin), leaving lysolecithin (or lysokephalin). Phospholipase Ai cleaves terminal fatty acids. Phospholipase A2 (E.C. 3.1.1.4) medium-sized, mostly unsaturated, which can be metabolized to prostaglandins in the case of arachidonic acid.

Quellen für Phospholipase A2 sind beispielsweise Pankreas, Insektengifte und Schlangengifte. Die Phospholipase B (E.C. 3.1.1.5) spaltet aus Lysolecithin Fettsäure ab unter Bildung von Glycerophos-phorsäurecholinester. Sie kommt z.B. in Kohlehydraten wie Reiskleie, Malz, Getreide, Kartoffeln, Erbsen, sowie in Schimmelpilzen und Wespengift vor. Sources of phospholipase A2 are, for example, pancreas, insect venom and snake venom. Phospholipase B (E.C. 3.1.1.5) cleaves fatty acid from lysolecithin to form glycerophosphoric acid choline ester. It comes e.g. in carbohydrates such as rice bran, malt, cereals, potatoes, peas, as well as in mold and wasp poison.

4 4th

5 5

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15 15

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CH 682 401 A5 CH 682 401 A5

Phospholipase C (E.C.3.1.4.3) greift Lecithin unter Bildung von Phosphorylcholin an. Sie kommt beispielsweise in Bacillus cereus, im Gehirn und in Schlangengift vor. Phospholipase C (E.C.3.1.4.3) attacks lecithin to form phosphorylcholine. It occurs, for example, in Bacillus cereus, in the brain and in snake venom.

Die Phospholipase D (E.C. 3.1.4.4) macht aus Lecithin Cholin und als weiteres Spaltprodukt Phosphatidsäure frei. Sie kann z.B. aus Streptomyces chromofuscus gewonnen werden. Weitere Vorkommen sind Blattpflanzen wie Kohl, Spinat, Zuckerrübenblätter, Hevea brasiliensis aber auch Getreidekeimlinge, Gerstenmalz usw. Phospholipase D (E.C. 3.1.4.4) turns lecithin into choline and as a further cleavage product, phosphatidic acid. It can e.g. can be obtained from Streptomyces chromofuscus. Other occurrences are leaf plants such as cabbage, spinach, sugar beet leaves, Hevea brasiliensis but also cereal seedlings, barley malt etc.

Im allgemeinen liegt das pH-Optimum bei den Typen C und D bei ca. 8,0, bei den anderen Typen vorwiegend bei pH 5-6. In general, the optimum pH for types C and D is around 8.0, for the other types predominantly at pH 5-6.

(Vgl. E. A. Dennis, in P. D. Boyer (Ed.) The Enzymes, 3isl Ed. Vol. 16, pp. 307-353 Academic Press 1984; Zur Analytik: vgl. Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 7g, 281 (1976).) (See EA Dennis, in PD Boyer (Ed.) The Enzymes, 3isl Ed. Vol. 16, pp. 307-353 Academic Press 1984; For analysis: see Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 7g, 281 (1976 ).)

Die Enzymträger ET The enzyme carrier ET

Die erfindungsgemässen Enzymträger stellen - wie vorstehend definiert - unmodifizierte Naturstoffpartikel von vorwiegend Cellulosecharakter dar. Unmodifiziert sind sie in dem Sinne, dass sie keine chemische Umwandlung, insbesondere keine irgendwie geartete Aktivierung erfahren haben. Beispielhaft genannt seien insbesondere Holzmehl, Cellulosefasern, Baumwoll-Linters u.ä. Üblicherweise sind die erfindungsgemäss einzusetzenden Enzymträger daher aus Fasern aufgebaut bzw. stellen fasrige Partikel dar. In der Regel weisen die erfindungsgemäss einzusetzenden Naturstoffpartikel eine Partikelgrösse von 0,01-1 mm auf (wobei an jede Raumachse zu denken ist, die durch das Einzelpartikel gelegt werden kann). As defined above, the enzyme carriers according to the invention are unmodified natural substance particles of predominantly cellulose character. They are unmodified in the sense that they have not undergone any chemical conversion, in particular no activation of any kind. Examples include wood flour, cellulose fibers, cotton linters and the like. The enzyme carriers to be used according to the invention are therefore usually composed of fibers or are fibrous particles. In general, the natural substance particles to be used according to the invention have a particle size of 0.01-1 mm (with each spatial axis being taken into account by the individual particle) can).

Der Immobilisierungsvorgang The immobilization process

Die Enzyme werden zweckmässig aus wässriger Lösung auf die Enzymträger ET aufgebracht. Als Anhalt sei ein Verhältnis EnzymAA/asser von etwa 1:(10-20) angegeben. Die wässrige Lösung kann vorteilhaft noch an sich bekannte Zusätze zu Enzymformulierungen wie Stabilisatoren, Stellmittel wie z.B. Natriumsulfat enthalten. Als Anhalt für den Salzgehalt seien etwa 1/5-1/15 der Wassermenge angegeben. Es hat sich als zweckmässig erwiesen, zunächst das Enzym in Wasser zu lösen, dann beispielsweise Natriumsulfat zuzugeben und zuletzt die Naturstoffpartikel, beispielsweise in Form von Holzmehl. Man lässt das Enzym über einen gewissen Zeitraum, gewöhnlich ca. 20 Stunden und unter Durchmischung beispielsweise durch Rühren auf den Enzymträger aufziehen, wobei es sich - in Abhängigkeit von den verwendeten Enzymen - öfter empfiehlt, oberhalb Raumtemperatur, beispielsweise bei 40 Grad C zu arbeiten. Schliesslich wird abgesaugt und der beladene Enzymträger ET getrocknet. The enzymes are expediently applied to the ET enzyme carrier from aqueous solution. A ratio of enzyme AA / water of about 1: (10-20) is given as a guide. The aqueous solution can advantageously also be known additives to enzyme formulations such as stabilizers, adjusting agents such as e.g. Contain sodium sulfate. As a guide to the salinity, about 1 / 5-1 / 15 of the amount of water is given. It has proven to be expedient first to dissolve the enzyme in water, then to add sodium sulfate, for example, and finally the natural substance particles, for example in the form of wood flour. The enzyme is allowed to soak over a period of time, usually about 20 hours and with thorough mixing, for example by stirring, onto the enzyme carrier, it being more advisable, depending on the enzymes used, to work above room temperature, for example at 40 ° C. Finally, it is suctioned off and the loaded enzyme carrier ET is dried.

Das organische Medium OM The organic medium OM

Das organische Medium OM ist zweckmässig den Verfahrenszwecken und -bedingungen angepasst. Es kann aus den Reaktionspartnern allein bestehen, z.B. im Fall einer Umesterung von Fetten aus dem Fettgemisch selbst. Das Substrat kann aber auch mit organ. Lösungsmitteln verdünnt werden. Bewährt haben sich Kohlenwasserstoffe, insbesondere aliphatische oder cycioaliphatische KW mit 6-18 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Heptan, Isooctan, Hexadecan, Cyclohexan, gegebenenfalls auch Toluol. Bei Anwendung von Lipasen kommen auch Lösungsmittel vom Ether-Typ wie z.B. Diethylether oder Isopropyl-ether in Frage, insbesondere bei Pancreas-Lipasen. The organic medium OM is suitably adapted to the process purposes and conditions. It can consist of the reactants alone, e.g. in the case of transesterification of fats from the fat mixture itself. However, the substrate can also be mixed with organ. Solvents are diluted. Hydrocarbons, in particular aliphatic or cycioaliphatic KW with 6-18 carbon atoms, such as e.g. Heptane, isooctane, hexadecane, cyclohexane, optionally also toluene. When using lipases, ether-type solvents such as e.g. Diethyl ether or isopropyl ether in question, especially with pancreatic lipases.

Stark polare und protische organische Lösungsmittel sind dagegen weniger nützlich, was die von anderer Seite beobachtete Tendenz zu abnehmender Enzymaktivität bei steigender Wassermischbarkeit zu bestätigen scheint. Strongly polar and protic organic solvents, on the other hand, are less useful, which seems to confirm the tendency, observed from other sides, to decrease enzyme activity with increasing water miscibility.

Vorteilhafte Wirkungen Beneficial effects

Nach den vorliegenden Erfahrungen erhält man eine sehr befriedigende Beladung der Enzymträger ET mit den Enzymen. Im Falle der Beladung mit einer Lipase fanden sich z.B. im Filtrat des Immobili-sats < 1% der Ausgangsaktivität wieder, d.h. unter Praxisgesichtspunkten wurde die gesamte eingesetzte Enzymmenge fixiert. According to the available experience, a very satisfactory loading of the enzyme carriers ET with the enzymes is obtained. In the case of loading with a lipase, e.g. in the filtrate of the immobilizate again <1% of the initial activity, i.e. the entire amount of enzyme used was fixed from a practical point of view.

Wie unmittelbar einzusehen eignen sich die erfindungsgemäss an den Enzymträgern ET fixierten Enzyme vorwiegend zum Einsatz im organischen Medium OM, vorteilhaft in Anwesenheit geringer Wassermengen (ca. 0,004-1 Gew.-%). Dadurch kann die Desorption effektiv vermieden werden. Die erfindungsgemässen Enzymträger sind in der Regel primär zur Anwendung in Batch-Prozessen geeignet, da das sachgerechte Packen von Säulen mit den Enzymträgern ET Schwierigkeiten bereitet. As can be seen immediately, the enzymes fixed to the enzyme carriers ET according to the invention are primarily suitable for use in the organic medium OM, advantageously in the presence of small amounts of water (approx. 0.004-1% by weight). This effectively prevents desorption. The enzyme carriers according to the invention are generally primarily suitable for use in batch processes, since the proper packing of columns with the ET enzyme carriers is difficult.

Die erfindungsgemäss immobilisierten Enzyme sind nach vorliegenden Erfahrungen für die Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen nach Massgabe ihrer bekannten Aktivitäten voll geeignet. So lassen sich beispielsweise mit immobilisierten Lipasen in an sich bekannter Weise Umesterungen, Veresterungen, Alkoholysen, Acidoiysen und Hydrolysen durchführen. Von besonderem Interesse ist u.a. die Möglichkeit zur selektiven Hydrolyse gegebenenfalls unter Erhalt bzw. Erzeugung optisch aktiver Zentren. According to available experience, the enzymes immobilized according to the invention are fully suitable for carrying out enzymatically catalyzed reactions in accordance with their known activities. For example, with immobilized lipases, transesterifications, esterifications, alcoholysis, acididysis and hydrolysis can be carried out in a manner known per se. Of particular interest is the possibility of selective hydrolysis, optionally with the maintenance or generation of optically active centers.

5 5

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15 15

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30 30th

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CH 682 401 A5 CH 682 401 A5

BEISPIELE EXAMPLES

A. Immobilisierung von Enzymen A. Immobilization of enzymes

A.1. Immobilisierung von Lipasen A.1. Immobilization of lipases

250 g Holzmehl (Produkt der Fa. Rettenmeier) mit einer Partikelgrösse von ca. 100 um werden mit 250 g einer Lipase aus Pseudomonas (Aktivität 20 000 LCA/g, Produkt ©DEGOMMA 7101 der Fa. Röhm GmbH) in 3750 g Wasser, das 588 g Natriumsulfat enthält, gemischt und bei 40 Grad C 20 Stunden lang gerührt. Bei der Herstellung des Ansätze; hat es sich als zweckmässig erwiesen, zunächst die Lipasen in Wasser zu lösen, danach das Salz und zuletzt das Holzmehl zuzugeben. Anschliessend wird abgesaugt und getrocknet. Aktivität des Immobilisats: 6 000 LCA/g Trockengewicht. Im Filtrat des Immobilisats werden < 1 % der Aktivität wiedergefunden. 250 g of wood flour (product from Rettenmeier) with a particle size of approx. 100 μm are mixed with 250 g of a lipase from Pseudomonas (activity 20,000 LCA / g, product © DEGOMMA 7101 from Röhm GmbH) in 3750 g of water, the Contains 588 g of sodium sulfate, mixed and stirred at 40 degrees C for 20 hours. When making the approaches; it has proven to be useful to first dissolve the lipases in water, then add the salt and finally the wood flour. It is then suctioned off and dried. Immobilisate activity: 6,000 LCA / g dry weight. <1% of the activity is recovered in the filtrate of the immobilizate.

Immobilisierung auf Holzmehl Immobilization on wood flour

A.2. Immobilisierung von Phospholipase A2 A.2. Immobilization of phospholipase A2

17,5 g einer Phospholipase A2 (Lecitase 10 L der Fa. Novo-Nordisk, 10 000 internat. Units/ml (1 internat. Unit für Phospholipase A2 ist definiert als die Enzymmenge, die 1 jimol freie Fettsäure pro Minute aus Lecithin abspaltet) werden in 4000 ml Wasser gelöst, dem nachträglich 400 g Ammoniumsulfat zugesetzt wurden. In diese Lösung werden 250 g Holzmehl «Lignocel C 120» der Fa. Rettenmeier mit einer Partikelgrösse von ca. 100 um eingetragen. 17.5 g of a phospholipase A2 (lecitase 10 L from Novo-Nordisk, 10,000 international units / ml (1 international unit for phospholipase A2 is defined as the amount of enzyme which releases 1 jimol of free fatty acid per minute from lecithin) are dissolved in 4000 ml of water, to which 400 g of ammonium sulfate were subsequently added, and 250 g of wood flour “Lignocel C 120” from Rettenmeier with a particle size of approximately 100 μm are introduced into this solution.

Die Suspension wird 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt. The suspension is stirred for 2 hours at room temperature.

Anschliessend wird abgesaugt (aber nicht nachgewaschen) und schonend getrocknet (bei 40 Grad C im Vakuumtrockenschrank über Nacht). It is then suctioned off (but not washed) and dried gently (at 40 ° C in a vacuum drying cabinet overnight).

Im Filtrat des Immobilisats wird praktisch keine Enzymaktivität wiedergefunden. Der Träger selbst wird auf Aktivität nach der «Eigelbmethode» geprüft (Eigelb als Substrat, 40 Grad C, pH = 8). Er hat 212 internat. Units/g, was einer Aktivitätsausbeute von 30,3% entspricht. Virtually no enzyme activity is found in the filtrate of the immobilized product. The carrier itself is checked for activity according to the «egg yolk method» (egg yolk as substrate, 40 degrees C, pH = 8). It has 212 international units / g, which corresponds to an activity yield of 30.3%.

Dieses Enzym ist z.B. zur Lecithinspaltung nach Zusatz von geringen Wassermengen in Öl (z.B. Soja-Rohöl) geeignet. This enzyme is e.g. suitable for lecithin splitting after adding small amounts of water in oil (e.g. crude soybean oil).

A.3. Immobilisierung von Glucoseoxidase (GOD) / Katalase A.3. Immobilization of glucose oxidase (GOD) / catalase

Es wird wie in Beispiel A2 vorgegangen, nur werden als Enzym 10 ml Glucoseoxidase/Katalase aus Aspergillus einer GOD-Aktivität von 850 Units*/ml (* 1 GOD-Unit/ml ist definiert als die Enzymmenge, die pro Minute 1 umol Gluconsäure freisetzt. (37 Grad C, pH = 5.5) eingesetzt. The procedure is as in Example A2, except that 10 ml glucose oxidase / catalase from Aspergillus with a GOD activity of 850 units * / ml (* 1 GOD unit / ml is defined as the amount of enzyme which releases 1 µmol gluconic acid per minute . (37 degrees C, pH = 5.5).

Im Filtrat nach Kupplung des Enzyms werden nur Spuren des Enzyms wiedergefunden. Die Aktivität des Trägers betrug 20 Units, was einer Aktivitätsausbeute von 59% entspricht. Only traces of the enzyme are found in the filtrate after coupling of the enzyme. The activity of the carrier was 20 units, which corresponds to an activity yield of 59%.

Durch seinen Gehalt an Katalase kann der Träger zur Entfernung von H2O2 in einer verdünnten Desinfektionslösung verwendet werden. Dazu wird er in einem Fliessbett in einer Säule (Fliessrichtung von unten nach oben) eingesetzt. Die Zerstörung von H2O2 ist an der Bildung von Gasbläschen (Sauerstoff) gut erkennbar. Due to its catalase content, the carrier can be used to remove H2O2 in a diluted disinfectant solution. It is used in a fluid bed in a column (flow direction from bottom to top). The destruction of H2O2 can be recognized by the formation of gas bubbles (oxygen).

A.4. Immobilisierung von alkalischer Proteinase auf Cellulosepulver A.4. Immobilization of alkaline proteinase on cellulose powder

4 g einer alkalischen Proteinase aus B. licheniformis (Alcalase 2.0 T von Novo Nordisk) werden in 4 I 1 m Phosphatpuffer von pH = 8.0 gelöst. Dann werden 400 g Cellulosepulver fein mit einem Schüttvolumen von 3 l/hg (Fa. Rettenmeier) zugesetzt und 1 Std. bei 40 Grad C gerührt. Dann wird die Cellulo-sepulver-Suspension, ohne zu waschen abgesaugt und schonend getrocknet (40 Grad C, Vakuumtrok-kenschrank). 4 g of an alkaline proteinase from B. licheniformis (Alcalase 2.0 T from Novo Nordisk) are dissolved in 4 l of 1 m phosphate buffer with pH = 8.0. Then 400 g of fine cellulose powder with a bulk volume of 3 l / hg (from Rettenmeier) are added and the mixture is stirred at 40 ° C. for 1 hour. Then the cellulose sepulver suspension is vacuumed without washing and gently dried (40 degrees C, vacuum drying cabinet).

Im Filtrat werden < 7% der ursprünglichen Enzymaktivität wiedergefunden. Die Hauptmenge ist am Cellulosepulver adsorbiert (81% des eingesetzten Enzyms) <7% of the original enzyme activity is recovered in the filtrate. The main amount is adsorbed on the cellulose powder (81% of the enzyme used)

Gemessen wurde hier in Löhlein-Vollhard-Einheiten (LVE)*. Measurements were taken here in Löhlein-Vollhard units (LVE) *.

Alcalase 2.0 T .... 140 000 LVE/g 0,1 %ige Lösung ... 140 LVE/g Alcalase 2.0 T .... 140 000 LVE / g 0.1% solution ... 140 LVE / g

Filtrat nach Kupplung ... < 10 LVE/g ( = < 7% der Ausgangsaktivität) Filtrate after coupling ... <10 LVE / g (= <7% of the initial activity)

Aktivität am Träger... 113 LVE/g ( = 81% Aktivitätsausbeute) Activity on the carrier ... 113 LVE / g (= 81% activity yield)

Dieses Enzym ist z.B. für stereospezifische Estersynthesen im organischen Medium geeignet. This enzyme is e.g. Suitable for stereospecific ester synthesis in an organic medium.

A.5. Immobilisierung des Pankreasenzymkomplexes A.5. Immobilization of the pancreatic enzyme complex

Es wird wie in Beispiel A2 vorgegangen, nur werden als Enzym 10g Pankreasenzyme (Corolase PP Röhm Enzymtechnologie, Leitaktivität 220 000 LVE) eingesetzt. The procedure is as in Example A2, except that 10 g of pancreatic enzymes (Corolase PP Röhm enzyme technology, conductivity 220,000 LVE) are used as the enzyme.

6 6

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

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CH 682 401 A5 CH 682 401 A5

Im Filtrat nach Kupplung des Enzyms werden nur Spuren des Enzyms wiedergefunden. Die Aktivität des Trägers wurde mit 4000 LVE gemessen, was einer Aktivitätsausbeute von 45% entspricht. Only traces of the enzyme are found in the filtrate after coupling of the enzyme. The activity of the carrier was measured at 4000 LVE, which corresponds to an activity yield of 45%.

Durch seinen Chymotrypsingehalt (~ 10% der Proteinasen) ist dieses immobilisierte Enzym für Estersynthesen im organischen Medium gut geeignet. Due to its chymotrypsin content (~ 10% of the proteinases), this immobilized enzyme is well suited for ester synthesis in an organic medium.

B. Anwendung der immobilisierten Enzyme B. Application of the immobilized enzymes

B.1. Umesterung B.1. Transesterification

1 g immobilisierter Lipase (Beispiel A.1.) werden 2 Stunden bei 50 Grad C in einer Mischung aus 0,8 g Tristearin in 40 g Myristinisopropylester gerührt. Der Wassergehalt ist gering: 8,3% im Immobilisât; das Substrat wurde vorher getrocknet. 1 g of immobilized lipase (Example A.1.) Are stirred for 2 hours at 50 degrees C in a mixture of 0.8 g of tristearin in 40 g of myristine isopropyl ester. The water content is low: 8.3% in the property; the substrate was previously dried.

Nach 2 Stunden ist der Gehalt des Tristearins auf 5% des Ausgangswertes abgesunken. Das entspricht einem Umsatz von 95%. Laut GC-Analyse sind ca. 40% Umesterungsprodukte, wie z.B. Trimyri-stin, 55% Hydrolyseprodukte wie verschiedene Mono- und Diglyceride. After 2 hours the tristearin content dropped to 5% of the initial value. That corresponds to a turnover of 95%. According to GC analysis, approx. 40% of transesterification products, e.g. Trimyristine, 55% hydrolysis products such as various mono- and diglycerides.

B.2. Enantioselektive Umesterung B.2. Enantioselective transesterification

Zu einer schwach gerührten Lösung von 1.11 g 2-0-Benzylglycerin (6,1 mmol) in 20 ml tert.-Butylme-thylether (= 0,3 mol/l) gibt man bei Raumtemperatur 2 ml Vinylacetat (1,82 g; 18,2 mmol) und 100 mg immobilisierter Lipase (Beispiel 1) hinzu. Der Verlauf der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Cyclohexan/Essigester = 1/1 auf Kieselgel-Platten \\ (Diol) = 0,10; n (Acetat) = 0,32) verfolgt. Bei erstmaliger Anwendung des Enzyms erreicht man nach 6 Stunden vollständigen Umsatz (bei achtmaliger Anwendung steigt die benötigte Reaktionszeit kontinuierlich auf ca. 12 Stunden). Nach beendigter Reaktion filtriert man das Enzym ab, wäscht dieses mit tert.-Butylmethylester und engt die vereinigten Filtrate mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein. Man erhält sehr sauberes (S)-1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol als Öl. To a weakly stirred solution of 1.11 g of 2-0-benzylglycerol (6.1 mmol) in 20 ml of tert-butyl methyl ether (= 0.3 mol / l), 2 ml of vinyl acetate (1.82 g; 18.2 mmol) and 100 mg of immobilized lipase (Example 1). The course of the reaction is followed by thin layer chromatography (cyclohexane / ethyl acetate = 1/1 on silica gel plates \\ (diol) = 0.10; n (acetate) = 0.32). When the enzyme is used for the first time, complete conversion is achieved after 6 hours (when used eight times, the required reaction time increases continuously to approximately 12 hours). When the reaction is complete, the enzyme is filtered off, washed with tert-butyl methyl ester and the combined filtrates are concentrated using a rotary evaporator. Very clean (S) -1-acetyloxy-2-benzyloxypropan-3-ol is obtained as an oil.

(S)-1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol (S) -1-acetyloxy-2-benzyloxypropan-3-ol

C12H16O4 MG: 224,26 g/mol C12H16O4 MG: 224.26 g / mol

Drehwerte (c = 2 T = 20 Grad C) Rotation values (c = 2 T = 20 degrees C)

CHCI3 CHCI3

Ethanol Ethanol

H H

M M

589 nm 589 nm

-17,3° -17.3 °

+12,2° + 12.2 °

578 nm 578 nm

-18,1° -18.1 °

+12,7° + 12.7 °

546 nm 546 nm

-20,3° -20.3 °

+14,6° + 14.6 °

436 nm 436 nm

-34,6° -34.6 °

+25,1° + 25.1 °

365 nm 365 nm

-54,1° -54.1 °

+39,6° + 39.6 °

Aus dem Vergleich mit Literaturdrehwerten (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173) liegt das Material mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von 86% vor. The material with an enantiomeric excess (ee) of 86 results from the comparison with literature rotation values (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173) % in front.

Claims

1. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers, characterized in that the enzymes on enzyme carriers ET consisting of unmodified natural substance particles of predominantly cellulose character are immobilized by adsorption.

2. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 1, characterized in that the enzyme carriers ET are selected from the group consisting of wood flour, cellulose fibers and cotton linters.

3. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 2, characterized in that the natural substance particles have a particle size in the range 0.01-1 mm.

4. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claims 1-3, characterized in that the enzymes are selected from the class of hydrolases, isomerases, oxidoreductases and transferases.

5. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 4, characterized in that the enzymes represent lipases E.C.3.1.1.3.

6. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 4, characterized in that the enzymes are proteases E.C.3.4.

7. Adsorptively immobilized on solid enzyme carriers according to claim 4, characterized in that the enzymes are catalases E.C.1.11.1.6.

7

5

10th

15

20th

25th

30th

35

40

45

50

55

CH 682 401 A5

8. A process for the production of enzymes immobilized by adsorption on solid enzyme carriers ET, characterized in that the enzymes are allowed to be drawn from an aqueous medium onto unmodified natural product particles with a predominantly cellulose character.

9. The method according to claim 8, characterized in that the aqueous medium contains 1/5 to 1/15 of its weight of adjusting salt.

10. The method according to claim 9, characterized in that sodium sulfate is used as the adjusting salt.

8th