JPS61249390A - 溶解タンパク質の固定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上のｆＦｕ用分野 本発明は、水中に溶解したタンパク質、特に酵素を電解
質の存在で固体担体に固定する方法に関する。

従来の技術 固定された酵素は、溶解した酵素をグルタルジアルデヒ
ドを用いて架橋することによってすでに得られた。この
場合イオン濃度の増大によつて架橋が促進される現象が
観察されたが、これは電解質の沈殿作用によると説明さ
れた〔Ｋ・オが夕（Ｏｇａｔａ　）等：　Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ａｃｔａ。

１５９巻（１９６８）、４０５〜４０７頁参照〕。

西独国特許出願公開第３３３７５２５７号記載の方法の
場合には、多孔質担体、例えば珪藻土に酵素溶液を含浸
させ又は担体を固体酵素の層で被覆しかつ担体と溶解又
は固体酵素とから成るこの調製物を水性塩溶液中に入れ
かつ架橋剤を作用させることによって固体酵素を耐久的
に製造する。塩溶液は、酵素が酵素ａ４製物から溶出さ
れず、固定を無効にしないという効果を有する。従って
この方法は原則的に２つの別個の作業段階つまり担体及
び溶解又は可溶性酵素を含有する酵素調製物の製造及び
酵素調製物の架橋浴導入を必要とする。

ヨーロッパ特許出願公開第３７６６７号には巨大多孔質
陽イオン性交換樹脂から成る担体に、またヨーロッパ特
許出願公開８２７５６７２号には巨大多孔質両性イオン
交換樹脂から成る担体に、グルタルジアルデヒドを用い
て菌類ラクターゼを結合することが記載されている。両
方法の場合、緩衝物質としての両型解質は、せいぜいグ
ルタルジアルデヒドとの反応前又は後に使用するけれど
も、反応そのものの間にはイオン吸着が止められないよ
うに０−０５　ｍｏｌ　／　Ｉｌを決して越えない低ａ
ｙＬでのみ使用する。これに対して高いイオン濃度は、
場合により架橋されずに残存し光酵素量を担体から溶出
するための手段であると述べている。両性又は陽イオン
性担体樹脂は、基質溶液の溶解成分との不利な交換作用
を幾度も生じ、従って使用できなくなることが多い。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、高い活性収率を有する巨大多孔質（ａ
ｈａｋｒｏｐｏｒｏｅａ　）担体に対する溶解タンパク
質の固定を、一段階法で簡単に行うことである。

問題点を解決するための手段 ところが、水に不溶で、高々弱い膨潤性の固体担体に対
する溶解タンパク質の固定は、少なくとも０−１５　ｍ
ｏ１／　Ａ’の電解質イオン濃度を有するタンパク質の
水性溶液を、タンパク質の担体吸着が行われるまで、前
記水性溶液によって接触された担体上に作用させる場合
に萎効することが判明した。純粋吸着固定が十分である
と、負荷担体を容易に分離することができる。一般に固
定は架橋剤によって安定化される。この架橋は本発明に
よれば、電解質含有溶液中で直接行い、タンパク質吸着
担体を予め分離しない。

吸着の間及び少なくとも次の、架橋剤による固定の際に
は、電解質含有溶液の上澄みを用いて作業するので、懸
濁された又はカラ五元填物として配置された担体粒子は
完全に接触される。

有利な作用 前記範囲の高いイオン濃度は従来は、共有結合されなか
ったタンパク質分子を担体から溶出し、架橋剤の存在で
担体を含まない不溶沈殿物を形成する手段として認めら
れていたのに、このような高イオン濃度が巨大多孔質担
体上のタンパク質の固定を促進するという事実は意外で
ある。

次表は、イオン濃度の増大する際グルタルジアルデヒド
を用いてペニシリンアミダーゼをフェニルセファローズ
（Ｐｈｅｎｙｌａｅｐｈａｒｏｓｅ　）に結合する際の
活性収率の増大を示す。結合方法は例５で記載した作業
法と同じである。

燐酸カリウム緩衝液　　　　担体結合酵素の活性モル濃
度　　イオン濃度　　　湿潤重量１ｇ当　　固定活性の
０．０１　　　０．０３　　　　　　　６４　　　　　
　３６０．０５　　　０．１５　　　　　　　１０３　
　　　　　５１０．１０　　　０．３０　　　　　　１
２８　　　　　　７２０．５０　　　１．５０　　　　
　　１７０　　　　　　９２グルタルゾアルデヒドを用
いないと、他の点では同じ結合条件下でも結合活性は認
められない。

両性担体における固定と比べて本発明による好ましい作
業法の有利な作用は、酵母ラクターゼの結合の例により
説明することができる。ヨーロッパ特許出願公開！２＜
５６７２号の比較実験１によれば、酵母ラクターゼは−
６，６５，２０〜２２℃で、グルタルジアルデヒドによ
ってフェノール・ホルムアルデヒド樹脂を基剤とする両
性イオン交換体に量収軍６４俤で固定される。しかし活
性は、活性収率が実際には得られない程低い。

これに対して、酵素製剤１１１ｇ／ｌを含有する水性溶
液から成る酵母ラクターゼを、２３℃で結合活性基とし
てオキシラン基を有する架橋アクリルアミドを基剤とす
るパール状の中性巨大多孔質担体樹脂に結合すると、使
用した電解質濃度に依存して次の活性収率が得られる二
〇、５　　　　　　１．２１　　　　６．５１．０　　
　　　　２．４２　　　　１９１．２５　　　　　　５
．０２　　　　５１就中、極めて異なる非特異性担体に
よる本発明方法によって、従来は担体の費用のかかる活
性化後に初めて達成できる絶対的な高活性及び抜群の活
性収率が容易に得られることは意外である。架橋終了後
にはタンパク質はまた低イオン濃度でも担体に結合され
ており、例えば酵素の場合には、注目すべき活性損失な
しに幾度も再使用することができる。

有効な応用 本発明による方法は、もともと可溶性タンパク質を固定
された形で含有する、あらゆる種類の巨大多孔質固体物
体の製造に適している。最もＸ要な応用分野は担体結合
酵素の製造である。

また親和性クロマトグラフィー用光填材の製造及び診断
用検体の製造も重要である・ タンパク質 本発明により結合されうるタンパク質は、０〜６０℃の
温度で十分に水溶性であって、溶解された形で担体に接
触することのできるタンパク質である。本発明はこの種
の特定タンパク質に限定されておらず、タンパク質を含
有する水溶性の任意の生物原物質を包含する。本発明方
法を完全に否定する事例は今まで観察されなかったけれ
ども、個々のタンパク質が担体に結合され得ないか又は
結合されても他の方法によるよりも不良な結果しか得ら
れない場合も起り得るだろう。タンパク質をイオン添加
によって又は酵素の場合には基質添加によって安定化す
るのが有利である場合もある。

好ましいのは酵素である。例としてはアミラーゼ、プロ
テアーゼ、アミダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘ
ミ−セルラーゼ、アシラーゼ、ラクターゼ、イソメラー
ゼ、インベルターゼ及びオキシダーゼが挙げられる。非
酵素タンパク質の種類の例は抗体、タンパク質構造を有
するホルモン及び酵素抑制因子である。

担体 担体は巨大多孔構造を有する、水又は電解質溶液に不溶
の任意の固体から成っていてよい。

巨大多孔構造を有する適当な固体は、少なくとも１Ｑｎ
ｍの孔径を有する細孔を有しかつ０．１ｃｒｔ？　／１
１　、好ましくは０．５α３／ｇを越える孔容積を有す
る。好ましい担体は１０〜１１００ｎの孔径、１０〜５
００１１Ｌ２／１１の比表面積及び１〜５ａｎ３／１１
の孔容積を有する。

担体の外形は、少な（とも１　ｍ２／ｌの比表面積を有
する表面積に富む系が数倍有利であるとしても、担体の
作用にとっては重要ではない、それというのも担体作用
は固定タンパク質の高い活性量を小さい空間に結合する
ことを許すからである。適当な担体としては、容器又は
管もしくは容器又は導管の組込部材の内表面及び被膜、
洗滌可能な又は流通可能なフィルム、膜、紙、織布、繊
維フリース又は繊維パツキン材料又は他のパツキン材料
、又は固体物体の積層物がある。これらの物体の間に十
分に大きい流通可能な空間が存在する場合には、担体又
は少な（とも表面に近い担体層は、流通性を損すること
な（著しく膨潤することができる。好ましくは粒子状担
体を使用する。粒子状の担体とは１０ｍ未満、好ましく
は０．１〜５肩冨の範囲の粒度を有する担体の意である
。゛極めて好ましくはパール、つまり球状担体である。

粒子状担体カベその中で使用される水性媒体中で全く膨
潤しないか又は僅かしか膨潤しない、好ましくは乾燥分
の嵩体積の２倍未満にしかならない場合が有利である。

粒子状担体に適合する条件は、同担体が電解質含有溶液
中で攪拌によって懸濁されうるか又はカラム充填物中を
流通しうるかということである。

陽イオンを有しない担体固体が好ましい。これは、基質
又は少なくとも有効表面に共有結合された陽イオン基又
はプロトン化によって陽イオン基に変化し５る塩基性基
、つまりアンモニウム基又はアミノ基を有しないか又は
とにかく０．１ｍ当量７１１未満の前記基を有する固体
を意味する。特に、イオンを有しない（ｕｎｇｅｌａｄ
ｅｎ）か又は弱陰イオンを有する巨大多孔質固体が好ま
しい。「イオンを有しない」とは、共有結合されたカル
ざニル基、カルボキシレート基、スルホネート基、アミ
ノ基又はアンモニウム基を有しないか又は０．１ｍ当量
／Ｉ（乾燥担体樹脂）未満の前記基を有する固体を謂う
。弱陰イオン性担体樹脂は、５導当量／Ｉ以下の濃度で
陰イオン基、例えば共有結合されたカルボキシル基又は
カルざキシレート基を有することができる。

前記の数値はともかく樹脂物質の場合には担体粒子の活
性表面についてあてはまる。

しかし、タンパク質の表面塩析（ｏｂｅｒｆｌａｅａｈ
ｅムｕｓｓａｘｚｕｎｇ　）は、高められた塩濃度の作
用下に極めて親水性の表面においても、それどころか強
陰イオンを有する固体においてさえ起つ５ることが判明
した。したがってまたこのよ５な担体も使用することが
できる。

タンパク質の結合は、疎水基、例えばＣ原子２個以上を
有する飽和又は好ましくは不飽和の脂肪族側基又は芳香
族基によって著しく促進されるが、これは前記基の大き
さよりも担体表面のこれらの基の面密度に依存する。好
ましい担体は、孔壁の表面で又は連続的に少な（とも１
重量％の前記種類の側基を有する重合体物質から成る。

原則的にはまた、巨大多孔質無機担体例えばパール状ガ
ラス又はガ・ラス繊維〔例えば＠調整多孔ガラス（Ｃｏ
ｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｆｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ　）”〕１珪
酸、酸化アルミニウム又は活性炭も適当である。有機物
質、特にプラスチックは、それから成る担体を限定され
た形で、例えばパール、繊維、フィルム又は複機の形で
比較的容易に製造することができるという利点を有する
。有機担体の化学的構造は、個々の場合に最も有利な効
果が如何なる種類の担体を用いて得られるかを入念に試
験する必要はあるけれども、重要ではない。

水に不溶の適当な巨大多孔質合成樹脂は、例えば無極性
であって、架橋されていないか又は架橋されていてもよ
く、例えばポリメチルメタクリレート及び他のアクリル
エステルポリマー、ポリスチロール、セルロースエステ
ル、フェノールホルムアルデヒ）″樹脂、エダキシ樹脂
又はＩリオレフインである。合成樹脂はまた極性を有し
、程度の差こそあれ親水性であってもよいが、架橋によ
り水に不溶であってもよい。これに属するものは、架橋
セルロース及びデンプン誘導体、架橋ポリアクリルアミ
ド又はポリメタクリルアミド、アクリル酸又はメタクリ
ル酸の架橋ポリヒドロキシアルキルエステル、架橋ポリ
ビニルピロリドン又は非塩基性アミノゾロスト樹脂であ
る。

吸着性を改善するためには、担体を少な（とも表面に関
し若干疎水性にするのがしばしば有利である。例えば二
酸化珪素、ベントナイト又は多孔ガラスのような無機担
体を、フェニル官能性シランと反応させることによって
、表面にフェニル基を施してもよい。同様に巨大多孔質
有機担体、例えばセファローズ（８ｅｐｈａｒｏｓｅ　
）ヲ、フェニルグリシジルエーテルでフェニル化するか
又はアルキルグリシジルエーテルでアルキル化してもよ
い。アルキル基の他に、Ｃ原子１〜１８個を有するすべ
ての直鎖又は枝分れアルキル基も一般に吸着促進作用を
有する。

パール又は中空パールの形の担体衝脂の好適な群は、西
独国特許出願公告第２２３７３１６号、同第２３４３６
！ｉ３号及び西独国特許出願公開第２７２２７５１号に
より得られる。これは、親水性母材を有し、好ましくは
主要部分がアクリルアミド、メタクリルアミド及び架橋
性メチレン−ビス−アクリルアミド又は−メタクリルア
ミドから構成された殆ど膨桐しないか又は膨潤しない架
橋重合体である。これらの重合体は、タンパク質に対し
て結合性を有する基、特にエポキシ基を有する。それと
いうのも該重合体は加水分解によって又はタンパク質と
の反応の際イオン基を形成しないからである。また該重
合体は、片側のみが反応された架橋剤分子から由来する
遊離メタクリルロイル基又はイソプロパニル基約２〜５
重量％を有する。これらの担体を使用する場合には、付
加的架橋剤の併用を省略することもできる。

電解質 電解質は、本発明による方法の場合おそらく、水分子の
形成によって、タンパク質の一種の過飽和、ともか（そ
の溶解度の減少をもたらす作用を有する。タンパク質の
溶解後に初めて電解質にタンパク質を加えるのが有利で
あることが多い。それというのもそうしなければタンパ
ク質は、時にはなかなか溶解しないか又は全熱溶解しな
いからである。

いかなる電解質がいかなる濃度で沈殿作用を呈するかと
いう問題は、タンパク質の性質、その濃度及び同伴物質
に依存しており、場合に応じてテストしてみなければな
らない。一般には塩析作用を有するすべての電解質、例
えば離液順列によれば塩化物を含むすべての塩析性陰イ
オンを使用することが、できる。電解質の種々の効果の
例は、Ｈ，Ｍ、ラウエン（Ｒａｕｅｎ　）が１ビオヒエ
ミツジエン・タツシエンデーフ（Ｂｉｏｃｈ−ｅｍｉａ
ｈｅｎ　Ｔａａｃｈｅｎｂｕｃｈ　）”、Ｔｅ１１２、
第２版、５６〜５７頁で記載している。次の方程式：％
式％： 〔式中日は電解質の存在におけるタンパク質の溶解度を
表わし、Ｓｏは電解質の不在でのタンパク質の溶解度を
表わす〕によるに８の正の値を有する電解質が適当であ
る。多価金属陽イオンは沈殿又は不活性化作用を呈する
ことが多く、従って１価陽イオン、就中アルカリイオン
を選ぶべきである。陰イオンは添加電解質の作用に明ら
かに影響する。硫酸塩、燐酸塩及びポリ燐酸塩が一番好
適である。また炭酸塩、クロム酸塩、酢酸塩、クエン酸
塩及び酒石酸塩も強塩析作用を発揮するが、敏感なタン
パク質の場合には必ずしも使用できない。塩化物又は酢
酸塩のような１価陰イオンは、必要なイオン濃度を得る
ためには比較的高い濃度で１価陰イオンとして使用しな
ければならない。塩析作用を発揮することができるため
には、どれも高濃度で使用しなければならない。構造形
成中性塩、例えば硫酸アンモニウム、−ナトリウム又は
−カリウム、燐酸水素アンモニウム、−ナトリウム又は
カリウムは効果が大きく、値段が安価で、無害であるた
めに大部分のタンパク質にとって最も適している。電解
質含有タンパク質溶液のμ値は、タンパク質の感受性に
左右され、好ましくは４〜９の範囲にある。

添加電解質の効果にとってそのイオン濃度Ｊは決定的で
ある。イオン濃度は、１イオン種を含む水性溶液に関し
て、次式： ％式％（１２ 〔式中０１は１イオン種の濃度を表わし、Ｚｉはそのイ
オン価を表わす〕により計算される。例えば１　ｍ　Ｋ
２ＨＰＯ４の溶液の場合、Ｃｋ＝２、ｚｋ＝１、ＣＨｐ
ｏ　＝　１．２口。１＝２からイオン濃度番 Ｊ＝３が得られる。実際には好ましい電解質の濃度は、
０．１５〜２ｍｏｌ　／　ｌのイオン濃度の範囲にある
。好ましくはイオン濃度は少な（ともＱ、３　ｍｏｌ　
／　ｌである。

固　　定 固定は原則として吸着段階とともに始まる。

また架橋剤が使用される場合には吸着段階が架橋反応に
先行する。２つの段階を前記順序で次次に行うことがで
きる、つまっ先づ電解質の存在でタンパク質を担体に吸
着させ、次に初めて架橋性結合成分を加えることができ
る。この順序が好ましい。しかしまた両役所を工程的に
包括して、結合成分をすでに吸着の間に電解質と共に同
時に作用させてもよい。最後にまた多くの場合、先づ担
体を結合成分のみと反応させ、次に初めてタンパク質及
び電解質を加えることもできる。

タンパク質の吸着は、タンパク質の水性溶液の上澄み及
び担体材料から成る系においては、０．１〜１００時間
、好ましくは１〜１０時間の間に起こる。両反応段階で
電解質溶液が担体粒子の周りで接触することが重要であ
る。温度の上昇とともに固定は促進される。好ましくは
、タンパク質が効果の損失なしに耐えられる最高温度で
作業する。また０℃でもなお作業することはできるけれ
ども、４０℃を越える温度、多くの場合５０℃を越える
温度が極めて有利であるＯ 固定すべきタンパク質は、溶液の重量に対して例えば０
．０１〜３０チの広い濃度範囲及び担体材料に対する量
割合の広い範囲で使用することができる。酵素の場合に
は高い結合収率及び生成物活性が得られる。負荷量は一
般にタンパク質２０ｖ／、９（乾燥担体物質）を越えて
おり、つまり２Ｊ［量係以上である。これに対して生物
巨大分子を単離するための固定配位子の場合には小さい
負荷密度が有利である。

固定は、担体をタンパク質溶液中で懸濁しかつ電解質添
加後工提の終るまで適度に攪拌するという具合に行うこ
とができる。また電解質含有タンパク質溶液をカラム反
応器の担体充填物中に流し、同溶液を長時間ポンプで供
給してもよい。

固定は差当ってタンパク質の担体吸着のみである。負荷
された担体を次に電解質の少ない媒体に導入すると、多
くの場合タンパク質の脱着を予期しなければならない。

これは、後続のタンパク質分子の共有結合によって相互
に又は担体に関して紡出する。この目的のために第２反
応段階で結合成分つまり架橋成分を加える。これは工程
的にはすでに吸着段階の間に行うこともできる。

結合成分は、少なくともタンパク質の固定に十分な量が
水性電解質溶液中に溶けていなけれ、ばならない。同成
分は電解質溶液の上澄み中で使用されることが重要であ
る。つまり溶液は担体物質によって完全に吸着されては
ならない。

湿潤担体物質１ｄ当り少なくとも約Ｑ、２ｍｊ、好まし
くは１０ゴまでの電解質溶液を使用する。

さらに結合成分は電解質の存在で作用しなければならな
いので、電解質の沈殿作用はタンパク質が不可逆的に固
定されてしまうまで保持されている。

結合成分としては、２個以上の官能基を有する少な（と
も限定的に水溶性の化合物が適当であり、同成分はこれ
らの官能基によってタンパク質及び場合によっては担体
の対応する官能基と反応することができる。不可逆的固
定はタンパク質それ自体の架橋又はタンパク質の担体に
対する架橋によって起こる。タンパク質に対して反応す
る適当な官能基は、例えばアルデヒド基、エポキシ基、
ジアゾ基、インシアネート基及びクロル蟻醒エステル基
である。多（の場合カルざン酸無水物又は−エステル基
はあまり有利ではない、それというのもこれらの基が隘
イオンカルボキシレート基の形成によって担体の電気化
学的性質を著しく変化させるからである。

使用することのできる結合成分の例は、ジアゾベンジジ
ン、ヘキサメチレンジイソシアネート、クロル蟻酸エチ
ルエステルであり、極めて重要な化合物としてはグルタ
ルジアルデヒドである。

また分子量１００，０００未満の低水溶性嵐合朱例えば
ポリアクロレイン、アクリル−又はメタクリルアミドと
グリシジルアクリレート又は−メタクリレート、アクロ
レイン又はＮ−アリルメタクリルアミドとの共重合体も
使用することができる。

もちろん、紫外線の作用下又はラジカル形成体くレツド
クス開始剤）によって初めて結合活性を生じるような結
合成分、例えばジアリルエーテル又はアクリル−又はメ
タクリルアミドとｐ−）ルイルーヒドロキシエチルメタ
クリレートとの共産体は残っていなければならない。

不可逆的固定に必要な結合成分量は、タンパク質及び場
合によっては担体に対する同成分の反応能力に依存し、
例えばタンパク質の重量に対して１〜１００重量％の範
囲にあってよい。

結合の反応条件は一般に吸着反応条件とは異っていて、
両反応は同一条件下では同時に進行することができる。

グルタルジアルデヒドを用いる結合の場合には、一般に
０〜８０℃の温度で０．１〜１００時間、好ましくは２
時間の反応時間で十分である。

固定反応後には一般に、場合によりタンパク質及び結合
成分の未結合残分を含有する電解質溶液を負荷された担
体から分離する。この負荷担体は適当な緩衝液を用いて
後洗浄して、工業的応用のために使用する。

実施例 例　　１ 担体：内部表面積的２０’　ＯＮ”／９及び平均孔径４
　Ｑ　ａｍを有するパール状高架橋巨大多孔質スチロー
ル／ジＣニルベンジル。

酵素：クルコースイソメラーゼ、ストレゾトミセｘ−ア
ルプス（ｇｔｒｅｐｔｏｍｙａｅｓ　ａｌｂｕ日ンの培
養物からの液状濃縮物。

活性：酵素ＩＩＩがｐＨ７、温度７０℃で６０分間にＤ
−グルコース溶液Ｑ、１ｍｏｂからＤ−フルクトース５
ｇを生成する。

結合：先づ巨大多孔質担体に対する酵素の吸着が行われ
る。このために担体１０．９を、塩溶液（硫酸ナトリウ
ム１２％、硫酸マグネシウム５チ及び硫酸コパル）　０
．０２１を含有する）５ゴ中の酵素１０ＩＩと一緒に回
転台（Ｒｏｌｌｂａｎｋ　）でころがす。水性溶液のイ
オン濃度は４．１８ｍｏｂ　／　７３である。−値は７
．０に調整した。２０時間後に０．５　％グルタルジア
ルデヒドを加えて、再びころがす。これによって吸着さ
れ九酵素は“横架橋され（ｑｕｅｒｖｅｒｎｅｔｇｔ　
）”、細孔中に固定される。

２時間後に吸引し、洗浄する。活性の比較的測定によっ
て４５俤の濾液の残余活性が得られる。担体では３７チ
が再び検出される（＝活性収率３７％）。

応用：固定グルコースイソメラーゼを、カラム反応器に
充填する。６０℃の温度で一＝７．５の４０１ｓグルコ
ース溶液は１時間当つ固定床容積の７倍の流量で４０俤
が異性化されてフルクトースになった。

例　　２ 固定アスペルギルス・オリデエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ａｏｒｙｇａｅ　）−ラクターゼ 担体：架橋ポリアクリル酸エステル、２５ｎｍの平均孔
径、内部表面積１４０　ｍ”／１１．直径０．３〜１寵
のパール状担体。

酵素：アスペルギルス・オリデエーラクターゼ、粉末状
濃縮物、活性＝３０．０００σ／ｇ。

結合：担体１ｉを、酵素製剤１ｇと一緒に３５℃で塩溶
液４０ｄ中で８時間ｍ盪する。同塩溶液は塩化カリウム
２４俤を含有し、−＝５．０に調整した。水性溶液はイ
°オン濃度３．２１ｍｏｂ　／　Ｊを有している。さら
に酵素安定化のためにラクトース０．１　％を加えた。

次に冷却し、室温でさらに２時間グルタルジアルデヒド
０．５俤を添加しながら振盪する。次に吸引し洗浄する
。担体及び濾液のラクターゼ活性を比較する。

担体については使用した活性の３４１が再び検出され、
濾液では１１チである。活性収率＝６４％。

応用：固定したアスペルギルス−ラクターゼをカラム反
応器に充填する。３５℃の温度で一＝４．５の５１ｓラ
クトース溶液は、１時間当り４０倍の固定床容積の流量
で９０１以上が加水分解される。６０日後にはもう認め
られる程の活性低下は検出できない。

例　　３ 担体：遊離エポキシ基（オキシラン酸素１．２１ｓ）及
び孔内面に集中している付着イソプロペ基層。２．２優
を有するメタクリルアミド／メチレン−ビス−メタクリ
ルアミドをベースとするパール状の高架橋巨大多孔質重
合体。孔容積＝３．４ｄ／ｇ、平均孔径＝’ｌｎｍ６１
１１担体の製造は西独国特許出願公開第２７２２７５１
号の例２に記載しである。

この場合には吸着酵素の結合は、高い塩濃度の作用下に
酵素の吸着と同時にエポキシ基によって共有的に行われ
る。　　　゛ 酵素：サツカロミセス（８ａｃａｈａｒｏｍｙａｅｅ　
）〔クルイベロミセス（ＩＣｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅａ
　）　）−ラクチス（１ａｃｔｉｓ　）　、液状製剤、
５０００中性ラクタ一ゼ単位（ＮＬσ）。

結合：担体１０Ｉｉを、酵素１０ｇと一緒に室温（２３
℃）で塩溶液８０．９中で振盪する。塩溶液は燐酸水素
ジカリウム１６％、燐酸二水素カリウム７．９１及び酵
素安定化のためにＭｎ（Ｉ）塩化物・４　Ｈ，Ｏを含有
する。同溶液は３．３°４ｍｏｌ　／　ｌのイオン濃度
を有する。７２時間後に吸引濾過し、洗浄しかつ濾液の
ラクターゼ活性を担体の同活性と比較する。担体に関し
ては使用した活性の５５ｑＩｂが再び検出され、濾液で
は１４チである。

従って活性収率はこの感受性酵素の場合には５５俤で極
めて高い。

応用：結合酵母ラクターゼをカラム反応器に充填する。

温度７℃で脱脂乳（脂肪０．３１　）を２０日間５５Ｘ
固定床容＠／時の流量で導通させる。脱脂乳中に含有し
ているラクトースは初めは６５チがグルコース及びガラ
クトースに加水分解され、２０日後にはなお５０％が加
水分解される。

例　　４ 固定アミノ酸アシラーゼ 担体二遊離エポキシ基（オキシラン酸素１．２％）及び
孔内面に集中している付着イソプロペニル基２．２俤を
有するメタクリルアミド／メチレン−ビス−メタクリル
アミドをペースとするパール状の高架橋巨大多孔質重合
体。孔容積＝３．４１Ｌｌ／＃、平均孔径＝２Ｑｎｍ０
この担体の製造は西独国特許出願公開第２７２２７５１
号の例２に記載されている。

酵素ニアスペルヤルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）菌
株からの粉末状アミノ酸アシラーゼ１１ｇｌＩＩｉＩ物
。活性：２３，０ＯＯＵ／、ｌｉ＋、基質＝アセチル−
Ｄ、Ｌ−メチオニン。

結合：担体１０ｇを酵素製剤２０．９と一緒に３５℃で
塩溶液ｓＱｍｊ中で振盪する。塩溶液は硫酸ナトリウム
１４．２１及びコバルト（■）塩化物−６’Ｈ，０２４
Ｉ）Ｉ）ｍを含有しており、−＝７０に調整しである。

同溶液のイオン濃度は、酵素製剤の塩分を考慮すること
なく　３　ｍｏｌ　／　ｌである。

８時間後に担体を吸引し、洗浄する。担体に関しては使
用された活性の６１％が検出され、濾液の場合にはｉｎ
である。従って６１チの活性収率が得られた。

例　　５ 主 表１による湿潤担体物質それぞれ３．５ｙを、その都度
脱塩水の５倍量で５回洗浄しかつガラス７リツトで吸引
する。次に担体物質を、Ｋ−燐酸塩緩衝液（Ｐ’　７．
５　、ＮａＮ３０−１　’１６を含む）０．５Ｍ中の１
．　ａｏｌｉ源ペニシリンアミダーゼ６７６国際単位（
工ｎｔｅｒｎａｔ、　Ｕｎｉｔａ　）を含有する酵素溶
液６．８−と−緒に約２１℃で２時間振盪する。緩衝液
のイオン濃度は１．５ｍｏｌ／ノである。イオン交換樹
脂〔アンバーリット（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　Ａ　２１　
）　）を介して安定化された２５％グルタルジアルデヒ
ド水性溶液０．１３６ｄを加えた後さらに２時間振盪す
る。次に負荷された担体物質を水と一緒にガラス７リツ
ト上にもたらし、１ＭＮａ０Ｔ（で３回１．０．０５Ｍ
Ｎａ−燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，５、ＮａＮ３０−Ｉ　Ｔ
ｏを含む）で２回洗浄する。

酵素活性を、基質としてのペニシリン−〇Ｋ（粗製）に
対してｐＨ７，５でアルカリ滴定法によって測定した。

このためにその都度０．０５　ＭｏＮａ−燐酸塩溶ａ（
ｐ）１７．５）中の２１基質溶液２０ｄを使用しかつ３
７℃で０゜５Ｍ苛性ソーダ溶液で自動的に滴定した。・
結果は表１に記載しである。

表　　１ 担体物質　　　　　　固定ＰＣ−アミダーゼＯ活曲ａ）
架橋アガローズ〔セファローズ （Ａｇａｒｏｓｅ）　　　　（日５ｐｈａｒｏａｅ）　
　　　　９６　　　　　　　５８−ＯＬ−４Ｂ”〕 ｄ）架橋アガローズ、　（ＤＩＣＡＪ−セηｔ−ズ（陽
イオン性） ｅ）　吟メプ鳴イヒ　　（０Ｍ＋７７１：ｌ−ｆ架橋ア
ガローズ　ｃｈ−６Ｂ”）　　　　　９４　　　　４８
（陰イオン性） ｆ）７ユノ契伸螺　　　　　　　　　７７５９ベンジル
メルカプタンと反ゴロ 担体物質　　　　　　　固定ＰＣ−アミダーゼり古注ｈ
）ボリメタク填ルイミド　〔ローハセル（Ｒｏｈａｃｅ
ｎ）発泡物質、粉砕　ＷＦ、レーム（Ｒｏｅｈｍ）　　
　７０　　　　　４５ｍＨ） １）架橋ポリメチルメタクリレートー クーリ；−Ａεとメタクリレート共ｆｉ　　　　　　　
　　　　　　　　３５　　　　　　　　　２５合体”す
ｆｆ１ｆ比９０　：　Ｉ　Ｄ ｊ）架橋ポリメチ外メタクリレートー ク１コー、ルジ°メタクリレート共Ｘ　　　　　　　　
　　　５５　　　　　　　３７合体０之重量比８０：２
０ ｋ）架橋ポリスプリにメタクリレ−トーク１コーＡジメ
タクリレート共１１　　　　　　　　　　　４５　　　
　　　　３５合ｒす、貞を比６０：４０ １）架橋ポリスチロール、 ジビニルペンゾール　　　　　　　　　５７４２１０％
を用いる０） ｍ）多孔質ガラス　　　コント庫ド・ボア・クラス内部
表面積１０７虚２力 畳）スウェーデン国つプサラ（［ｒｐｐｅａｌａ　）在
ファルマキア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　Ａ　Ｂの登録
商標。

脣憂）製造方法：攪拌かまで水３２０重量部中のポリビ
ニルアルコール１重量部の溶液を５０℃に加熱し、その
中でモノマー（メチレンメタクリレート＋グリコールジ
メタクリレート又ハスチロール＋ジビニルペンゾール）
１００１Ｌ量部、ｆｉ−ヘプタン６０量部、ジベンゾイ
ルペルオキシド１．４重部から成る混合物を攪拌下に滴
状に分配する。

４時間の重合後に温度を冷却によって最高７５℃に保つ
。次に６６℃で１時間で溶剤を留去する。冷却後に生じ
たパール状重合体を濾取する。

例　　６ 例１と同様にしてフェニルセファローズ３．５１（湿潤
重量ンを前処理する。次に０．５Ｍ燐酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７−５、ＮａＮ３　０．　１を含む）６．８ａ中
に溶したトリジシン１５０ダを加え、２３℃で２時間振
盪する。イオン濃度は１．５ｍｏｂ　／　ｌｌである。

吸着酵素の固定及び後処理は例１と同様に行う。

酵素活性を基質としてのカゼイン及びＮ−ベンゾイル−
１−アルギニンエチルエステル−ヒドロキシド（ＢＡＢ
Ｋ　）に対して測定した。

結果：カゼインの場合　８．６σ／Ｉ湿潤重量ＢＡＸＥ
の場合　３１１　　σ／Ｉ湿潤重量例　　７ ３０．０００　Ｕ／１１を有するアスペルイルス・オリ
デエ（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　）　（
商品名１ラクターゼ−プレパラ−）　（Ｌａｃｔａａｅ
　−Ｐｒｅｐａｒａｔ　）　’ｌ　’１１４　　ＣＫｏ
ｎｇ、　”、レームＧｍｂＨ製）ＩＪｉその都度、イオ
ン濃度２．１ｍ″ｏ１　／　ｌｌの０．７　Ｍ　Ｎａ２
８０４溶液（ＦＪ（５，５）４０ゴ中に溶かし、その都
度この溶液に表２に記載した担体樹脂１０Ｉを加え、室
温で２０時間振盪する。次に２５チグルタルジアルデヒ
ド水性溶液０．８４を加え、室温で２時間振盪する。製
剤を濾取して、洗浄しかつ固定した酵素及び濾液中に残
存している酵素の活性を測定しかつ使用した活性に対す
るパーセントで表わす。結果は表２に示す。

表　　２ ａ）スチロ→砂♂ル鍔ル　〔アンバーライドン交換体 ｂ）ポリアクリル酸を　（アンパーライトヘーストする
巨大　　ＸＡＤ７”）　　　　　２９．５　　　　　１
８剣Ｕ峨着樹脂 Ｃ）巨大多孔質フェノ　〔ドウオライド弱塩基性 ｄ）巨大多孔質フェノ　（ドウオライド弱塩基性 活性収率　　　残余活性 チ　　　　　チ θ）ｍフェノ・（ドウオライド 非イオン性 ｆ）巨メｊ号Ｕにがラス　（コントロルド・ｈ）ヒドロ
キシルアパタイト （塩基性−襄カルシウム）、−１６，５４粉砕 １）　　米１ｍフィラデルフィア在し−ム＆ハース（Ｒ
ｏｅｈｍ　＆　Ｈａａａ）　Ｃｏの登録商標２）ドウオ
ライド・インターナショナルＧｍｂＨの登録商標

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水に不溶の巨大多孔質固体担体に電解質の存在で溶
   解タンパク質を固定するに当り、少なくとも０．１５ｍ
   ｏｌ／ｌの電解質イオン濃度を有するタンパク質の水性
   溶液を、同水性溶液によつて接触される担体上に、担体
   に対するタンパク質の吸着が行われてしまうまで作用さ
   せることを特徴とする溶解タンパク質の固定方法。 ２、タンパク質吸着の前、間又は後に、担体に吸着され
   たタンパク質を架橋させる水溶性結合成分を、電解質含
   有浴液に加える特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、共有結合された陽イオン基を有しないか又は０．１
   ｍ当量／ｇ未満の同基を有する担体を使用する特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、乾燥分１ｇ当りせいぜい５ｍ当量の共有結合された
   陰イオン基を有する担体を使用する特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５、乾燥分１ｇ当りせいぜい０．１ｍ当量の共有結合さ
   れた陰イオン基を有する担体を使用する特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６、水性媒体中でせいぜい２倍の体積に膨潤する担体を
   使用する特許請求の範囲第１項から第４項までのいづれ
   か１項記載の方法。 ７、担体を小粒子の形で、特にパール状で使用する特許
   請求の範囲第６項記載の方法。