PL170490B1

PL170490B1 - Sposób wytwarzania optycznie czynnych (S)-cyjanohydryn PL

Info

Publication number: PL170490B1
Application number: PL92300043A
Authority: PL
Inventors: Stephen W Andruski; Bruce Goldberg
Original assignee: Fmc Corp
Priority date: 1991-12-17
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 1996-12-31
Also published as: CA2093826A1; FI931583A0; DE69208878D1; ATE135047T1; CA2093826C; EP0590096B1; BG61277B1; AU647982B2; RU2092558C1; EP0590096A4; WO1993012072A1; US5177242A; SK36293A3; EP0590096A1; HU9301020D0; MX9206954A; BR9205413A; FI931583L; AU3141493A; DE590096T1

Abstract

1. Sposób wytwarzania optycznie czynnych (S)-cyjanohydryn w reakcji aldehydu z kwasem cyjanowodorowym w wyniku kontaktowania kwasu i aldehydu z enzymem S-oksynitrylaza, znamienny tym, ze enzym jest chemicznie zwiazany z nierozpuszczal- nym kompozytem stanowiacym porow ata m embrane, przez która przepuszcza sie re- agenty, przy czym porow ata m em brana zawiera polimerowe spoiwo zywiczne, w którym rozproszone sa silnie rozdrobnione czastki wypelniacza, oraz siec zasadniczo wzajemnie polaczonych wytworzonych w niej porów, a porowata m em brana umozliwia przeplyw plynu zawierajacego reagenty. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cyjanohydryn. W szczególności wynalazek dotyczy ulepszonego sposobu wytwarzania optycznie czynnych (S)-cyjanohydryn przydatnych jako półprodukty do wytwarzania znanych piretroidowych środków

170 490 owadobójczych, polegającego na reakcji aldehydów z cyjanowodorem w obecności enzymu, S-oksynitrylazy.

Sposób reakcji aldehydów z cyjanowodorem w obecności enzymu, oksynitrylazy, i eteru diizopropylowego jako rozpuszczalnika prowadzącej do wytwarzania optycznie czynnych cyjanohydryn jest znany np. z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 859 784, (Effenberger i inni), który wprowadza się tu jako źródło literaturowe. Jak to ujawniono w tym opisie, reakcję prowadzi się z udziałem enzymu w postaci unieruchomionej, np. związanego z powierzchnią kulek szklanych, żywic jonitowych lub cząstek celulozy, w postaci zawiesiny, którą należy odsączyć od roztworu zanim można będzie wydzielić produkt. Jakkolowiek sposób ten spełnia zamierzone cele, to charakteryzuje się jedynie jednokrotnym przejściem reagentów przez unieruchomiony enzym, przy czym przejście to trwa 5-6 dni. Również w zgłoszeniu patentowym australijskim nr 38104/89 (Kula i inni), ujawniono podobny sposób, w którym stosuje się enzym, S-oksynitrylazę, pochodzący z określonego źródła (Sorghum bicolor). W procesie tym w jednym z rozwiązań do unieruchamiania enzymu stosuje się perełki akrylowe, w szczególności Eupergtt® (Rohm, Darmstadt), dostępne w handlu perełki akrylowe, które zawiesza się w ośrodku reakcji lub w kolumnie. W każdym przypadku muszą być one stosowane tylko w ośrodku wodnym, aby zapobiec atakowaniu perełek akrylowych przez różne rozpuszczalniki organiczne. Ponadto w tym ostatnim procesie przy wykorzystaniu związanych enzymów uzyskuje się wydajność około 85% wagowych, ale jedynie po trzydniowym procesie prowadzonym w sposób ciągły przy zastosowaniu jako aldehydu 4-hydroksybenzaldehydu. Patrz również opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 008 192, Neidermeyer; opis patentowy europejski nr 326 063; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 862 030 oraz wyłożenie RFN nr 3 823 864 A-1, wszystkie stanowiące odpowiedniki lub połączenie wyżej wspomnianych opisów patentowych Stanów Zjednoczonych i australijskiego.

W każdym z powyższych opisów patentowych wspomina się o reaktorze przeponowym z enzymem. Jednakże, jak to potwierdza odpowiednia literatura techniczna (patrz np. Engineering Aspects of Enzyme Engineering oraz zamieszczone tam odsyłacze 16 i 17, czyli Kragl i inni, Ann. N. Y. Aca. Sci., 613, 167-175 (1990) oraz Vasic-Racki i inni, Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 215-222 (1989), reaktory takie to nic innego niż szereg pojemników rozdzielonych membranami filtracyjnymi fizycznie nieprzepuszczalnymi dla enzymów. W związku z tym w reaktorze tego typu reakcja przebiega w roztworze zawierającym zdyspergowany enzym, w którym reagenty muszą się w końcu zetknąć w wyniku dyfuzji.

Zastosowanie reaktorów z polimerową membraną do wiązania enzymów jest znane z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 102 746 i 4 169 014, odbywa dla Bruce S. Goldberga. Patrz również referat A Novel Immobilized Enzyme Reactor System, Bruce S. Goldberg, przedstawiony na 27th Annual Spring Symposium Session on Non-Conventional Reactor Systems, AICHE, East Brunswick, N. J., 10 maja 1984, w którym opisano również reaktory membranowe ujawnione w obydwu powyższych opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki. Dwa ostatnie opisy oraz referat na AICHE z 10 maja 1984 wprowadza się tu jako źródła literaturowe.

Według wynalazku czas reakcji można znacznie skrócić, a manipulowanie reagentami w znanym sposobie wytwarzania optycznie czynnych (S)-cyjanohydryn w wyniku reakcji aldehydów z kwasem cyjanowodorowym w obecności katalitycznego enzymu, S-oksynitrylazy i rozpuszczalnika, można znacznie usprawnić w porównaniu z wyżej wspomnianymi sposobami, gdy roztwór aldehydu i kwasu przepuszcza się przez chemicznie aktywowaną porowatą membranę określoną poniżej, z którą enzym S-oksynitrylaza został związany chemicznie.

Należy zaznaczyć, że podczas gdy enancjomeryczne formy (S)- i (R)-cyjanohydryny powstawać będą zazwyczaj w równych ilościach, to znaczy w stosunku 50:50, jeśli nie stosuje się stereoselektywnego katalizatora, to celem wynalazku jest zwiększenie stosunku izomeru (S) do izomeru (R) (S/R) w wyniku odpowiedniego doboru ulepszonego katalizatora i

170 490 warunków reakcji. Celem wynalazku jest nie tylko zwiększenie selektywności izomeru Swzględem R-, ale również uzyskanie wysokiej konwersji produktu oraz jak największe skrócenie czasu reakcji. Jeszcze innym celem wynalazku jest osiągnięcie powyższych celów bez fizycznego oddzielania enzymu od produktu finalnego.

Według wynalazku sposób wytwarzania pożądanych optycznie czynnych cyjanohydryn łatwo realizuje się, jak to opisano powyżej, przepuszczając roztwór aldehydu i kwasu cyjanowodorowego przez określoną porowatą membranę, z którą enzym został związany chemicznie, w sposób periodyczny lub ciągły, przez ustalony okres, oraz oddzielając pożądaną optycznie czynną cyjanohydrynę. Nieoczekiwanie stwierdzono, że postępując w taki sposób reakcję można skrócić nawet do jednego dnia, w przeciwieństwie do znanych sposobów, w których trwała ona 6 lub 7 dni, przy równoczesnym zachowaniu, a w pewnych przypadkach przy zwiększeniu ogólnej wydajności produktu oraz selektywności względem pożądanego izomeru S, w porównaniu ze znanymi sposobami. W efekcie, co jest zrozumiałe, jeszcze korzystniej wydajność uzyskiwaną sposobem według wynalazku można odpowiednio zwiększyć, jeśli będzie się ją porównywać ze znanymi sposobami, w których reakcję prowadzi się np. przez 6-7 dni.

Korzystnie reakcję powinno prowadzić się w układzie organicznym, w którym rozpuszcza się zasadniczo nierozpuszczalny w wodzie aldehyd oraz wytworzoną cyjanohydrynę. Jakkolwiek można stosować niewielkie ilości wodnego buforu, np. w ilości do około 1% wagowych wody w stosunku do całkowitej wagi układu, to korzystnie należy stosować jak najmniej wody, to znaczy < około 0,03%. W związku z tym sposób według wynalazku dotyczy zasadniczo układu zawierającego rozpuszczalnik organiczny (ewentualnie zawierający wodny bufor), reagenty w postaci aldehydu i kwasu oraz enzym chemicznie związany z określoną porowatą membraną, w sposób szczegółowo opisany poniżej.

Reakcję prowadzić można w szerokim zakresie temperatur i pH, gdyż parametry te nie mają decydującego znaczenia. Dopuszczalne są np. temperatury w zakresie od około -6 do około +30°C, korzystnie od około +6 do +25°C. pH, choć nie ma decydującego znaczenia, regulować można za pomocą takich układów buforowych jak octan sodowy, cytrynian sodowy lub fosforan sodowy, przy czym pH może wynosić około 3,5 - 7,5.

Stosować można powszechnie wykorzystywane aldehydy, np. ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 859 784 (patrz wyżej), przy czym opis ten wprowadza się tu jako źródło literaturowe. Należą do nich ujawnione w tym opisie aldehydy o wzorze:

II

II p

w którym R oznacza nasyco < yconą grupę alifatyczną lub aromatyczną, która może być podstawił “g __r_______awierającymi atomy chlorowca, siarki, azotu lub tlenu.

Wybrane do stosowania aldehydy korzystnie powinny być zasadniczo nierozpuszczalne w wodzie, tak że powinny one być wybiórczo rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych według wynalazku. I tak korzystne są aldehydy, których rozpuszczalność w wodzie wynosi poniżej około 2,0-0,01 mg/ml, a najkorzystniejsze są te, których rozpuszczalność w wodzie wynosi poniżej 0,1 mg/ml, aż do 0,01 mg/ml. Przykładowo do takich nierozpuszczalnych w wodzie aldehydów należą związki o wzorze:

170 490 w którym A oznacza atom wodoru lub fluoru, a B oznacza atom wodoru, fluoru, chloru lub bromu. Ze związków tych korzystny jest 3-fenoksybenzaldehyd.

Stosunek molowy aldehydu do cyjanowodoru wynosi korzystnie od około 1:1 do 1:100, a jeszcze korzystniej od około 1:1 do około 1:2.

Stosowany rozpuszczalnik organiczny można łatwo wybrać spośród związków, które nie oddziaływują niekorzystnie na stosowaną membranę lub przebieg reakcji. Tak np. stwierdzono, że korzystne jest stosowanie eteru di-n-butylowego, podczas gdy eter diizopropylowy stosowany w procesie według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 859 784 (patrz wyżej) nieoczekiwanie powoduje, że proces prowadzony sposobem według wynalazku nie przebiega prawidłowo.

Katalizator w postaci enzymu, S-oksynitrylazy (EC 4.1.2.11) jest dostępny w handlu z Sigma Chemical Co., albo można go wydzielić z pędów sorgo w znany sposób (patrz Bove i inni, J. Biol. Chem., 226 (1), 207 (1961)). Enzym stosuje się korzystnie w ilości około 50-2500 jednostek/g aldehydu, a jeszcze korzystniej około 500-750 jednostek/g aldehydu. Enzym można dogodnie związać chemicznie z porowatą membraną opisaną poniżej poddając membranę obróbce np. 5% wagowych wodnym roztworem polietylenoiminy, następnie np. 5% wagowych wodnym roztworem aldehydu glutarowego, a na koniec roztworem enzymu, S-oksynitrylazy w odpowiednim buforze.

Dogodnie enzym pozostaje związany z membraną przez szereg dni, co zapewnia nie tylko bardziej stabilne i trwalsze połączenie niż w znanych metodach, ale ponadto unika się konieczności wprowadzenia dodatkowego etapu oddzielania i usuwania enzymu z zawiesiny, jak to ma miejsce w procesach według opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 859 784 i 5 008 192.

Stosowane porowate membrany opisane są dokładnie w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 102 746 (patrz wyżej), w którym określono materiały wiążące enzymy, ich charakter i sposób wytwarzania, a także łączenie i oddzielanie enzymów z szeregu takich materiałów. Zasadniczo membrany i/lub warstwy o określonej grubości wykonane są z nierozpuszczalnego, trójwymiarowego polimerowego spoiwa żywicznego, w którym rozproszone są drobne cząstki wypełniacza i które zawiera sieć zasadniczo wzajemnie połączonych porów, przy czym wielkość tych porów może zmieniać się w szerokich granicach, najkorzystniej w zakresie od około 0,01 do około 100 μ, a całkowita porowatość materiału wynosi około 50-75%, przy czym zawartość rozproszonych cząstek wypełniacza stanowi co najmniej około 25% wagowych całkowitej wagi kompozycji.

Jedną z takich membran jest membrana MPS® (FMC Corporation, Philadelphia, Pa., USA), w postaci mikroporowatego arkusza z polichlorku winylu) z krzemionką, o objętości porów w zakresie 70-80%. Wielkość porów określona metodą intruzyjnej porozymetrii rtęciowej wynosi zazwyczaj 0,2 - 2,0 μm. Jest to wyjątkowo hydrofilowy nośnik o ładunku ujemnym, który można zmienić na ładunek dodatni, przy czym powierzchnia właściwa membrany wynosi około 80 m²/g. Ponadto materiał ten nie jest ściśliwy w normalnych warunkach, a jego gęstość w stanie suchym jest niska i wynosi około 0,45 g/cm3. Centra aktywne znajdujące się na krzemionce zawartej w porowatej matrycy umożliwiają wprowadzenie organicznych grup funkcyjnych poprzez chemiczne wiązanie z krzemionką. Zdolność membrany MPS do wiązania DNA wynosi co najmniej około 260μ g/cm2. Ponadto stwierdzono, że membrana taka, jak również inne odpowiednie membrany, które można zastosować, mimo iż zazwyczaj stosowane są w środowisku wodnym, są nieoczekiwanie trwałe w warunkach procesu według wynalazku z udziałem rozpuszczalnika organicznego.

Jakkolwiek zastosować można różne polimery jako spoiwo czyli matrycę membrany, to korzystnie są to termoplastyczne, dostępne w handlu żywice, spośród których do korzystnych należy poli(chlorek winylu) (PVC). Można jednak stosować również takie materiały jak polietylen wypełniony krzemionką, albo też kopolimery PVC z niewielkimi ilościami monoetylenowych monomerów takich jak octan winylu, chlorek winylidenu, propylen itp. Matrycę można także wykonać z takich materiałów jak politetrafluoroetylen (PTFE), octan lub trioctan celulozy, poliamidy (takie jak nylon) itp. Jeśli stosuje się PTFE, to może być on

170 490 w postaci matrycy włókienkowej (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 152 661 i 4 37 3 519), do której wprowadzono hydrofilowe absorpcyjne cząstki. Tak więc zastosować można dowolną żywicę termoplastyczną, która jest łatwo plastyfikowana przez rozpuszczalnik, która ulega spiekaniu pod wpływem ciepła i ciśnienia, albo którą można łatwo wykonać wychodząc z przepuszczalnej matrycy, oraz która jest chemicznie i fizycznie stabilna w warunkach procesu według wynalazku.

Do wypełniaczy, korzystnie w postaci cząstek, należeć mogą zarówno materiały nieorganiczne takie jak wyżej wspomniane związki krzemionkowe lub np. związki glinu takie jak tlenek lub wodorotlenek glinu, oraz wypełniacze organiczne takie jak wielocukry, w tym aktywowane pochodne celulozy. (Z drugiej strony stwierdzono, że nieaktywowana celuloza nie działa skutecznie w kombinacji z PVC).

Wytworzoną membranę można aktywować poddając ją w znany sposób obróbce, tak aby uzyskać środek tworzący połączenie chemiczne membrany z enzymem, czyli między cząstkami wypełniacza i enzymem. Wiązanie takie zachodzić może na drodze chemisorpcji, wiązania kowalencyjnego lub reakcji sieciowania między związkiem pośrednim i enzymem. Do wiążących grup funkcyjnych, które można wprowadzić do memebrany, należą wolne grupy aminowe, a także grupy karboksylowe, izonitrylowe, aldehydowe lub ketonowe, które będą wiązać enzym S-oksynitrylazę z wypełniaczem membrany. Spośród takich środków do korzystnych należy polietylenoimina (PEI), która może ulec chemisorpcji na wypełniaczu, np. w kombinacji z aldehydem glutarowym, z którym wiąże się następnie enzym.

Jak to ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 102 746 (patrz wyżej), membranę stosowaną w procesie według wynalazku można łatwo wytworzyć w wyniku zmieszania odpowiednich ilości silnie rozdrobnionej żywicy polimerowej, silnie rozdrobnionego wypełniacza nieorganicznego, rozpuszczalnika (np. cykloheksanonu) i nierozpuszczalnika (np. wody) w warunkach nieznacznego ścinania, uzyskując stabilny, wilgotny, sypki proszek. Mieszankę proszkową można następnie wytłoczyć lub poddać kalandrowaniu uzyskując korzystnie zasadniczo płaską strukturę lub arkusz o wymaganych wymiarach, który z kolei można przepuścić przez kąpiel wodną w celu wyługowania rozpuszczalnika, a następnie przepuścić przez suszarkę z ogrzanym powietrzem w celu usunięcia wody. Według wynalazku uzyskany wyrób w postaci mikroporowatej, półsztywnej, nierozpuszczalnej, przepuszczającej płyn membrany o stabilnych wymiarach można następnie poddać obróbce w taki sposób, aby doprowadzić do sprzęgnięcia lub związania z nią enzymu.

Zgodnie z jednym z korzystnych wariantów wyjściową, nieaktywowaną chemicznie membranę wytworzyć można w następujący sposób: arkusz porowatego materiału wytwarza się mieszając najpierw na sucho 20,0 funtów (9,07 kg) żywicy poli(chlorowinylowej) Conoco® 5385 wpostaci cząstek przechodzących przez sito 180μ m (80 mesh) i 40,0 funtów (18,14 kg) Hi Sil® 233, strącanej uwodnionej krzemionki, w mieszarce do cieczy i ciał stałych o małym ścinaniu Patterson Kelley, przez 3 minuty. Następnie kontynuując mieszanie wprowadza się za pomocą pompy 54,6 funta (24,8 kg) rozpuszczalnika (cykloheksanonu) w ciągu 20 minut. W ciągu kolejnych 20 minut do mieszanki w mieszarce dodaje się 59,0 funtów (26,8 kg) wody, uzyskując wilgotny, stabilny, sypki proszek. Proszek wprowadza się następnie do wytłaczarki ślimakowej o temperaturze cylindra około 120°F (48,9°C), a wytłoczony materiał przepuszcza się między walcami kalandra uzyskując zasadniczo płaski arkusz o grubości 0,02 cala (0,5 mm). Arkusz przepuszcza się przez wannę ekstrakcyjną z wodą o temperaturze 170°F (76,7°C) i suszy się w suszarce z gorącym powietrzem w temperaturze 225°F (107,2°C) przez 6 minut. Gotowy porowaty arkusz zawiera pory o względnie szerokim rozrzucie wielkości w zakresie od około 0,01 μ do około 100 μ, przy przeciętnej średnicy porów, wyznaczonej metodą intruzji rtęci, w zakresie od około 0,15 do około 0,25 μ. Całkowita porowatość materiału wynosi około 65% objęt., a zawartość zdyspergowanego wypełniacza (np. krzemionki) wynosi około 56% wagowych. Rutynowa próba wykazuje, że woda będzie szybko wsiąkać w materiał bez jakiegokolwiek nacisku, co świadczy o tym, że mikropory są zasadniczo wzajemnie połączone w całej objętości między obydwoma powierzchniami.

170 490

Uzyskaną w ten sposób membranę w razie potrzeby można zmodyfikować chemicznie, aby dokładniej związać S-oksynitrylazę, w następujący sposób: membranę nie poddaną obróbce moczy się przez 1 godzinę w 5% wag./objęt. wodnym roztworze polietylenoiminy (PEI) o rozgałęzionych łańcuchach, o ciężarze cząsteczkowym 50 000, w temperaturze pokojowej. Nośnik po obróbce przemywa się wodą i IN NaCl w celu usunięcia niezaadsorbowanej PEI. Przeprowadzić można próbę z kwasem trinitrobenzenosulfonowym. Na powierzchni elementu nośnego poddanego obróbce obserwuje się intensywne pomarańczowe zabarwienie pochodnej trinitrofenyloaminowej, co wykazuje obecność znacznej ilości alifatycznych grup aminowych. Zawartość azotu w elemencie nośnym po obróbce ocenia się ilościowo na podstawie analizy elementarnej stwierdzając np. zawartość azotu 1,25% w stosunku do suchej wagi w porównaniu z 0,02% w przypadku elementu nośnego nie poddanego obróbce. Chemisorpcja PEI na elemencie nośnym poddanym obróbce jest zasadniczo nieodwracalna, gdyż nie można jej zlikwidować w wyniku moczenia w roztworach o wysokiej sile jonowej (np. w 1M NaCl lub 1M K2HPO4/KH2PO4) przy pH w zakresie 3-9. Tylko w silnie kwaśnych warunkach (przy moczeniu w 1M HCl przez 2 godziny) może wystąpić częściowa desorpcja odpowiadająca 50% zawartości azotu, na co wskazują wyniki analizy elementarnej. Powierzchnia właściwa nośnika po obróbce określana standardową metodą BET wynosi 55,4 m2/g w porównaniu z 81,1 m2/g w przypadku próbki kontrolnej. Element nośny po obróbce PEI wykazuje identyczną charakterystykę przepływu jak element nośny nie poddany obróbce, niezależnie od stosowanego buforu lub jego siły jonowej.

Z kolei enzym wiąże się z membraną, która została chemicznie uaktywniona, najpierw za pomocą PEI, w sposób opisany powyżej, a następnie poprzez grupę łączącą, np. pochodzącą od aldehydu glutarowego, z którym ostatecznie wiąże się enzym. Kontakt reagentów z enzymem zapewnić można wtedy, gdy przepływają one przez pory membrany. Przepływ środowiska reakcji korzystnie reguluje się utrzymując membranę lub warstwy membran w obudowie lub w uchwycie przytrzymującym krawędzie membrany tak, że powstaje element reaktora, przy czym przez krawędzie te przepływ nie zachodzi. W razie potrzeby zainstalować można otwory wlotowe i wylotowe sięgające do powierzchni membrany, kierujące i tłoczące reagenty przez pory w rdzeniu reaktora w kontakcie z enzymem. Do typowych reaktorów tego typu w formie dysków należy ACTI-DISC® i ACTI-MOD® (FMC Corporation, Philadelphia, PA, USA). W szczególności ostatni z dysków zawiera szereg warstw membran, aby ułatwić pełniejszy odzysk produktu. W związku z tym należy zdawać sobie sprawę, że w opisie określenie 'membrana obejmuje układ zawierający jedną łub więcej warstw membran, z tym że ostateczną wymaganą grubość można łatwo ustalić na podstawie badań rutynowych. W przykładach stosowana matryca ACTI-DISC® zawierała od 1 do około 5 warstw membran, przy czym w przykładach II, III,VI, i VII zastosowano jedną membranę, a w przykładach I, IV, i V zastosowano pięć membran.

Pożądany produkt reakcji w postaci cyjanohydryny można następnie oddzielić usuwając kwas cyjanowodorowy i rozpuszczalnik na drodze destylacji.

Poniższe przykłady dokładniej ilustrują wynalazek. Użyte sita odpowiadają wymaganiom ASTM El 1-87.

Przykład I. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3-fenoksybenzaldehydu w eterze di-n-butylowym w temperaturze otoczenia

Etap A. Unieruchamianie enzymu S-oksynitrylazy na porowatej matrycy

Matrycę nośną ACTI-DISC® zawierającą membranę z poli(chlorku winylu) i krzemionki (arkusze MPS®, FMC Corp., Philad., PA) zainstalowano w standardowym reaktorze obiegowym. Reaktor stanowiła pompa do dozowania płynu, zdolna do pompowania z szybkością do 10 ml/minutę, połączona na wylocie przezroczystym, elastycznym wężem plastikowym z otworem wlotowym matrycy nośnej ACTI-DISC®, która z kolei połączona była od strony wylotu ze zbiornikiem o pojemności 100 ml. Zbiornik połączono przewodem z wlotem pompy. Matryca nośna ACTI-DISC (Biosupport Materials, Chemical Products Group, FMC Corporation, Philadelphia, PA) zawierała plastikową obudowę o

170 490 średnicy 63,5 mm i grubości 6,4 mm, z otworem wlotowym na jednej z płaskich powierzchni oraz otworem wylotowym na drugiej płaskiej powierzchni. W plastikowej obudowie znajdowało się 5 warstw porowatej membrany przepuszczającej ciecze, zawierającej hydrofobową matrycę polimerową z poli(chlorku winylu), silnie rozdrobniony hydrofilowy wypełniacz krzemionkowy rozproszony w matrycy żywicznej oraz sieć wzajemnie połączonych mikroporów utworzonych w całym materiale.

W zbiorniku umieszczono 25 ml 5% wag./objęt. wodnego roztworu aldehydu glutarowego w celu związania końca N enzymu z matrycą ACTI-DISC zmodyfikowaną za pomocą PEI, pompując go następnie przez matrycę nośną ACTI-DISC z szybkością 8 ml/minutę przez 60 minut. Roztwór zastąpiono 50 ml wody, którą pompowano przez matrycę nośną ACTI-DISC przez 30 minut. Następnie wodę wylano ze zbiornika.

ml wodnego roztworu enzymu S-oksynitrylazy, uzyskanej z 7-dniowych etiolizowanych odrostów hybrydy sorgo/trawa sudańska (analiza białka: 5,4 mg białka.ml; analiza aktywności enzymatycznej: 10,7 jednostek/mg białka) rozcieńczono do 100 ml 0,05M buforem z octanu sodowego (pH=5,4) i roztwór umieszczono w zbiorniku. Roztwór pompowano przez matrycę nośną ACTI-DISC przez 30 minut. Po tym czasie kierunek przepływu w reaktorze obiegowym przez matrycę nośną ACTI-DISC odwrócono, aby zapewnić pełne i równomierne obciążenie enzymem. Pompowanie roztworu enzymu kontynuowano przez kolejne 30 minut. Następnie matrycę nośną ACTI-DISC przemywano 50 ml wody w ciągu 30 minut, w sposób opisany powyżej. Po przemyciu obudowę zawierającą matrycę nośną ACTI-DISC z unieruchomionym enzymem S-oksynitrylazą wyjęto z reaktora obiegowego i przechowywano w lodówce przed wykorzystaniem.

Etap B. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3fenoksybenzaldehydu w eterze di-n-butylowym w temperaturze otoczenia

Matrycę nośną ACTI-DISC z etapu A, zawierającą unieruchomiony enzym, wstawiono do standardowego reaktora obiegowego. W układzie zastosowano zbiornik o pojemności 250 ml lub większy. Resztki wody usunięto z matrycy nośnej ACTI-DISC pompując w sposób ciągły niewielką ilość eteru di-n-butylowego przez matrycę nośną ACTI-DISC w ciągu około 30 minut. W typowej kąpieli zbiornik napełniono roztworem zawierającym od 5,1 g (0,026 mola) do 24,8 g (0,125 mola) 3-fenoksybenzałdehydu w 100 ml eteru di-n-butylowego. Do roztworu dodano ze strzykawki 1,1 równoważnika molowego cyjanowodoru. Roztwór wymieszano, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie cyjanowodoru. Rozpoczęto cyrkulację roztworu przez matrycę nośną ACTI-DISC stosując pompowanie z szybkością od 1 ml/minutę do 5 ml/minutę. Okresowo pobierano próbki w celu wykonania analizy w sposób opisany poniżej. Po zakończeniu reakcji (zazwyczaj po około 24 godzinach) mieszaninę reakcyjną wypompowano z reaktora. Matrycę nośną ACTI-DISC przemyto pompując przez nią 25 ml eteru di-n-butylowego. Po przemyciu reaktor był gotowy do wykonania następnej próby.

W przypadku każdej próbki pobranej z mieszaniny reakcyjnej wykonywano dwie analizy. Jedną z analiz wykonywano w celu określenia całkowitej konwersji 3-fenoksybenzaldehydu do (cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu, a drugą analizę wykonywano w celu ustalenia stosunku S/R w wytworzonym produkcie.

W celu określenia konwersji do (cyjjino)(3-f'enoksyfenylo)metanolu 0,1 ml próbki umieszczono we fiolce autopróbnika chromatografu gazowego i rozcieńczono ją około 1 ml chlorku metylenu. Do roztworu dodano około 1 ml N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu. Fiolkę zamknięto i wytrząsano, a następnie odstawiono na 15 minut. Próbkę roztworu wstrzyknięto do odpowiednio zaprogramowanego chromatografu gazowego.

W celu ustalenia stosunku S/R w (cyjano)(3-fenoksyfenyk))metanolu 0,5 ml próbki mieszaniny reakcyjnej umieszczono w 1-drachmowej fiolce. Dodano 3 krople chlorku kwasu Moshera (chlorku kwasu S-(-)-a-metoksy-a-(trifluorometylo)fenylooctowego) i 5 kropli pirydyny. Uzyskaną mieszaninę reakcyjną wymieszano i odstawiono na godzinę do przereagowania. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 1 ml wody i 1 ml octanu etylu. Po wytrząsaniu mieszaniny warstwę octanu etylu oddzielono i wprowadzono do fiolki

170 490 autopróbnika chromatografu gazowego. Próbkę roztworu wstrzyknięto do odpowiednio zaprogramowanego chromatografu gazowego.

Wyniki 7 partii syntezy (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu podano poniżej.

Próba	Aldehyd (mole)	Szybkość pompowania	Czas próby	Konwersja do produktu	Stosunek S/R
1	0,026	1 ml/min	24 godziny	76,3%	91,4/8,6
2	0,026	5 ml/min	23 godziny	91,8%	91,4/8,6
3	0,026	5 ml/min	19 godzin	88,4%	92,4/7,6
4	0,026	5 ml/min	24 godziny	91,2%	93,7/6,3
5	0,125	5 ml/mm	24 godziny	94,0%	91,0/9,0
6	0,125	5 ml/min	24 godziny	90,7%	85,7/14,3
7	0,026	5 ml/min	24 godziny	80,7%	75,5/24,6

Przykład II. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3-fenoksybenzaldehydu w eterze di-n-butylowym w temperaturze 6°C

W tym przykładzie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanol otrzymywano w sposób opisany w przykładzie I. Reaktor obiegowy różnił się tym, że matryca nośna ACTI-DISC zawierała tylko jedną warstwę przepuszczającej płyn mikroporowatej membrany, na której unieruchomiono enzym S-oksynitrylazę. Stosowaną w tym przykładzie matrycę nośną ACTI-DISC zanurzono w łaźni o stałej temperaturze, utrzymywanej na poziomie 6°C. Łącznie wykonano 16 prób. W każdej próbie stosowano 1,0 g (0,005 mola) 3-fenoksybenzaldehydu i 0,4-0,5 ml (nadmiar) cyjanowodoru w 25 ml eteru di-n-butylowego. Utrzymywano szybkość pompowania w zakresie 4-5 ml/minutę. Wyniki 16 prób wytwarzania (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu podano poniżej.

Próba	Czas próby	Konwersja do produktu	Stosunek S/R
8	23 godziny	70,0%	95,0/5,0
9	26 godzin	65,8%	93,2/6,8
10	24 godziny	62,8%	94,0/6,0
11	24 godziny	65,7%	93,0/7,0
12	27 godzin	63,9%	93,0/7,0
13	24 godziny	65,9%	93,4/6,6
14	36 godzin	76,9%	93,0/7,0
15	24 godziny	75,0%	93,5/6,5
16	23 godziny	78,2%	95,0/5,0
17	24 godziny	77,1%	96,0/4,0
18	23 godziny	76,4%	95,0/5,0
19	24 godziny	72,7%	94,5/5,5
20	24 godziny	69,2%	93,0/7,0
21	24 godziny	70,2%	90,0/10,0
22	24 godziny	68,2%	87,0/13,0
23	24 godziny	56,1%	81,0/19,0

Przykład III. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3-fenoksybenzaldehydu w eterze tert-butylo-metylowym w temperaturze otoczenia

W tym przykładzie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanol otrzymywano w sposób opisany w przykładzie I. Reaktor obiegowy różnił się tym, że matryca nośna ACTI-DISC zawierała tylko jedną warstwę przepuszczającej płyn mikroporowatej membrany, na której unieruchomiono enzym S-oksynitrylazę. Łącznie wykonano 3 próby. W każdej próbie stosowano 1,0 g (0,005 mola) 3-fenoksybenzaldehydu i 0,5 ml cyjanowodoru (nadmiar, aby zapewnić pełną konwersję i skompensować ewentualne straty na skutek odparowania).

170 490

Jako rozpuszczalnik w pierwszej próbie zastosowano 50 ml eteru di-n-butylowego, a w dwóch następnych próbach po 50 ml eteru tert-butylo-metylowego. W każdej próbie reakcję prowadzono przez 24 godziny. Wyniki 3 prób wywarzania (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu podano poniżej.

Próba	Rozpuszczalnik	Konwersja do produktu	Stosunek S/R
24	n-Bu2O	95,0%	93,0/7,0
25	tert-BuOMe	74,0%	58,0/42,0
26	tert-BuOMe	88,5%	53,0/47,0

Przykład IV. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3-fenoksybenzaldehydu w acetonitrylu w temperaturze pokojowej

W tym przykładzie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanol otrzymywano w sposób opisany w przykładzie I. Wykonano tylko jedną partię z 25,0 g (0,126 mola) 3-fenoksybenzaldehydu i 6 ml (nadmiar) cyjanowodoru w 100 ml acetonitrylu. Reakcję prowadzono przez 24 godziny przy szybkości pompowania 5 ml/minutę. Konwersja do produktu wyniosła 88,0%, a uzyskany stosunek S/R w produkcie wyniósł 52,0/48,0.

Przykład V. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3-fenoksybenzaldehydu w tetrahydrofuranie w temperaturze pokojowej

W tym przykładzie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanol otrzymywano w sposób opisany w przykładzie I. Wykonano tylko jedną partię z 25,0 g (0,126 mola) 3-fenoksybenzaldehydu i 6 ml (nadmiar) cyjanowodoru w 100 ml tetrahydrofuranu. Reakcję prowadzono przez 24 godziny przy szybkości pompowania 5 ml/minutę. Konwersja do produktu wyniosła 82,0%, a uzyskany stosunek S/R w produkcie wyniósł 48,0/52,0.

Przykład VI. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanolu z 3-fenoksybenzaldehydu w temperaturze pokojowej z zastosowaniem cyjanowodoru jako rozpuszczalnika

W tym przykładzie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanol otrzymywano w sposób opisany w przykładzie I. Reaktor obiegowy różnił się tym, że matryca nośna ACTI-DISC zawierała tylko jedną warstwę przepuszczającej płyn mikroporowatej membrany, na której unieruchomiono enzym S-oksynitrylazę. Wykonano jedną próbę z 1,0 g (0,005 mola) 3-fenoksybenzaldehydu w 20 ml cyjanowodoru. Reakcję prowadzono przez 24 godziny przy szybkości pompowania 5 ml/minutę. Konwersja do produktu wyniosła 96,7%, a uzyskany stosunek S/R w produkcie wyniósł 58,1/41,9.

Przykład VII. Wytwarzanie (S)-(cyjano)(3-fenoksyenylo)metanolu z cyjanowodoru i 3-fenoksybenzaldehydu w eterze diizopropylowym w temperaturze otoczenia

Poniższy przykład wykazuje, że eter diizopropylowy stosowany jako rozpuszczalnik np. w sposobie według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 859 784 (patrz wyżej) nie jest odpowiednim rozpuszczalnikiem w procesie według wynalazku.

W tym przykładzie (S)-(cyjano)(3-fenoksyfenylo)metanol otrzymywano w sposób opisany w przykładzie I. Reaktor obiegowy różnił się tym, że matryca nośna ACTI-DISC zawierała tylko jedną warstwę przepuszczającej płyn mikroporowatej membrany, na której unieruchomiono enzym S-oksynitrylazę. Wykonano dwie próby. W każdej próbie stosowano 2,1 g (0,011 mola) 3-fenoksybenzaldehydu i 0,6 ml (nadmiar) cyjanowodoru. Jako rozpuszczalnik w pierwszej partii zastosowano 50 ml eteru di-n-butylowego, a w drugiej 50 ml eteru diizopropylowego. Przed stosowaniem 500 ml eteru diizopropylowego oczyszczono przepuszczając go przez kolumnę o wymiarach 2,5 cm x 28 cm z obojętnym tlenkiem glinu. Oczyszczony eter diizopropylowy przechowywano przed zastosowaniem w atmosferze azotu. Między próbami reaktor przemyto 75 ml oczyszczonego eteru diizopropylowego. Każdą próbę prowadzono przez 23-24 godziny. Wyniki 2 prób wytwarzania (S)-(cyjano)(3fenoksyfenylo)metanolu podano poniżej.

170 490

Próba	Rozpuszczalnik	Konwersja do produktu	Stosunek S/R
27	n-Bu2O	89,5%	94,0/6,0
28	i-Pi7O	80,0%	66,0/34,0

170 490

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania optycznie czynnych (S)-cyjanohydryn w reakcji aldehydu z kwasem cyjanowodorowym w wyniku kontaktowania kwasu i aldehydu z enzymem S-oksynitrylazą, znamienny tym, że enzym jest chemicznie związany z nierozpuszczalnym kompozytem stanowiącym porowatą membranę, przez którą przepuszcza się reagenty, przy czym porowata membrana zawiera polimerowe spoiwo żywiczne, w którym rozproszone są silnie rozdrobnione cząstki wypełniacza, oraz sieć zasadniczo wzajemnie połączonych wytworzonych w niej porów, a porowata membrana umożliwia przepływ płynu zawierającego reagenty.
2. Sposób według zastrz. 1, w odniesieniu do wytwarzania optycznie czynnych (S)-cyjanohydryn w reakcji aldehydu z kwasem cyjanowodorowym w wyniku kontaktowania kwasu i aldehydu z enzymem S-oksynitrylazą, znamienny tym, że enzym jest chemicznie związany z nierozpuszczalnym kompozytem stanowiącym porowatą membranę lub warstwy membran o określonej grubości, zawierające parę przeciwległych powierzchni, przez które przepuszcza się reagenty, przy czym porowata membrana zawiera polimerowe spoiwo żywiczne, w którym rozproszone są silnie rozdrobnione cząstki wypełniacza, oraz sieć zasadniczo wzajemnie połączonych wytworzonych w niej porów, a pory utworzone są w żywicznym spoiwie między cząstkami wypełniacza i spoiwem żywicznym oraz między sąsiednimi cząstkami wypełniacza, z tym, że zawartość rozproszonych cząstek wypełniacza w porowatej membranie wynosi co najmniej około 25% wagowych, rozrzut wielkości porów oznaczany porozymetrycznie metodą intruzji rtęci zmienia się nierównomiernie na każdej z powierzchni i przekroju o ustalonej grubości w zakresie od 0,01 do 10Q«, a porowata membrana umożliwia przepływ płynu przez co najmniej jedną z powierzchni.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w skład membrany wchodzi spoiwo z poli(chlorku winylu) oraz wypełniacz krzemionkowy.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że krawędzie membrany znajdują się w obudowie, która uniemożliwia przepływ cieczy przez te krawędzie.
5. Sposób według zastrz.4, znamienny tym, że obudowa jest zmodyfikowana w taki sposób, że zawiera otwór wlotowy sięgający do jednej powierzchni membrany oraz otwór wylotowy sięgający do przeciwnej powierzchni membrany.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że membrana jest chemicznie aktywowana środkiem wiążącym enzym.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że enzym jest kowalencyjnie związany lub usieciowany ze środkiem wiążącym.
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że membrana jest chemicznie aktywowana polietylenoiminą i aldehydem glutarowym.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że rozpuszczalność aldehydu w wodzie wynosi poniżej około 2,0 mg/ml.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako aldehyd stosuje się 3-fenoksybenzaldehyd.
11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że rozpuszczalnik organiczny stanowi eter di-n-butylowy.