DE69208878T2

DE69208878T2 - Verfahren zur herstellung optisch aktiver cyanhydrine durch enzyme

Info

Publication number: DE69208878T2
Application number: DE69208878T
Authority: DE
Inventors: Stephen Andruski; Bruce Goldberg
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1991-12-17
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2012-11-14
Also published as: RU2092558C1; DE590096T1; ATE135047T1; JPH06506674A; EP0590096B1; JPH05507736A; RO112765B1; FI931583A; HUT71308A; BG97619A; EP0590096A1; PL170490B1; AU647982B2; BR9205413A; CZ65193A3; CN1075166A; WO1993012072A1; FI931583A0; KR970009155B1; MX9206954A

Description

Die vorliegende Erfindung betriffi ein Verfahren zur Herstellung von Cyanhydrinen. Insbesondere betrifft sie ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven (S)- Cyanhydrinen, die als Zwischenprodukte bei der Herstellung bekannter Insektizide, die Pyrethrum ähnlich sind, umfassend Umsetzen von Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure in Gegenwart des Enzyms (S)-Oxynitrilase, nützlich sind.
Das Verfahren zum Umsetzen von Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure in Gegenwart des Enzyms Oxynitrilase und des Lösungsmittels Diisopropylether zur Erzeugung optisch aktiver Cyanhydrine ist bekannt, beispielsweise aus dem US-Patent 4 859 784 von Effenberger et al. Wie dieses Dokument lehrt, führt man die Umsetzung mit dem Enzym durch, wobei dieses in einer immobilisierten Form vorliegt, wie an die Oberfläche von Glaskügelchen, Ionenaustauchharzen oder Celluloseteilchen gebunden, in Form einer Aufschlämmung, die, bevor man das Produkt gewinhen kann, zuerst abfiltriert werden muß. Wenngleich dieses Verfahren für den gewünschten Zweck wirksam ist, ist es durch lediglich ein einzelnes Durchleiten der Reaktanten durch die immobilisierte Phase gekennzeichnet, wobei dieses Durchleiten, um vollständig zu sein, 5 bis 6 Tage braucht. Die Australische Patentanmeldung 38 104/89 von Kula et al. lehrt ein ähnliches Verfahren, in dem das Enzym (S)-Oxynitrilase aus einer besonderen Quelle (Sorghum bicolor) stammt. In diesem Verfahren werden in einer Ausführungsform Acrylperlen eingesetzt, um das Enzym zu immobilisieren, d.h. Eupergit C (Rohm Darmstadt), handelsübliche Acrylperlen, die nützlich sind und im Reaktionsmedium oder in einer Säule suspendiert werden. Auf jeden Fall darf es nur in einem wäßrigen System verwendet werden, um jeglichen Angriff auf die Acrylperlen durch verschiedene, organische Losungsnnttel zu verhindern. Außerdem wird in diesem zuletzt genannten Verfahren, wobei gebundene Enzyme verwendet werden, eine Ausbeute von etwa 85 Gew.-% erreicht aber lediglich nach kontinuierlichem, dreitägigen Durchleiten unter Verwendung von 4-Hydroxybenzaldehyd als Aldehyd. Siehe auch US-Patent 5 008 192 von Neidermeyer, Europäisches Patent 326 063, US-Patent 3 862 030 und Deutsche Offenlegungsschrift 3 823 864 A-1, zusätzlich zu oder entsprechend den vorstehenden Dokumenten aus den Vereinigten Staaten und Australien.
In jedem der vorstehenden Patente wird auf einen "Enzym-Diaphragma-Reaktor" Bezug genommen. Wie die entsprechende, technische Literatur offenbart (siehe beispielsweise "Engineering Aspects of Enzyme Engineering" und die darin aufgeführten Fußnoten 16 und 17, d.h. Kragl et al., Ann. N.Y. Aca. Sci. 613 (1990), 167 - 175 und Vasic-Racki et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 (1989), 215 - 222), sind diese Reaktoren jedoch nicht mehr als eine Reihe voll Behältern, die durch Filtrationsmembranen voneinander getrennt sind, die für das Enzym physikalisch undurchlässig sind. Demgemäß wird die Umsetzung in diesem Reaktortyp in einer Lösung durchgeführt, die ein dispergiertes Enzym enthält, mit dem die Reaktanten gegebenenfalls durch Diffusion in Kontakt gebracht werden müssen.
Die Verwendung von polymeren Membranreaktoren, wodurch die Enzyme gebunden werden, ist aus den US-Patenten 4 102 746 und 4 169 014, beide von Bruce S. Goldberg und FR-A-2 293 489 sowie BIOTECH 83, Mai 1983, S.577 - 588 allgemein bekannt. Siehe auch "A Novel Immobilized Enzyme Reactor System" von Bruce S. Goldberg, vorgestellt auf der "27th Annual Spring Symposium Session" über "Non-conventional Reactor Systems", AICHE, East Brunswick, N.J., 10. Mai 1984, in denen die Membranreaktoren dieser zwei US-Patente weiter beschrieben werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Reaktionszeit und die Einfachheit der Handhabung der Reaktanten in den ansonst bekannten Verfahren zur Erzeugung optisch aktiver (S)-Cyanhydrine durch Umsetzen von Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure in Gegenwart des katalytischen Enzyms (S)-Oxynitrilase sowie eines Lösungsmittels gegenüber den vorstehend beschriebenen Verfahren wesentlich verbessert werden, wenn die Lösung des Aldehyds und der Säure durch eine, wie nachstehend definierte, chemisch aktmerte, poröse Membran geleitet wird, an welche das Enzym (S)-Oxynitrilase chemisch gebunden wurde.
Das heißt, wenngleich normalerweise die (S)- und (R)-Enantiomerenformen des Cyanhydrins ohne einen stereoselektiven Katalysator in gleichen Mengen erzeugt würden, d.h. in emem Verhältnis von 50:50, ist es eine Aufgabe dieser Erfindung das Verhältnis des (S)-Isomers gegenüber dem (R)-Isomer ("S/R") durch die geeignete Wahl eines verbesserten Katalysators und der Reaktionsbedingungen zu erhöhen. Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, nicht nur die Selektmtät der (S)- und (R)-Isomeren zu erhöhen, sondern auch für eine hohe Umwandlung in das Produkt und dies in kürzestmöglicher Zeit zu sorgen. Noch eine weitere Aufgabe ist es, diese Ziele zu erreichen, ohne daß das Enzym vom Endprodukt physikalisch abzutrennen ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der gewünschten, optisch aktiven Cyanhydrine wird einfach, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, d.h. indem man eme Lösung des Aldehyds und der Cyanwasserstoffsäure durch eine definierte, poröse Membran, an die das Enzym chemisch gebunden wurde, entweder absatzweise oder kontinuierlich für einen ausgewählten Zeitraum leitet und das gewünschte, optisch aktive Cyanhydrin gewinnt. Es wurde herausgefünden, daß, wenn demgemäß vorgegangen wird, die Reaktionsdauer überraschenderweise auflediglich einen Tag verringert werden kann, was im Unterschied zu den Verfahren nach dem Stand der Technik steht, die bis zu 6 oder 7 Tage erfordem, wohingegen gleichzeitig die Gesamtausbeute an Produkt ebenso wie die Selektivität für das gewünschte (S)-Isomer im Vergleich mit den früheren Verfahren beibehalten oder in einigen Fällen erhöht werden kann. Umgekehrt und stärker bevorzugt ist klar, daß durch dieses Verfahren die Gesamtausbeute entsprechend vervielfacht werden kann, wenn die Zeiträume nach dem Stand der Technik angewandt werden, beispielsweise bis zu 6 oder 7 Tage.
Vorzugsweise sollte die Umsetzung in einem organischen System, in dem der im wesentlichen wasserunlösliche Aldehyd und das entstehende Cyanhydrin löslich sind, durchgefülrt werden. Wenngleich kleine Mengen eines wäßrigen Puffers, das heißt bis zu etwa 1 Gew.-% Wasser, bezogen auf die Gesamtmenge des Systems, eingesetzt werden kann, wird bevorzugt, daß so wenig Wasser wie möglich, d.h. etwa ≤ 0,03%, verwendet wird. Demgemäß umfaßt die Erfindung im wesentlichen ein System, bestehend aus einem organischen Lösungsmittel (das gegebenenfalls einen wäßrigen Puffer enthält), dem Aldehyd und den Säurereaktanten sowie einem Enzym, das chemisch an eine definierte, poröse Membran, die nachstehend ausführlich beschrieben wird, gebunden ist.
Die Umsetzung kann in einem weiten Temperaturbereich und unter weiten pH-Bedingungen, die nicht kritisch sind, durchgeführt werden. Beispielsweise sind demgemäß Temperaturen von etwa -6 bis +30ºC, vorzugsweise von etwa +6 bis +25ºC annehmbar. Die pH-Bedingungen, die nicht kritisch sind, können durch Puffersysteme, wie Natriumacetat, Natriumcitrat oder Natriumphosphat, gesteuert werden und können von etwa 3,5 bis 7,5 schwanken.
Die eingesetzten Aldehyde sind diejenigen, welche üblicherweise, beispielsweise in US- Patent 4 859 784 (vorstehend), angegeben werden. Darin eingeschlossen, wie in diesem Patent beschrieben, sind Aldehyde der Formel
wobei R gesättigt oder ungesättigt, aliphatisch oder aromatisch sein kann und durch ein Halogenatom, schwefel-, stickstoff- oder sauerstoffhaltige Substituenten substituiert sein kann.
Die für dieses Verfahren ausgewählten Aldehyde sollten vorzugsweise im wesentlichen wasserunlöslich sein, d.h. sie sollten vorzugsweise in den organischen Lösungsmitteln dieser Erfindung löslich sein. Demgemäß werden Aldehyde, die in Wasser eine Löslichkeit von weniger als etwa 2,0 bis 0,01 mg/ml besitzen, bevorzugt, und am stärksten werden diejenigen mit Löslichkeiten von weniger als 0,1 mg/ml bis zu etwa 0,01 mg/ml bevorzugt. Beispiele dieser wasserunlöslichen Aldehyde schließen diejenigen der Formel
wobei A ein Wasserstoff- oder Fluoratom ist, und B ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor- oder Bromatom darstellt, ein. Unter diesen wird 3-Phenoxybenzaldehyd bevorzugt.
Das Molverhältnis des Aldehyds zur Cyanwasserstoffsäure beträgt vorzugsweise etwa 1:1 bis 1:100 und stärkerbevorzugt etwa 1:1 bis 1:2.
Die Art des eingesetzten, organischen Lösungsmittels kann einfach unter denjenigen ausgewählt werden, welche die verwendete Membran oder die Art der Umsetzung nicht gegenteilig beeinflussen. Demgemäß wird beispielsweise die Verwendung von Di-n-butylether einerseits bevorzugt, wohingegen für Diisopropylether, der im Verfahren des US-Patents 4 859 784 (vorstehend) eingesetzt wird, unerwarteterweise herausgefimden wurde, daß er das erfindungsgemäße Verfahren unwirksam macht.
Der Enzymkatalysator (S)-Oxynitrilase (EC 4.1.2.11) ist handelsüblich von Sigma Chemical Co. oder kann nach bekannten Verfähren aus Sorghum-Keimen isoliert werden (siehe Bove et al., J. Biol. Chem. 226 (1961), 207). Die Menge des im Verhältnis zum Aldehyd eingesetzten Fnzyms beträgt vorzugsweise etwa 50 bis 2.500 Einheiten des Enzyms je Gramm des Aldehyds, stärker bevorzugt etwa 500 bis 750 Einheiten je Gramm des Aldehyds. Das Enzym kann an die nachstehend beschriebene, poröse Membran einfach chemisch gebunden werden, indem die Membran mit beispielsweise einer 5 gew.-%igen, wäßrigen Lösung von Polyethyleniniin, gefolgt von beispielsweise einer 5 gew.-%igen, wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd und schließlich einer Lösung des Enzyms (S)-Oxynitrilase in einem geeigneten Puffer behandelt wird.
Vorteilhafterweise bleibt das Enzym mehrere Tage an der Membran fixiert, und demgemäß stellt es im Vergleich mit den Verfahren nach dem Stand der Technik nicht nur eine stabilere und beständigere Anordnung dar, sondern es wird auch der zusätzliche Abtreun- und Rückgewinnungsschritt des Enzyms, das in den US-Patenten 4 859 784 und 5 008 192 in Form einer Aufschlämmung vorliegt, vermieden.
Die hierin eingesetzten, porösen Membranen werden vollständig in US-Patent 4 102 746 (vorstehend) beschrieben, wobei diese enzymbindenden Materialien, die Art und das Verfahren zu deren Herstellung sowie das Fixieren und Zurückgewinnen der Enzyme für eme Vielzahl solcher Materialien beschrieben wird.
Grundsätzlich umfassen diese Membranen einer ausgewählten Dicke und/oder Schichten einen unlöslichen, dreidimensionalen, polymeren, harzartigen Binder, in dem überall feinverteilte Füllteilchen dispergiert sind und in dem ein Netzwerk von im wesentlichen miteinander verbundenen Poren vorhanden ist, wobei die Porengröße stark schwanken kann, am stärksten bevorzugt von etwa 0,01 bis etwa 100 µm, und die Gesamtporosität des Materials etwa 50 bis 75% beträgt, und die dispergierten Füllteilchen in der Membran in einer Menge von wenigstens etwa 25 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorhanden sind.
Eine solche Membran ist eine MPS -Membran (FMC Corporation, Philadelphia, PA., USA), die eine mikroporöse Poly(vinylchlorid)-Kieselgel-Folie mit einem Porositätsvolumen im Bereich von 70 bis 80% darstellt. Die Porengröße, bestimmt durch die Quecksilber-Intrusionsporoslmetrie, liegt im allgemeinen im Bereich von 0,2 bis 2.0 µm. Dieser Träger ist äußerst hydrophil, besitzt eine negative Ladung, die in eine positive umgewandelt werden kann, und einen Oberflächenbereich von 80 m²/g. Außerdem ist dieses Material unter normalen Bedingungen nicht-kompressibel und weist eine niedrige trockene Dichte von 0,45 g/cm³ auf Die aktiven Stellen befinden sich auf dem Kieselgel, das in der porösen Matrix enthalten ist, was das Anbringen organischer Funktionalität mittels der Chemie der Anlagerung an Kieselgel gestattet. Diese MPS-Membran besitzt eine Bindungskapazität für DNA von wenigstens etwa 260 µg/cm². Außerdem wurde herausgefimden, daß diese Membran ebenso wie andere geeignete Membranen, die hierin eingesetzt werden können, während sie normalerweise nur in wäßrigen Umgebungen eingesetzt werden, überraschenderweise unter den Bedingungen der organischen Lösungsmittel dieses Verfahrens stabil sind.
Während die Polymeren, die den Binder, d.h. die Matrix, der Membran erzeugen, stark schwanken können, stellen diese vorzugsweise thermoplastische, handelsübliche Harze dar, wobei Poly(vinylchlorid) (PVC) bevorzugt wird. Es können jedoch auch solche Materialien. wie mit Kieselgel gefülltes Polyethylen, oder Copolymere von PVC mit kleinen Mengen monoethylenischer Monomerer, wie Vinylacetat, Vinylidenchlorid, Propylen oder ähnliche, eingesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Matrix aus solchen Materialien, wie Polytetrafluorethylen (PTFE), Celluloseacetat oder -triacetat. Polyamiden (wie Nylon) oder ähnlichen, erzeugt werden. PTFE kann, falls es eingesetzt wird, in Form einer faserartigen Matrix (siehe US-Patente 4 152 661 und 4 373 519) mit beispielsweise darin eingelagerten, hydrophilen, absorptiven Teilchen vorliegen. Demgemäß kann im allgemeinen ein beliebiges, thermoplastisches Harz, das durch ein Lösungsmittel einfach erweicht wird. oder das durch Hitze oder Druck sinterbar ist, oder das einfach ausgehend von einer vorhergehenden Matrix erzeugt werden kann, und das unter den erfindungsgemäßen Bedingungen chemisch und physikalisch stabil ist, derart eingesetzt werden.
Füllstoffe, vorzugsweise in Form einzelner Teilchen, können sowohl anorganische Materialien, wie die vorstehend erwähnten Kieselgelverbindungen oder beispielsweise Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumoxid oder -hydroxid, oder organische Füllstoffe, wie Polysaccharide, einschließlich aktmerter Cellulosederivate, enthalten. (Andererseits wurde festgestellt, daß nicht-aktivierte Cellulose in Kombination mit PVC nicht wirksam ist).
Die entstandene Membran kann aktmert werden, indem man sie in bekannter Weise behandelt, dadurch daß ein chemisches Bindungsmittel zwischen der Membran und dem Enzym bereitgestellt wird, d.h. zwischen den Füllteilchen und dem Enzym. Dieses Binden kann durch chemische Adsorption, kovalentes Binden oder durch Vernetzen zwischen dem Zwischenprodukt und dem Enzym erfolgen. Eingeschlossen in die Bindungsfimktionalitäten, die der Membran verliehen werden können, sind beliebige, freie Ainreste, ebenso wie Carboxyl-, Isonitril-, Aldehyd- oder Ketogruppen, die das Enzym (S)-Oxynitrilase an den Membranfüllstoff binden. Unter diesen wird Polyethylenimin (PEI), das auf dem Füllstoff chemisch adsorbiert sein kann, in Kombination mit beispielsweise Glutaraldehyd, an den das Enzym dann gebunden wird, bevorzugt.
Wie in US-Patent 4 102 746 (vorstehend) offenbart, kann die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Membran einfach durch Mischen geeigneter Mengen eines feinverteilten Polymerharzes, eines feinverteilten anorganischen Füllstoffs, eines Lösungsmittel (beispielsweise Cyclohexanon) und eines Nicht-Lösungsmittels (beispielsweise Wasser) unter geringer Scherkraft hergestellt werden, wodurch ein stabiles, feuchtes, freifließendes Pulver erzeugt wird. Das Pulvergemisch kann dann extrudiert und geglättet werden, wobei vorzugsweise eine im wesentlichen ebene Struktur oder eine Folie mit gewünschten Ausdehnungen erzeugt wird, die als nächstes durch ein wäßriges Bad geleitet wird, um das Lösungsmittel herauszuwaschen, und nachfolgend wird diese dann durch einen geheizten Luftofen geleitet, wodurch das Wasser entfernt wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der entstandene Gegenstand, in Form einer mikroporösen, in den Ausdehnungen beständige, halbsteife, unlösliche, flüssigkeitsdurchlässige Membran, dann so behandelt werden, daß Enzyme daran ankuppeln oder binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die anfängliche, nicht-chemisch aktivierte Membran in der folgenden Weise hergestellt werden: eine Folie eines porösen Materials wird hergestellt, indem man zuerst 9,07 kg (20,0 lbs) Conoco 5385 Poly(vinylchlorid)-Harz mit einer Teilchengröße, die ein Sieb mit 180 µm (80 mesh) passiert, und 18,14 kg (40,0 lbs) Hi Sil 233, ein abgeschiedenes, wasserhaltiges Kieselgel, ungefähr 3 Minuten in einem Patterson Kelley "Niederscherkraft"-Flüssigkeits-Feststoff-Mischgerät trocken mischt. Danach werden unter ständigem Rühren 24,8 kg (54,6 lbs) eines Lösungsmittels (Cyclohexanon) mittels einer Pumpe innerhalb der folgenden 20 Minuten huzugefügt. Dann wird Wasser in einer Menge von 26,8 kg (59,0 lbs) dem Gemisch im Rührmischgerät innerhalb von 20 Minuten zugegeben, wodurch ein feuchtes, stabiles, freifließendes Pulver erzeugt wird. Das Pulver wird dann in einen Schneckenextruder eingebracht, der eine Gehäusetemperatur von ungefähr 48,9ºC (120ºF) aufweist, und das Extrudat wird zwischen den Walzen einer Glättmaschine durchgeleitet, wobei eine im wesentlichen flache Folie mit einer Dicke von 0,5 mm (0,02 inches) erhalten wird. Die Folie wird dann durch ein Extraktionsbad aus Wasser mit 76,7ºC (170ºF) geleitet und nachfolgend in einem Heißluftofen 6 Minuten bei 107,2ºC (225ºF) getrocknet. Die fertiggestellte, poröse Folie weist eine verhältnismäßig weüe Porengrößenverteilung in einer Größenordnung von etwa 0,01 bis etwa 100 µm und einen mittleren Porendurchmesser im Bereich von etwa 0,15 bis etwa 0,25 µm auf, wie durch das Quecksilber-Intrusionsverfahren bestimmt. Die Gesamtporosität dieses Materials liegt bei ungefähr 65 Vol.-%, und der Gehalt an dispergiertem Füllstoff (z.B. Kieselgel) beträgt ungefähr 56 Gew.-%. In einem Routinetest wird beispielsweise flüssiges Wasser in das Material schnell ohne daß ein Druck angelegt wird aufgesogen, wodurch angezeigt wird, daß die Mikroporen im wesentlich von einer Oberfläche zur anderen miteinander verbunden sind.
Die vorstehend hergestellte Membran kann dann mit einem Bindemittel chemisch modifiziert werden, um die (S)-Oxynitrilase gegebenenfalls fester zu binden, dies geschieht folgendermaßen: die unbehandelte Membran wird eine Stunde bei Zimmertemperatur mit einer wäßrigen Lösung mit 5 Gew./Vol. eines verzweigtkettigen Polyethylenimins (PEI) mit einem Molekulgewicht von 50.000 inkubiert. Der behandelte Träger wird mit Wasser und 1 M NaCl durchspült, um jegliches unadsorbiertes PEI zu entfernen. Eine Prüfung kann durch einen Trinitrobenzolsulfonsäure-Test erfolgen: ein intensiv oranges Trinitrophenylaminderivat wird auf der Oberfläche des behandelten Trägerelements beobachtet, wodurch die wesentliche, aliphatische Aminofünktion aufgezeigt wird. Die Beladung mit Stickstoff auf dem behandelten Trägerelement wird durch eine Elementaranalyse quantifiziert, beispielsweise 1,25% Stickstoff im Trockengewicht gegenüber 0,02% Stickstoff im Trockengewicht bei einem unbehandeken Trägerelement. Die chemische Adsorption des PEI auf dem behandelten Trägerelement ist scheinbar irreversibel, d.h. es kann nicht durch Inkubation mit Lösungen, die eine hohe Ionenstärke besitzen (beispielsweise 1 M NaCl oder 1 M K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4;), bei pH-Werten zwischen 3 und 9 entfernt werden. Lediglich im Fall stark saurer Bedingungen (zweistündige Inkubation mit 1 M HCl) deutet sich eine teilweise Desorption an, die 50% des Stickstoffgehalts beträgt, wie durch eine Elementaranalyse angezeigt wird. Der Oberflächenbereich des behandelten Trägers liegt nach dem Standard-BET-Verfahren bei 55,4 m²/g gegenüber 81,1 m²/g bei der Kontrolle. Das mit PEI behandelte Trägerelement entfaltet im Vergleich mit einem unbehandelten Trägerelement die gleichen Fließeigenschaften unabhängig vom Puffer oder der angewandten Ionenstärke.
Das Enzym wird dann an die Membran gebunden, die zuerst mit PEI, wie vorstehend beschrieben, und dann mit einer Verbindungsgruppe, wie Glutaraldehyd, an die das Enzym schließlich bindet, chemisch aktmert wurde. Die Reaktanten werden dann, wenn sie durch die Poren der Membran fließen, mit dem Enzym in Kontakt gebracht. Der Durchfluß des Reaktionsmediums wird vorzugsweise gesteuert, indem die Membran oder die Schichten der Membran in einem Gehäuse oder einer Halterung gestützt werden, welche die Kanten für den Durchfluß undurchlässig machen, indem die Kanten der Membran gehalten werden und dadurch eine Reaktoreinlieit bilden. Gegebenenfalls können auch eine Einlaß- und eine Auslaßöffnung, die Zugang zu den Oberflächen der Membran haben, bereitgestellt werden, und dadurch die Reaktanten durch die Poren des Reaktorkerns und dadurch in Kontakt mit dem Enzym zu leiten und zu drängen. Typische Reaktoren dieses Typs in Form von Platten schließen ACTI-DISK und ACTI-MOD (FMC Corporation, Philadelphia, PA., USA) ein. Insbesondere die zuletzt genannte Platte umfaßt mehrere Membranschichten, wodurch eine vollständigere Gewinnung gewährleistet wird. Es ist daher klar, daß in der Beschriebung unter der Bezeichnung "Membran" eine oder mehrere Membranschichten mit entgegengesetzten Oberflächen verstanden werden, wobei die notwendige Enddicke einfach durch Routinetests bestimmt werden kann. Demgemäß enthielt die ACTI-DISK -Matrix in den folgenden Beispielen überall eine bis etwa 5 Membranschichten, beispielsweise eine Membran in den Beispielen 2, 3, 6 sowie 7, und 5 Schichten in den Beispielen 1, 4 sowie 5.
Das gewünschte Reaktionsprodukt Cyanhydrin kann dann durch Entfernen der Cyanwasserstoffsäure und des Lösungsmittels durch Destillation gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele illustriert. Wie hierin verwendet, werden die Siebgrößen nach dem ASTM-Standard (American Society for Testing Materials) E11-87 bezeichnet.

Beispiel 1

Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in Di-n-butylether bei Zimmertemperatur

Schritt A: Immobilisieren des Enzyms (S)-Oxynitrilase auf einer porösen Matrix

Eine ACTI-DISK -Trägermatrix, die eine Poly(vinylchlorid) und Kieselgelmembran (MPS -Folien, FMC Corp., Phila., PA) enthält, und mit Polyethylenimin vorbehandelt worden war, wurde in einen Standard-Umwälzpumpenreaktor eingebracht. Der Reaktor bestand aus emer Flüssigkeitendosierpumpe, die maximal 10 ml/min pumpen konnte, und an ihrem Auslaß durch einen klaren, flexiblen Kunststoffschlauch mit der Einlaßöffnung der ACTI-DISK - Trägermatrix verbunden war, wobei diese ihrerseits an ihrer Auslaßöffnung mit einem 100 ml Vorratsgefäß verbunden war. Das Vorratsgefäß war durch einen Schlauch mit dem Einlaß der Pumpe verbunden. Die ACTI-DISK -Trägermatrix (Biosupport Materials, Chemical Products Group, FMC Corporation, Philadelphia, PA) bestand aus einem Kunststoffgehäuse mit einem Durchmesser von 63,5 mm und 6,4 mm Dicke, das eine Einlaßöffnung auf einer seiner flachen Seiten und eine Auslaßöffnung auf seiner entgegengesetzten, flachen Seüe besaß. Im Kunststoffgehäuse waren fünf Schichten einer flüssigkeitsdurchlässigen porösen Membran, die aus emer hydrophoben, polymeren Matrix aus Poly(vinylchlorid), einem feinverteilten, hydrophilen Füllstoff aus Kieselgel, das überall in der harzartigen Matrix dispergiert war, und einem überall im Material ausgebildeten Netzwerk von miteinander verbundenen Mikroporen bestand.
Um die endständigen Stickstoffatome des Enzyms mit der PEI-modifizierten ACTI- DISK zu verbinden, wurden 25 ml einer wäßrigen Glutaraldehydlösung mit 5 Gew./Vol. in das Vorratsgefäß gegeben und 60 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/min durch die ACTI-DISK -Trägermatrix gepumpt. Die Lösung wurde durch 50 ml Wasser ersetzt und dieses wurde 30 Minuten durch die ACTI-DISK -Trägermatrix gepumpt. Das Wasser wurde dann aus dem Vorratsgefäß entfernt.
28 ml einer wäßrigen Lösung des Enzyms (S)-Oxynitrilase, das aus 7 Tage alten, unter Lichtausschluß gezogenen Sorghum/Sudan-Grashybrid-Schößlingen (Proteinanalyse: 5.4 mg Protein/ml; Analyse der Enzymaktivität 10,7 Einheiten/mg Protein) erhalten worden war. wurde mit einer 0,05 M Natriumacetatpufferlösung (pH-Wert 5,4) auf 100 ml verdunnt und in das Vorratsgefäß gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten durch die ACTI-DISK -Trägermatrix gepumpt. Nach dieser Zeit wurde der Durchfluß durch die ACTI-DISK -Trägermatrix im Umwälzpumpenreaktor umgekehrt, wodurch die vollständige und einheitliche Beladung des Enzyms gefördert wurde. Das Pumpen der Enzymlösung wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die ACTI-DISK -Trägermatrix wurde dann, wie vorstehend beschrieben, 30 Minuten mit 50 ml Wasser gewaschen. Nach dieser Zeit wurde das Gehäuse, das die ACTI- DISK -Trägermatrix mit dem iminobilisierten Enzym (S)-Oxynitrilase enthielt, aus dem Umwälzpumpenreaktor entfernt und in einem Kühlschrank gelagert, bis es benötigt wurde.

Schritt B: Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in Di-n-butylether bei Zimmertemperatur

Die ACTI-DISK -Trägermatrix aus Schritt A, die das immobilisierte Enzym enthielt, wurde in einen Standard-Umwälzpumpenreaktor eingebracht. Das Vorratsgefäß dieses Systems besaß ein Volumen von 250 ml oder mehr. Das Restwasser wurde aus der ACTI- DISK -Trägermatrix mittels 30minütigem, kontinuierlichen Durchpumpen einer kleinen Menge Di-n-butylether durch die ACTI-DISK -Trägermatrix entfernt. In einem typischen Ansatz wurde das Vorratsgefäß mit einer Lösung von 5,1 g (0,026 mol) bis 24,8 g (0,125 mol) 3-Phenoxybenzaldehyd in 100 ml Di-n-butylether gefüllt. Hierzu wurden mittels einer Spritze 1,1 Moläquivalente Cyanwasserstoff gegeben. Die Lösung wurde gerüllrt, um sicherzustellen, daß sich der Cyanwasserstoff vollständig löste. Das Umwälzen der Lösung durch die ACTI-DISK -Trägermatrix mit einer Pumpgeschwindigkeit von 1 ml/min bis 5 ml/min wurde begonnen. Wie nachstehend beschrieben, wurden regelmäßig Proben für eine Analyse entnommen. Nach Abschluß der Umsetzung (typischerweise nach etwa 24 Stunden) wurde das Reaktionsgemisch aus dem Reaktor herausgepumpt. Die ACTI-DISK -Träger matrix wurde mittels Durchpumpen von 25 ml Di-n-butylether gespült. Nachfolgend auf das Spülen befand sich der Reaktor in einem Zustand, um damit einen weiteren Ansatz durchzufilhren.
Mit jeder aus dem Reaktionsgemisch entnommenen Probe wurden zwei Analysen durchgeführt. Eine Analyse wurde durchgeführt, um die Gesamtumwandlung des 3-Phenoxybenzaldehyds in Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol zu bestimmen, wohingegen die zweite Analyse durchgeführt wurde, um das S/R-Verhältnis des so hergestellten Produkts zu bestimmen.
Um die Umwandlung in Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol zu bestimmen, wurde eine Probe von 0,1 ml des Reaktionsgemischs in die Phiole eines Gaschromatographen mit Autosampler gegeben und mit etwa 1 ml Methylenchlorid verdünnt. Hierzu wurde etwa 1 ml N,O- Bis(trimethylsilyl)trifiuoracetamid gegeben. Die Phiole wurde verschlossen und geschüttelt, und danach 15 Minuten stehengelassen. Eine Probe der Lösung wurde in einen geeignet programmierten Gaschromatographen eingespritzt.
Um das S/R-Verhältnis des Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanols zu bestimmen, wurde eme Probe von 0,5 ml des Reaktionsgemischs in eine Phiole von 1 Dram (1,77185 g) gegeben. Hierzu wurden drei Tropfen Mosher's Säurechlorid (S-(-)-α-Methoxy-α-(triuorphenyl)- phenylessigsäurechlorid) sowie fünf Tropfen Pyridin gegeben. Das entstandene Reaktionsgemisch wurde gemischt, und dann ließ man es eine Stunde reagieren. Nach dieser Zeit wurden 1 ml Wasser und 1 ml Ethylacetat dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde geschüttelt, und die Ethylacetatphase wurde entfernt und in eine Phiole eines Gaschromatographen mit Autosampler gegeben. Eine Probe der Lösung wurde in einen geeignet programmierten Gaschromatographen eingespritzt.
Die Ergebnisse der sieben Ansätze zur Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)- methanol sind nachstehend aufgeführt. Lauf Aldehyd (Mol) Pump geschwindigkeit (ml/min) Laufdauer (Std.) Umwandlung zum Produkt S/R-Verhältnis

Beispiel 2

Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in Di-n-butylether bei einer Temperatur von 6ºC

Das (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol dieses Beispiels wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Umwälzpumpenreaktor unterschied sich darin, daß die ACTI-DISK -Trägermatrix nur eine Schicht des flüssigkeitsdurchlässigen, mikroporösen Elements enthielt, auf dem das Enzym (S)-Oxynitrilase immobilisiert worden war. Die in diesem Verfahren eingesetzte ACTI-DISK -Trägermatrix wurde in ein Bad mit einer konstanten Temperatur von 6ºC eingetaucht. Insgesamt wurden sechszehn Ansätze durchgeführt. Jeder Ansatz bestand aus 1,0 g (0,005 mol) 3-Phenoxybenzaldehyd und 0,4 bis 0,5 ml (Überschuß) Cyanwasserstoff in 25 ml Di-n-butylether. Die Pumpgeschwindigkeit wurde bei 4 bis 5 ml/min gehalten. Die Ergebnisse der sechszehn Ansätze zur Herstellung von (S)-Cyan-(3- phenoxyphenyl)methanol sind nachstehend aufgeführt. Lauf Laufdauer (Std.) Umwandlung zum Produkt S/R-Verhältnis

Beispiel 3

Herstellung voll (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in tert-Butyhnethylether bei Zimmertemperatur

Das (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol dieses Beispiels wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Umwälzpumpenreaktor unterschied sich darin, daß die ACTI-DISK -Trägermatrix nur eine Schicht des flüssigkeitsdurchlässigen, mikroporösen Elements enthielt, auf dem das Enzym (S)-Oxynitrilase immobilisiert worden war. Insgesamt wurden drei Ansätze durchgeführt. Jeder Ansatz bestand aus 1,0 g (0,005 mol) 3-Phenoxybenzaldehyd und 0,5 ml Cyanwasserstoff (wobei sich das zuletzt genannte im Uberschuß befand. um eine vollständige Umwandlung zu gewährleisten und jeglichen Verlust aufgrund von Verdamplung auszugleichen). Das Lösungsmittel für den ersten Ansatz waren 50 ml Din-butylether, und das Lösungsmittel für die folgenden beiden Ansätze waren jeweils 50 ml tert-Butylmethylether. Jeder Ansatz wurde 24 Stunden umgesetzt. Die Pumpgeschwindigkeit wurde bei 5 ml/min gehalten. Die Ergebnisse der drei Ansätze zur Herstellung von (S)-Cyan- (3-phenoxyphenyl)methanol sind nachstehend aufgeführt. Lauf Lösungsmittel Umwandlung zum Produkt S/R-Verhältnis

Beispiel 4

Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in Acetonitril bei Zimmertemperatur

Das (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol dieses Beispiels wurde nach dem in Beispiel 1 bescbriebenen Verfahren hergestellt. Der einzige Ansatz bestand aus 25,0 g (0,126 mol) 3- Phenoxybenzaldehyd und 6 ml (Überschuß) Cyanwasserstoff in 100 ml Acetonitril. Die Umsetzung wurde 24 Stunden bei einer Pumpgeschwindigkeit von 5 ml/min durchgeführt. Die Umwandlung in das Produkt betrug 88,0%, und das S/R-Verhältnis des Produkts lag bei 52,0/48,0.

Beispiel 5

Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in Tetrahydroturan bei Zimmertemperatur

Das (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol dieses Beispiels wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der einzige Ansatz bestand aus 5,0 g (0,025 mol) 3- Phenoxybenzaldehyd und 1,5 ml (Überschuß) Cyanwasserstoff in 100 ml Tetrahydroturan. Die Umsetzung wurde 24 Stunden bei einer Pumpgeschwindigkeit von 5 ml/min durchgeführt. Die Umwandlung in das Produkt betrug 82,0%, und das S/R-Verhältnis des Produkts lag bei 48,0/52,0.

Beispiel 6

Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus 3-Phenoxybenzaldehyd bei Zimmertemperatur unter Verwendung von Cyanwasserstoff als Lösungsmittel

Das (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol dieses Beispiels wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Umwälzpumpenreaktor unterschied sich darin, daß die ACTI-DISK -Trägermatrix nur eine Schicht des fiüssigkeitsdurchlässigen, mikroporösen Elements enthielt, auf dem das Enzym (S)-Oxynitrilase immobilisiert worden war. Der einzige 20 Ansatz bestand aus 1,0 g (0,005 mol) 3-Phenoxybenzaldehyd in 20 ml Cyanwasserstoff Die Umsetzung wurde 24 Stunden bei einer Pumpgeschwindigkeit von 5 ml/min durchgeführt. Die Umwandlung in das Produkt betrug 96,7%, und das S/R-Verhältnis des Produkts lag bei 58,1/41,9.

Beispiel 7

Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol aus Cyanwasserstoff und 3-Phenoxybenzaldehyd in Diisopropylether bei Zimmertemperatur

Das folgende Beispiel zeigt, daß das Lösungsmittel Däsopropylether, das beispielsweise in US-Patent 4 859 784 (vorstehend) eingesetzt wird, als Lösungsmittel für dieses Verfahren unwirksam ist.
Das (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol dieses Beispiels wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Umwälzpumpenreaktor unterschied sich darin, daß die ACTI-DISK -Trägermatrix nur eine Schicht des flüssigkeitsdurchlässigen, mikroporösen Elements enthielt, auf dem das Enyym (S)-Oxynitrilase immobilisiert worden war. Insgesamt wurden zwei Ansätze durchgeführt. Jeder Ansatz bestand aus 2,1 g (0,011 mol) 3-Phenoxybenzaldehyd und 0,6 ml (Überschuß) Cyanwasserstoff Das Lösungsmittel für den ersten Ansatz waren 50 ml Di-n-butylether, und das Lösungsmittel für den zweiten Ansatz waren 50 ml Diisopropylether. Vor seiner Verwendung wurden 500 ml Diisopropylether mittels Durchleiten durch eine Säule von 2,5 cm x 28 cm mit neutralem Aluminiumoxid gereinigt. Der gereüiigte Diisopropylether wurde bis zu seiner Verwendung unter einer Stickstoffatmosphäre aufbewahrt. Der Umwälzpumpenreaktor wurde zwischen den Ansätzen mit 75 ml gereinigtem Diisopropylether durchspült. Jeder Ansatz wurde 23 bis 24 Stunden umgesetzt. Die Pumpgeschwindigkeit wurde bei 5 ml/min gehalten. Die Ergebnisse der zwei Ansätze zur Herstellung von (S)-Cyan-(3-phenoxyphenyl)methanol sind nachstehend aufgefürt. Lauf Lösungsmittel Umwandlung zum Produkt S/R-Verhältnis

Claims

1. Verfahren zur Herstellung optisch aktiver (S)-cyanohydrine durch Umsetzung eines Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure, bei dem ein organisches Lösungsmittel, das die Säure und den Aldehyden enthält, mit dem Enzym (S)- Oxynitrilase in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym chemisch an einen unlöslichen Verbundstoff gebunden ist, der eine poröse Membran umfaßt, durch welche die Reaktanten durchgeleitet werden, wobei die poröse Membran einen polymeren harzartigen Binder, in dem feinverteilte Füllteilchen dispergiert sind und in den ein darin ausgebildetes Netzwerk von im wesentlichen miteinander verbundenen Poren vorhanden ist, umfaßt, wobei die poröse Membran für den Durchfluß einer Flüssigkeit, die die Reaktanten enthält, durchlässig ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung optisch aktiver (S)-Cyanohydrine durch Umsetzung eines Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure, bei dem ein organisches Lösungsmittel, das die Säure und den Aldehyden enthält, mit dem Enzym S-Oxynitrilase in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym chemisch an einen unlöslichen Verbundstoff gebunden ist, der eine poröse Membran oder Schichten von Membranen umfaßt, die mindestens ein Paar entgegengesetzter Oberflächen und eine vorbestimmte Dicke aufweisen, durch die Reaktanten durchgeleitet werden, wobei die poröse Membran einen polymeren harzartigen Binder, in dem feinverteilte Füllteilchen dispergiert sind und in den ein darin ausgebildetes Netzwerk von im wesentlichen miteinander verbundenen Poren vorhanden ist, umfaßt, wobei die Poren in dem harzartigen Binder zwischen den Füllteilchen und dem harzartigen Binder und zwischen benachbarten Füllteilchen ausgebildet sind, die dispergierten Füllteilchen in der porösen Membran in einer Gewichtsmenge von mindestens etwa 25 % vorhanden sind, die Größenverteilung der Poren über jede der Oberflächen und über die vorbestimmte Dicke nicht einheitlich im Bereich von 0,01 µm bis 100 µm variiert, porosimetrisch durch das Quecksilber-Intrusionsverfahren bestimmt und die poröse Membran für den Durchfluß einer Flüssigkeit durch mindestens eine der Oberflächen durchlassig ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran einen Binder aus Polyvinylchlorid und einen Füllstoff aus Siliciumdioxid umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit ihren Kanten in einem Gehäuse enthalten ist, das den Flüssigkeitsfluß durch die Kanten verhindert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse mit einer Einlaßöffnung, die Zugang zu einer Oberfläche der Membran hat und mit einer Auslaßöffnung, die Zugang zu der entgegengesetzten Obertläche der Membran hat, modifiziert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit einem Bindemittel für das Enzym chemisch aktiviert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit dem Bindemittel kovalent gebunden oder vernetzt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit Polyethylenimin und Glutaraldehyd chemisch aktiviert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Löslichkeit des Aldehyden in Wasser weniger als etwa 2,0 mg/ml ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd 3-Phenoxybenzaldehyd ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß das organische Lösungsmittel Di-n-butylether ist.