DE2638764B2 - Verwendung eines Austauscherharzes zum Auftrennen von Proteinen - Google Patents
Verwendung eines Austauscherharzes zum Auftrennen von ProteinenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Austauscherharzes mit bestimmten Eigenschaften zum Auftrennen
von Proteinen.
Die Auftrennung von Proteinen mittels Ionenaustausch ist bereits bekannt. Man verwendet hierzu
Cellulose oder Dextran mit darauf fixierten bzw. gebundenen tert Aminen oder quaternäre η Ammoniumgruppen
oder Säuregruppen. Diese Ionenaustauscher besitzen aber keine mechanische Festigkeit und
können infolgedessen nicht in Säulen oder Kolonnen eingesetzt werden; ihr Volumen verändert sich je nach
Ionenstärke und pH-Wert des Gebrauchsmediums. Außerdem sind diese Ionenaustauscher biologisch
abbaubar und können nicht sterilisiert werden.
Das aus der DE-OS 19 51 222 bekannte Füllmaterial für chromatographische Säulen besteht aus oberflächlich
porösen Makroteilchen, die aus einem undurchlässigen Kern und einem porösen Überzug aufgebaut sind.
Der Kern besteht aus anorganischem Material, vorzugsweise
Glas und kann 5 bis 500 μΐη weite Kapillare
aufweisen. Der poröse Überzug besteht aus aufeinanderfolgenden Monoschichten jeweils entgegengesetzt
geladener Mikroteilchen, die nacheinander aufgebracht werden, bis die gewünschte Schichtdicke erreicht ist.
Die spezifische Oberfläche eines solchen Materials beträgt etwa 0,5 m2/g. Verwendet werden soll dieses
Füllmaterial für die analytische Chromatographie, z. B. zur Trennung von Nucleotidsystemen. Für die präparative
Chromatographie eignet es sich nicht, weil die Bindungen, die die Mikroteilchen des porösen Überzugs
zusammenhalten, nicht beständig genug sind für starke Beanspruchung durch große Mengen Lösung und
Elutionsmittel.
Auch die aus »Nature«, Bd. 207 (1965), Seite 402—3 bekannten Perlen aus vernetztem Polystyrol mit
Ionenaustauschergruppen an der Oberfläche werden für die analytische Chromatographie eingesetzt. Ihre
Wirksamkeit wurde mit 1 bis 10 μιη Mengen von Lösungen von Metallverbindungen oder Farbstoffen
getestet
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, für die Auftrennung von Proteinen ein Material zur Verfügung
zu stellen, das gute mechanische Eigenschaften aufweist, unempfindlich gegenüber Ionenstärke und pH-Wert des
Gebrauchsmediums ist, biologisch nicht abgebaut wird und sterilisiert werden kann und außerdem die
Gewinnung von Proteinen in sehr reiner Form ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung des im vorstehenden Patentanspruch näher bezeichneten
Ionenaustauscherharzes gelöst
Dieses Autauscherharz besteht aus einem porösen mineralischen Trägermaterial, das mit einem Polymerisatfilm
überzogen ist welcher Ionenaustauschergruppen aufweist Die Porosität des Trägermaterials bzw.
Kerns bleibt erhalten. Die Proteinen können daher in das Innere der Poren hineindiffundieren und die
ίο Austauscherkapazität ist dementsprechend sehr groß.
Dieses Austauscherharz kann somit für die Trennung bzw. präparative Reindarstellung von Proteinen im
technischen Maßstabe eingesetzt werden. Hierauf beruht der technische Fortschritt der erfindungsgemäßen
Verwendung.
Zur Erfindungshöhe wird geltend gemacht:
Mit den aus den oben zitierten Druckschriften bekannten Austauschermaterialien ist eine präparative Reindarstellung von Proteinen im technischen Maßstab nicht möglich. Sie unterscheiden sich von dem erfindungsgemäß verwendeten Austauscherharz prinzipiell dadurch, daß sie keinen porösen Kern aufweisen und infolgedessen keine Diffusion der Proteine in den Kern bzw. das Trägermaterial hinein ermöglichen. Auf dieser unterschiedlichen stofflich-physikalischen Beschaffenheit beruht die andersartige Verwendung der bekannten Stoffe: sie werden, wie schon erwähnt für analytische Trennungen von Stoffgemischen eingesetzt, bei denen mit sehr kleinen Stoffmengen gearbeitet wird.
Mit den aus den oben zitierten Druckschriften bekannten Austauschermaterialien ist eine präparative Reindarstellung von Proteinen im technischen Maßstab nicht möglich. Sie unterscheiden sich von dem erfindungsgemäß verwendeten Austauscherharz prinzipiell dadurch, daß sie keinen porösen Kern aufweisen und infolgedessen keine Diffusion der Proteine in den Kern bzw. das Trägermaterial hinein ermöglichen. Auf dieser unterschiedlichen stofflich-physikalischen Beschaffenheit beruht die andersartige Verwendung der bekannten Stoffe: sie werden, wie schon erwähnt für analytische Trennungen von Stoffgemischen eingesetzt, bei denen mit sehr kleinen Stoffmengen gearbeitet wird.
jo Bei der erfindungsgemäßen Auftrennung von Proteinen
wird eine proteinhaltige Lösung mit dem Ionenaustauscherharz in Berührung gebracht, das aus einem
porösen anorganischen Trägermaterial in einer Korngröße von 4 μιη bis 5 mm mit einer spezifischen
J5 Oberfläche von 5 bis 150 m2/g, einem Porendurchmesser
von 50 bis 250 nm und einem Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g und einem filmartigen Überzug in einer
Menge von weniger als 15 mg/m2 aus einem vernetzten Polymerisat der entweder Anionenaustauschergruppen
wie tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumsalze oder Kationenaustauscher wie Säuregruppen enthält
besteht und eine Ionenaustauscherkapazität < 2 mÄqVg
aufweist.
Als poröses anorganisches Trägermaterial kommen Metalloxide wie Titanoxid, Tonerden und vor allem
Kieselsäure in Frage. Vorzugsweise beträgt der mittlere Porendurchmesser dieser Träger 60 bis 150 nm und ihre
spezifische Oberfläche 20 bis 50 m2/g. Die Korngrößenverteilung
richtet sich nach der in Betracht gezogenen
so Verwendung. Die feinsten Teilchen werden für analytische Zwecke und die gröberen Teilchen für präparative
Zwecke verwendet
Die funktionellen Gruppen — tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumsalze — lassen sich durch die
allgemeinen Formeln
-CH2-N-CH2- oder -CH2-N<+>-(R)3X(->
R
R
wiedergeben, in denen R gleich oder verschieden ist und jweils für eine Alkylgruppe oder Hydroxyalkylgruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht und X ein anorganisches oder organisches Anion bedeutet, z. B.
das Chlorid-, Sulfat-, Nitrat-, Phosphat- oder Citratanion.
Die funktionellen Säuregruppen leiten sich von Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Phosphonsäuren ab
und entsprechen den allgemeinen Formeln
-COOH, -SO3H, -PO(OH)2.
-COOH, -SO3H, -PO(OH)2.
Diese funktioneilen Gruppen sind Teil der Kette des vernetzten Polymerisats oder sind an das vernetzte
Polymerisat, das die gesamte Trägeroberfläche überzieht,
gebunden bzw. fixiert
Die vernetzten Polymerisate, die die Oberfläche des anorganischen Trägermaterials überziehen, sind an sich
bekannte Stoffe, die nach beliebig bekannten Polymerisationsverfahren erhalten werden, ausgehend von
Monomeren, die entweder selbst vernetzen können oder zusammen mit einem anderen Monomer, gegebenenfalls
in Anwesenheit eines Katalysators. Hierzu gehören: Epoxyverbindungen, die mit Polyaminen als
Katalysatoren vernetzen; Monomere, die durch Polykondensation ohne Katalysator mit Formaldehyd
vernetzen wie
Harnstoff, Melamin, Polyamine, Phenole;
Vinylmonomere wie Vinylpyridin,
Styrol und seine Derivate,
Acrylsäure, Methacrylsäure,
Vinylbenzoesäure, die mit polyfunktionellen
Vinylmonomere wie Vinylpyridin,
Styrol und seine Derivate,
Acrylsäure, Methacrylsäure,
Vinylbenzoesäure, die mit polyfunktionellen
Monomeren vernetzen, beispielsweise mit
Mono- oder Polyalkylenglykol-diacrylat oder
Mono- oder Polyalkylenglykol-diacrylat oder
-dimethacrylat,
Divinylbenzol,
Divinylbenzol,
Vinyltrialkoxysilan,Vinyltrihalogensilan,
bis-Methylenacrylamid,
bis-Methylenacrylamid,
in Gegenwart eines freie Radikale bildenden Initiators wie organische Peroxide oder Azonitrile oder in
Gegenwart von UV-Strahlen.
Das Trägermaterial wird mit einer Lösung des Monomeren oder Monomerengemisches sowie gegebenenfalls
des Katalysators getränkt, wodurch eine gute Verteilung der Monomeren auf der gesamten Oberfläche
des anorganischen Trägermaterials erreicht wird. Das Lösungsmittel wird dann verdampft und die
Monomeren in bekannter Weise polymerisiert. Als Lösungsmittel kommen alle Lösungsmittel für die
Monomeren und den Katalysator in Frage, deren Siedepunkt vorzugsweise so niedrig wie möglich ist, um
das anschließende Verdampfen zu erleichtern, beispielsweise Methylenchlorid, Diäthyläther, Benzol, Aceton
und Äthylacetat.
Ein besonders geeignetes Verfahren zur Herstellung von Kationenaustauscherharzen durch Überziehen
eines anorganischen Trägermaterials mit Epoxyverbindungen wird in dem älteren Vorschlag gemäß DT-OS
25 38 358 beschrieben.
Enthält das vernetzte Polymerisat auf der Oberfläche des anorganischen Trägermaterials keine wie oben
definierten funktionellen Gruppen in seiner Kette, so muß es auf beliebige, an sich bekannte Weise,
modifiziert werden.
Die Menge an eingesetztem Monomeren oder Monomergemisch wird so bemessen, daß das die
Oberfläche des Trägers überziehende vernetzte Polymerisat mit funktionellen Gruppen weniger als
15 mg/m2, vorzugsweise 1 bis 8 mg/m2, ausmacht.
Das so erhaltene Austauscherharz besitzt eine Austauschkapazität <
2 mÄq./g, vorzugsweise im Bereich von 0,3 bis 1,2 mÄq./g.
Es läßt sich auf alle in wäßrigem Medium lösliche Proteine unabhängig von ihrem isoelektrischen Punkt
anwenden. Zu diesen Proteinen gehören Polypeptide und Enzyme, beispielsweise Albumin, Lactalbumine,
Ovalbumin, Serumalbumin, Hämoglobin, cc-, ß- und y-Globuline, Lactoglobuline, Fibrinogen, Urease, Trypsin,
Lysozym, Pepsin, Proteasen und Cytochrom.
Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht eine sehr leichte Abtrennung der Proteine aus ih.'en
Lösungen wie Milchserum, Bier, Blut, Organextrakten und allen Industrieabwässern, beispielsweise den Abwässern
aus Schlachthöfen, Lebensmittelfabriken und Stärkefabriken; sie stellt somit ein ausgezeichnetes
Mittel zur Bekämpfung der Umweltverschmutzung dar. Die zu behandelnde Lösung wird bei einer Temperatur,
Ionenstärke und einem pH-Wert, die mit dem Protein bzw. den Proteinen verträglich sind, mit dem
Austauscherharz in Berührung gebracht Man kann auch nacheinander ein oder mehrere Anionenaustauscherharze
und/oder Kationenaustauscherharze einsetzen. Dann werden die in der Lösung enthaltenen Proteine
selektiv auf jedem Harz fixiert.
Wird das angestrebte Protein aus einer Lösung auf dem Austauscherharz fixiert, so wird anschließend mit
einer Lösung eluiert, deren pH-Wert und/oder Ionenstärke
sich von der zum Fixieren eingesetzten Lösung unterscheiden. Dadurch wird das Protein nicht nur aus
der Lösung abgetrennt, sondern auch gereinigt und konzentriert. Beispielsweise lassen sich auf diese Weise
Albumin, Pepsin und die Proteine des Milchserums mit einem Kationenaustauscherharz und Lysosym mit
jo einem Anionenaustauscherharz abtrennen und konzentrieren.
Verbleibt das gesuchte oder angestrebte Protein in der erfindungsgemäß behandelten proteinhaltigen Lösung,
werden also die anderen Proteine aus dem Gemisch fixiert, so wird die Trennung des gesuchten
Proteins von den anderen Proteinen, d.h. seine Reinigung, bewirkt. Elution der fixierten Proteine führt
zu einer selektiven Trennung des Proteins bzw. der Proteine und zu ihrer Konzentrierung. Dies trifft u. a. für
y-Globulin mit einem Kationenaustauscherharz zu.
Werden mehrere gesuchte oder angestrebte Proteine gleichheitig auf einem Austauscherharz fixiert, so
bewirkt die Elution bei von der Fixierungslösung verschiedenen pH-Wert und/oder verschiedener Ionenstärke
eine Abtrennung der Proteine aus der Lösung und ihre Konzentrierung. Wird mit Lösungen mit
steigendem pH-Wert und/oder steigender Ionenstärke eluiert, so wird zusätzlich zu der selektiven Trennung
die Reinigung und Konzentrierung (der Proteine)
so bewirkt. Dies trifft vor allem für das Serum des Menschen zu.
Sollen die Proteine entfernt werden, so werden sie aus ihrer Lösung auf einem Austauscherharz fixiert. Man
erhält proteinfreie, d.h. gerinigte, Lösungen. Das Austauscherharz kann durch Eluieren der gebundenen
Proteine regeneriert und darauf wieder eingesetzt werden. Anwendungsgebiete hierfür sind vor allem die
Klärung von Bier sowie die Behandlung von Hämoglobin enthaltenden Lösungen mit Anionenaustauscherharzen.
Die Trennung kann mit identischen Ergebnissen diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Bei kontinuierlicher Arbeitsweise ermöglichen die Austauscherharze in leichtes Füllen der Säule, einen
b5 großen Durchsatz und ein leichtes Eluieren.
Die erzielten Ergebnisse sind praktisch unabhängig von der Konzentration der behandelten Lösung, hängen
aber ab von der Beschaffenheit der Austauschergruppe
des Harzes, vom pH-Wert, der Ionenstärke und der
Aufgabemenge bzw. des Durchsatzes sowohl der zu behandelnden Lösungen als auch des Eluens.
Die erfindungsgemäße Verwendung erstreckt sich auf Gebiete der Lebensmittelindustrie, vor allem der
Industrie für diätetische Lebensmittel, der pharmazeutischen Industrie und der tierverarbeitenden Industrie.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung. Verwendet wurden dabei die
folgendermaßen hergestellten Austauscherharze:
A) !0Og Kieselsäure (Korngröße 100—200 μπι,
spezifische Oberfläche 24 m2/g, mittlerer Porendurchmesser
140 nm und Porenvolumen 1 ml/g) wurden unter vermindertem Druck 5 h bei 150° C getrocknet und in
eine Lösung aus 250 ml Methylenchlorid, 60 ml zweifach destilliertem Styrol, 20 ml Vinyltriäthoxysilan und 0,5 g
Azobis-isobutyronitril gegeben. Nach Abdampfen des Methylenchlorids bei Raumtemperatur wurde 6 h auf
120° C unter einem Druck von 3 bar erhitzt, um die
Vernetzung zu bewirken. Dann wurde die Kieselsäure in 300 ml Xylol suspendiert, 2 h zum Sieden erhitzt,
abfiltriert, mit Aceton gewaschen und schließlich getrocknet. Die Analyse ergab einen Kohlenstoffgehalt
von 4 Gew.-%, bezogen auf die beschichtete Kieselsäure. 50 g davon wurden in 180 g Chlormethyläther
suspendiert, der 6 g Zinn(IV)-chlorid enthielt, und unter Ausschluß von Wasser 4 h unter Rückfluß erhitzt Nach
dem Abkühlen, Abschleudern, Waschen mit HCl-haltigem
Dioxan-Wasser 50:50, Wasser und Trocknen betrug der Kohlenstoffgehalt 4,1 % und der Chlorgehalt
1,9%.
Das erhaltene Produkt wurde in 150 ml wäßriger 3O°/oiger Trimethylaminlösung suspendiert und bei
Raumtemperatur 8 Tage stehengelassen. Nach dem Abschleudern und Waschen erhielt man ein Austauscherharz
mit folgenden funktioneilen Gruppen:
CH3
CH2-N'1'—CH3Cl
CH3
und Merkmalen:
Kohlenstoffgehalt
Chlorgehalt
Stickstoffgehalt
fixiertes Polymerisat
Austauscherkapazität
Chlorgehalt
Stickstoffgehalt
fixiertes Polymerisat
Austauscherkapazität
4,8 Gew.-%
2 Gew.-%
0,9 Gew.-%
3,3 mg/m2
0,5 mÄqyg
2 Gew.-%
0,9 Gew.-%
3,3 mg/m2
0,5 mÄqyg
B) In 150 ml Methylenchlorid, das 6,5 g N,N-bis(2,3-Epoxypropyl)-äthylamin
und 3 g Triäthylentetramin gelöst enthielt, wurden 50 g Kieselsäure (Korngröße 40
bis 100 μπι, spezifische Oberfläche 37 m'/g, Porendurchmesser
llOnm, Porenvolumen 1,05 ml/g) gegeben. Das
Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur verjagt, die imprägnierte Kieselsäure 60 h auf 6O0C erhitzt und
dann mit kochendem Wasser und mit Aceton gewaschen.
Das erhaltene Austauscherharz bestand aus Kieselsäure, überzogen mit einem vernetzten Polymerisat mit
funktionellen Gruppen
-CH2-N-CH,-
QH5
mit folgenden Kennzeichen:
mit folgenden Kennzeichen:
Kohlenstoff
Stickstoff
fixiertes Polymerisat
Austauscherkapazität
8,8%
2,4%
2,4%
3,3 mg/m2
1 mÄq7g
1 mÄq7g
C) Es wurde wie unter B) verfahren, jedoch mit einer Kieselsäure mit Korngröße 100 bis 200 μπι und mit 6,5 g
N,N-bis(23-EpoxypropyI)-butylamin anstelle des 6,5 g N,N-bis(2,3-Epoxypropyl)-äthylamins.
ίο Das fertige Austauscherharz bestand aus Kieselsäure, überzogen mit einem vernetzten Polymerisat, das funktioneile Gruppen
ίο Das fertige Austauscherharz bestand aus Kieselsäure, überzogen mit einem vernetzten Polymerisat, das funktioneile Gruppen
-CH2-N-CH2-C4H9
aufwies; das Austauscherharz hatte folgende Merkmale:
Kohlenstoff
Stickstoff
fixiertes Polymerisat
Austauscherkapazität
9,2Gew.-%
2,5 Gew.-%
3,2 mg/m2
1,1 mÄqVg
2,5 Gew.-%
3,2 mg/m2
1,1 mÄqVg
D) JOOg Kieselsäure (Korngröße 100 bis 200 μίτι,
spezifische Oberfläche 25 m2/g, mittlerer Porendurchmesser
140 nm und Porenvolumen 1,1 ml/g) wurden mit einer Lösung aus 200 ml Methylenchlorid, 24 g Acryl-
jo säure, 6 g Diäthylenglykol-di-methacrylat und 0,4 g
Benzoylperoxid imprägniert. Das Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck bis zur
Gewichtskonstanz verjagt; darauf wurde die imprägnierte Kieselsäure 6 h auf 80°C erhitzt, um die
Polymerisation zu bewirken und dann in 300 ml Wasser suspendiert und 6 h gekocht. Nach dem Abfiltrieren
wurde die Kieselsäure mit Aceton gewaschen und unter
vermindertem Druck bei 80° C getrocknet. ^
Man erhielt ein Austauscherharz mit funktionellen Gruppen —COOH, das folgende Merkmale aufwies:
Kohlenstoff
gebundenes Polymerisat
Austauscherkapazität
Austauscherkapazität
10,55 Gew.-%
7,2 mg/m2
1,05 mÄq7g
7,2 mg/m2
1,05 mÄq7g
E) 100 g Kieselsäure (Korngröße 100 bis 200 μιη,
spezifische Oberfläche 37 m2/g, mittlerer Porendurchmesser
120 nm, Porenvolumen 0,95 ml/g) wurden mit einer Lösung aus 150 ml Methylenchlorid, 60 ml
destilliertem Styrol, 20 ml Vinyltriäthoxysilan und 0,5 g Azobis-isobutyronitril imprägniert. Das Methylenchlorid
wurde bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck bis zur Gewichtskonstanz verjagt unJ die imprägnierte
Kieselsäure 6 h auf 12O0C erhitzt. Dann wurde die Kieselsäure in 300 ml Xylol 6 h zum Sieden erhitzt,
abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und bei 80° C getrocknet.
50 g dieser modifizierten Kiselsäure suspendiert in 500 ml Chloroform wurden tropfenweise mit 50 g
bo HSO3Cl gelöst in 50 ml Chloroform versetzt. Dabei
entwickelte sich Chlorwasserstoff. Nach beendeter Zugabe wurde das Gemisch gerührt und 4 h auf 500C
erhitzt.
Nach dem Abschleudern wurde mit Wasser neutral
b5 gewaschen, darauf mit Aceton gewaschen und im
Vakuum bei 800C getrocknet; man erhielt ein Ionenausiauscherharz mit funktionellen Gruppen
— SO3H und folgenden Merkmalen:
Kohlenstoff
Schwefel
gebundenes Polymerisat
Austauscherkapazität
4 Gew.-%
l,4Gew.-%
2,8 mg/m2
0,43 mÄq./g
l,4Gew.-%
2,8 mg/m2
0,43 mÄq./g
Eine Albuminlösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, jedoch unter Einsatz von 41 g
Austauscherharz A in einer 1 cm weiten Kolonne und mit einer Aufgabegeschwindigkeit des Eluens von
80 ml/h.
Die Albuminkonzentration in der erhaltenen Lösung (Eluat) betrug 7 Gew.-%. Dies zeigt, daß die
Konzentration im Eluat durch Erhöhen der Nutzhöhe in der Säule und durch Verringern der
Elutionsgeschwindigkeit erhöht wird.
Beispiel 5
Abtrennung von y-Gobulin
Abtrennung von y-Gobulin
10 g Austauscherharz B wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben, komprimiert gehalten und mit 0,1 n-Salzsäure
und anschließend mit 0,02-m Phosphatpufferlösung von pH-Wert 6,5 äquilibriert.
Anschließend ließ man 20 ml einer lgew.-°/oigen
Lösung von von Fettstoffen befreitem und lyophilisiertem Humanserum in der gleichen Phosphatpufferlösung
K)
21)
Beispiel 1
Behandlung einer Albuminlösung
Behandlung einer Albuminlösung
10 g Austauscherharz A wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben, komprimiert gehalten und mit einer
0,01-m Phosphatpufferlösung auf pH-Wert 6,5 äquilibriert.
Darauf ließ man eine lgew.-°/oige Albuminlösung in der gleichen Pufferlösung in einer Menge von 180 ml/h
bis zur Sättigung der Säule perkolieren; dies entsprach etwa 200 ml Lösung. Das Harz wurde dann mit 100 ml
der gleichen Pufferlösung gewaschen.
Das fixierte Albumin wurde mit einer 1-m NaCl-Losung
im gleichen Puffer eluiert; das Eluens wurde mit einer Geschwindigkeit von 180 ml/h aufgegeben. 45 ml
Lösung wurden benötigt, um das Albumin in Form einer 3,3gew.-%igen Lösung zurückzugewinnen.
Hieraus ergab sich, daß der Ionenaustauscher eine Kapazität bezüglich Albumin von 150 mg/g hatte und
daß mit seiner Hilfe die Albuminlösung konzentriert ?-, werden konnte.
Der Arbeitsgang wurde 30mal wiederholt, ohne Anzeichen von Quellen oder Altern des Austauscherharzes.
Beispiel 2 s"
Beispiel 1 wurde mit einer 0,2gew.-%igen Albuminlösung wiederholt.
Es wurden die gleichen Ergebnisse erzielt, d. h. man
erhielt die gleiche Konzentration an Albumin unabhän- r> gig von der Konzentration der Ausgangslösung, die
behandelt wurde.
Beispiel 1 wurde wiederholt, als Eluens jedoch eine m
0,05-m Citratpufferlösung mit pH-Wert 6,5 verwendet. Man erhielt 59 ml 2,5gew.-°/oige Albuminlösung.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Beschaffenheit der als Eluens verwendeten Pufferlösung die Konzentration
des Eluats beeinflußt.
mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkolieren. Dann wurde das Austauscherharz mit 50 ml der gleichen
Phosphatpufferlösung gewaschen.
Die auslaufende Lösung enthielt das in der Ausgangslösung enthaltene y-Globulin elektrophoretisch rein.
Die anderen in der Ausgangslösung enthaltenen Proteine; «-Globuline, ^-Globuline und Albumin, waren
an das Austauscherharz gebunden, sie wurden mit einer 3-m NaCl-Lösung im gleichen Phosphatpuffer eluiert.
Wurden zum Eluieren Pufferlösungen mit zunehmender Ionenstärke eingesetzt durch Erhöhen der NaCl-Konzentration,
so erhielt man an a-Globulinen, jS-Globulinen und Albumin angereicherte Lösungen.
Beispiel 6
Extraktion von Proteinen
Extraktion von Proteinen
10 g Austauscherharz C wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben, darin komprimiert und mit nacheinander
0,1 η-Salzsäure und 0,01-m Phosphatpufferlösung von
pH-Wert 7,5 äquilibriert.
30 ml einer lgew.-°/oigen Lösung aus ultrafiltriertem
Milchserumpulver enthaltend 75 Gew.-% Proteine in der gleichen Phosphatpufferlösung wurde mit einer
Geschwindigkeit von 80 ml/h perkoliert. Anschließend wurde das Austauscherharz mit 100 ml der gleichen
Phosphatpufferlösung gewaschen.
Die auslaufenden Lösungen enthielten die in der Ausgangslösung vorhandenen Fettstoffe und die Lactose.
Die Proteine, Lactalbumine, Lactoglobuline, Serumalbumin
und ein kleiner Teil der Immunoglobuline aus der Ausgangslösung waren an das Austauscherharz gebunden
und wurden mit 0,5-m Mac-Ilvaine-Pufferlösung von pH-Wert 4 eluiert und gereinigt.
Beispiel 7
Extraktion von Proteinen
Extraktion von Proteinen
20 g Austauscherharz A, jedoch mit einer Korngrößenverteilung von 200 bis 500 μίτι, wurden in eine 2,5 cm
weite Säule gegeben und komprimiert bzw. festgepackt -, gehalten. Das Austauscherharz wurde mit nacheinander
0,1 η-Salzsäure und 0,01 -m »Tris-HCl« Pufferlösung von
pH-Wert 7 äquilibriert.
600 ml einer Lösung aus 300 ml gleiche Pufferlösung und 300 ml von Fettstoffen befreites Milchserum mit 0,5
-,(i Gew.-% löslichen Proteinen wurde mit einer Geschwindigkeit
von 300 ml/h perkoliert und das Austauscherharz anschließend mit 100 ml der gleichen Pufferlösung
gewaschen.
Die aus der Säule ablaufenden Lösungen enthielten
-,-, die in der Ausgangslösung vorhandene Lactose. Die
Proteine, Lactalbumine, Lactoglobuline, Serumalbumin und ein kleiner Teil der Immunoglobuline aus der
Ausgangslösung war an das Austauscherharz gebunden und wurden mit einer 0,1-m Citrat-Natronlauge
Wi Pufferlösung von pH-Wert 7 eluiert. Das Eluat enthielt
die Gesamtmenge der vorher gebundenen Proteine in einer Konzentration von 4 Gew.-°/o.
Mit Hilfe dieses Arbeitsganges wurde ein Gemisch aus reinen Proteinen, frei von Lactose, als gegenüber
h-, der Ausgangslösung wesentlich stärker konzentrierte
Lösung erhalten.
Nach 30 aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen wurde keinerlei Altern des Austauscherharzes beobachtet.
Beispiel 8
Behandlung einer Pepsinlösung
Behandlung einer Pepsinlösung
3 g Austauscherharz A wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben und mit 100 ml destilliertem Wasser
gewaschen. Darauf wurden 150 ml einer Lösung aus rohem Pepsin mit 20 Pepsineinheiten/ml in einer
Geschwindigkeit von lOOml/h perkoliert und das Austauscherharz anschließend mit 20 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
Die aus der Kolonne ablaufende Lösung und das Waschwasser zeigten überhaupt keine Aktivität; das
gesamte Pepsin war an das Austauscherharz gebunden. Die Begleitstoffe blieben in Lösung, wie sich durch |-,
Messungen am Feststoffextrakt zeigte.
Das gebundene Pepsin wurde dann durch Perkolieren einer 1-m NaCl-Lösung mit einer Geschwindigkeit von
100 ml/h eluiert.
16 ml Lösung wurden benötigt, um das Pepsin als Lösung mit 170 Pepsineinheiten/ml zurückzugewinnen.
Dies zeigt die starke Konzentrierung gegenüber der Ausgangslösung.
Das Austauscherharz wurde nach Waschen mit 50 ml destilliertem Wasser erneut eingesetzt. Nach 10
aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen wurde keinerlei Altern festgestellt.
Beispiel 9
Behandlung einer Lysozymlösung Jl)
Behandlung einer Lysozymlösung Jl)
10 g Austauscherharz D wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben und komprimiert gehalten; darauf wurde
das Austauscherharz in die Ammoniumform (NH44·)
gebracht durch Perkolieren von 21 wäßriger 0,5-m Ammoniumacetatlösung, gepuffert auf pH-Wert 8,2.
Das Harz wurde dann mit 100 ml Tris-maleinsäurepuffer
0,02-m äquilibriert.
Darauf ließ man eine lgew.-%ige Lösung aus Lysozym in der gleichen Pufferlösung mit einer
Geschwindigkeit von 180mI/h bis zur Sättigung der Säule perkolieren; dies entsprach etwa 200 ml Lösung.
Das Harz wurde dann mit 100 ml 0,02-m Tris-maleinsäurepuffer, pH 8,2, gewaschen.
Das gebundene Lysozym wurde darauf durch Perkolieren einer 1-m NaCl-Lösung in der gleichen
Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 180 ml/h eluiert. 50 ml Lösung wurden benötigt, um das Lysozym
in Form einer 2,5gew.-%igen Lösung zurückzugewinnen,
in
Hieraus ergab sich, daß der Austauscher eine Kapazität für Lysozym von 125 mg/g besaß und es
ermöglichte, die Lysozymlösung zu konzentrieren.
Beispiel 10
Extraktion von Hämoglobin
10 g Austauscherharz E wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben und mit 0,02-m Phosphatpufferlösung auf
pH 6,5 äquilibriert. Darauf wurden 500 ml einer wi 0,2gew.-%igen Hämoglobinlösung in dem gleichen
Puffer mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkoliert. Das Hämoglobin wurde an dem Austauscherharz
adsorbiert bzw. fixiert. Die ablaufende farblose Lösung enthielt kein Hämoglobin mehr und war somit gereinigt.
Das adsorbierte Hämoglobin wurde mit einer 0,5-m Ammoniumcarbonatlösung eluiert und die Säule an
schließend mit 300 ml 0,1 η-Natronlauge und mit 50 ml
1 η-Salzsäure gewaschen, bevor sie erneut eingesetzt wurde.
Beispiel 11
Behandlung von Milchserum
Behandlung von Milchserum
In eine erste 2,5 cm weite Säule (Nr. 1) wurden 20 g Austauscherharz A und in eine zweite 2,5 cm weite
Säule (Nr. 2) 10 g Austauscherharz D gegeben. Die beiden Säulen wurden in Reihe (hintereinander)
angeordnet und die Austauscherharze mit 500 ml Wasser gewaschen.
500 ml Milchserum, eingestellt auf pH 7,5 durch Zugabe von 0,1 η-Natronlauge, wurden filtriert, um die
Feststoffe zu entfernen und dann durch Säule Nr. 1 und Säule Nr. 2 mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/h
perkoliert. Der Test der Proteinfällung mit Trichloressigsäure zeigte, daß das aus der zweiten Säule
ablaufende Milchserum kein Protein mehr enthielt. Die Austauscherharze in den beiden Säulen wurden mit
100 ml Wasser gewaschen.
Die in der Ausgangslösung vorhandenen Proteine: Lactalbumine, Lactoglobuline, Serumalbumin und ein
sehr kleiner Teil der Immunoglobuline wurden vom Austauscherharz der Säule Nr. 1 fixiert und dann wie in
Beispiel 7 beschrieben eluiert.
Auf dem Austauscherharz der Säule Nr. 2 wurden im wesentlichen die vom Austauscherharz der Säule Nr. 1
nicht zurückgehaltenen Immunoglobuline fixiert. Sie wurden mit einer 1-m Ammoniumcarbonatlösung
eluiert. Das Eluat enthielt die Immunoglobuline, die etwa 16 Gew.-% der gesamten in der Ausgangslösung
vorhandenen Proteine ausmachten, in einer Konzentration von etwa 3 Gew.-%.
Die beiden Säulen wurden dann mit 500 ml Wasser gewaschen und erneut eingesetzt. Nach 10 aufeinanderfolgenden
Arbeitsgängen wurde keinerlei Altern der Austauscherharze beobachtet.
Beispiel 12
Extraktion der Proteine aus Bier
Extraktion der Proteine aus Bier
60 g Austauscherharz D wurden in eine 2,5 cm weite Säule gegeben und mit 250 ml Wasser gewaschen.
3 1 nicht geklärtes Bier wurden mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkoliert. Das aus der Säule
ablaufende Bier ergab keine Fällung mehr bei Zugabe von Picrinsäure und hatte alle Merkmale eines geklärten
Biers.
Die am Austauscherharz fixierten Produkte waren im wesentlichen Proteine und wurden mit 400 ml
0,1 η-Salzsäure eluiert.
Vor erneutem Gebrauch wurde das Austauscherharz mit 250 ml Wasser gewaschen.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verwendung eines Austauscherharzes, das aus einem porösen anorganischen Trägermaterial mit Korngröße 4 μπι bis 5 mm, spezifischer Oberfläche 5 bis 150 m2/g, Porendurchmesser 50 bis 250 nm, Porenvolumen 0,4 bis 2 ml/g und einem Überzug in einer Menge von weniger als 15 mg/m2 aus vernetztem Polymerisat mit Anionenaustauschergruppen wie tertiäre Amino- oder quaternäre Ammoniumsalzgruppen oder mit Säuregruppen als Kationenaustauschergruppen besteht und eine Austauscherkapazität < 2 mÄqVg aufweist, zum Auftrennen von Proteinen.
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