DK156577B

DK156577B - Fremgangsmaade til separering af proteiner ved ionbytning

Info

Publication number: DK156577B
Application number: DK389176AA
Authority: DK
Inventors: Francois Meiller; Bernard Mirabel
Original assignee: Rhone Poulenc Ind
Priority date: 1975-08-28
Filing date: 1976-08-27
Publication date: 1989-09-11
Also published as: CA1069843A; NO145508B; IE43536B1; AU500134B2; YU209676A; DK389176A; AR209193A1; JPS5257200A; AU1721776A; NL178294C; IE43536L; SU688124A3; RO78229A; DK156577C; US4100149A; GB1513195A; NL7609562A; NZ181884A; DE2638764B2; NO145508C

Description

DK 156577 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til séparering af proteiner ved ionbytning.

Det er kendt at separere proteiner ved ionbytning ved at anvende cellulose eller dextran, hvorpâ er fixeret enten tertiære aminer eller kvaternære ammoniumforbindelser, eller syregrupper. Imidlertid har disse ionbyttere ikke mekanisk styrke, og soin fplge deraf kan de ikke anvendes i en kolonne, endvidere sker der ændringer i voluminet afhængigt af det anvendte médiums ionstyrke og pH.

I0vrigt er disse ionbyttere bionedbrydelige og kan ikke steriliseres.

De ionbytterharpikser, der anvendes ved fremgangsmâden ifplge opfindelsen, har ikke de ovenfor beskrevne ulemper, men har gode mekaniske egenskaber, er ikke f0lsomme over for det anvendte médiums ionstyrke og pH og er endvidere ikke biologisk nedbrydelige og kan steriliseres. Desuden g0r disse ionbyttere det muligt at fremstille meget rene proteiner.

Ved den omhandlede fremgangsmâde til separering af proteiner bringes en proteinopl0sning i kontakt med en ionbytterharpiks og denne ionbytterharpiks er ejendommelig derved, at den bestâr af en por0s mineralsk bærer, der har en partïkelst0rrelsesfordeling mellem 4 ym og 5 mm, en specifik overflade pâ 5-150 m2/g, en porediameter pâ 50-250 nm, et porevolumen pâ 0,4-2 ml/g, idet den por0se mineralske bærer er overtrukket med h0jst 15 mg/m2 af en film af en tværbundet polymer, som indeholder eller bærer enten anionbyttergrupper repræsenteret ved tertiære aminer eller kvaternære ammoniumsalte, eller kationbytter-grupper repræsenteret ved syregrupper, og som har en ionbytterkapacitet pâ mindre en 2 mækv./g.

2

DK 156577 B

Som por0s mineralsk bærer kan anvendes metaloxider, sâsom titanoxid, aluminiumoxider og især siliciumoxider.

Disse bærere har middelporediametre pâ 50-250 nm og fortrinsvis 60-150 nmf en specifik overflade pâ 5-150 ταϊ/g, fortrinsvis 20-50 m^/g og en partikelst0r-relsesfordeling fra 4 μια til 5 mm. De valgte karakteris-tika afhænger af anvendelsesomrâdet. Sâledes anvendes de fineste partikler til analytiske formâl og de groveste partikler til præparative formâl.

De-funktionelle grupper* nemlig de tertiære aminer eller kvarternære ammoniumsalte repræsenteret ved de almene formler -CH2-N-CH2- eller -CH2-Ni+)-(R)3 hvori R

R

er ens eller forskellige og betegner en alkyl- eller hydroxyalkylgruppe med 1-4 carbonatomer og X er en mineralsk eller organisk anion, som f.eks. chlorid, sulfat, nitrat, phosphat eller citrat.

De funktionelle syregrupper, sâsom carboxylsyre, sulfonsyre eller phosphonsyre svarer til de almene formler -C00H, -SO3H og -PO(OH)2.

Disse funktionelle grupper udg0r en del af kæden i den tværbundne polymer eller fikseret til den tværbundne polymer, der dækker hele bærerens overflade.

De tværbundne polymère, der dækker den mineralske bærers overflade, er i sig selv kendte produkter, der opnâs ved kendte polymerisationsmetoder. De kan fremstilles ud fra monomère, der kan tværbindes i sig selv eller med en anden monomer eventuelt i nærværelse af en katalysator.

Blandt disse monomère kan nævnes: epoxyforbindelser, der tværbindes med polyaminer som katalysatorer, monomère, der tværbindes ved polykondensation med formaldehyd uden 3

DK 156577 B

katalysator sâsom urinstof, melamin, polyaminer og phenoler. Endvidere vinylmonomere, som f.eks. vinylpyridin, styren og derivater deraf, acrylsyrer, methacrylsyrer og vinylbenzoesyre, der tværbinder med polyfunktionelle monomère, sâsom diacrylat eller dimethacrylat af mono- eller polyalkylenglycol, divinylbenzen, vinyltrialkoxysilan, vinyltrihalogensilan eller bis-methylenacryl-amid, i nærværelse af en initiator, der frigiver frie radikaler, sâsom organiske peroxlder og azonitriler, eller i nærværelse af ultraviolette strâler.

Nâr den mineralske bærer skal overtrækkes med den tvær-bundne polymer, imprægneres bæreren med en opl0sning af en eller flere monomère og eventuelt katalysator i et opl0sningsmiddel, der giver en god fordeling af monomer ene over hele den mineralske bærers overflade, hvorefter opl0sningsmidlet afdampes og monomeren tværbindes pâ kendt mâde. Som opl0sningsmiddel kan anvendes aile produkter, der opl0ser monomerene og katalysatoren, og hvis kogepunkt fortrinsvis er sâ lavt som muligt for at lette den pâfolgende afdampning.

Disse opl0sningsmidler er f.eks. methylenchlorid, ethylether, benzen, acetone, ethylacetat.

En fremgangsmâde, der særlig er egnet til fremstilling af en anionisk ionbytter, hvor bærerne overtrækkes med epoxyforbindelser er beskrevet i FR-A-2283101 (dansk ans0gning nr. 3870/75).

Nâr den tværbundne polymer pâ overfladen af den mineralske bærer ikke i kæden har funktionelle grupper som defineret ovenfor, er det n0dvendigt at modificere den. Dette er n0dvendigt, nâr der anvendes tværbundne polymère pâ basis af styren og derivater deraf, polymère 4

DK 156577 B

mellem formaldehyd og urinstof, melamin, polyaminer eller phenoler. Denne modifikation bestâr, nâr det drejer sig om polymère af styren-eller phenol-formal-dehyd i pâ polymeren at fiksere carboxylsyregrupper, sulfonsyregrupper, phosphonsyregrupper pâ i og for sig kendt mâde, eller chlormethylgrupper, som herefter omsættes med en sekundær amin eller tertiær amin, og denne reaktion udf0res ogsâ pâ i og for sig kendt mâde.

For at fiksere chlormethylgrupper til polymeren er det fordelagtigt, nâr det drejer sig om styrenpolymere, at dispergere den mineralske bærer, der er overtrukket med polymer, i chlormethylether. Dette skal foregâ varmt og i nærværelse af en Lewis-syre. I modsætning hertil kan man, nâr det drejer sig om en phenolformaldehydharpiks, dispergere den mineralske bærer overtrukket med polymeren i epichlorhydrin og lade reaktionen foregâ varmt.

Nâr det drejer sig om polymère af formaldehyd og polyaminer, urinstof eller melamin, bestâr denne modifikation i at omdanne de primære aminer i kæden til tertiære aminer eller kvaternære ammoniumsalte pâ kendt mâde f.eks. ved at omsætte med et sulfat eller et alkylhalogenid.

Ved pâf0ring af overtrækket pâ den mineralske bærer skal den mængde monomer (s), der bringes i anvendelse, være sâdan, at den mængde tværbundet polymer, der indeholder funktionelle grupper og som er fordelt over den mineralske bærers overflade, er mindre en 15 og fortrinsvis mellem 1 og 8 mg/m^.

De sâledes fremstillede mineralske bærere overtrukket med tværbundne polymère, der indeholder funktionelle grupper, har en ionbytterkapacitet mindre en 2 mækv./g 5

DK 156577 B

og fortrinsvis 0,3-1,2 mækv./9·

Den omhandlede fremgangsmâde er egnet til separering af aile proteiner, der er oplpselige i vandigt medium uanset deres isoelektriske punkt.

Blandt disse proteiner, som ogsâ omfatter polypeptider og enzymer, kan f.eks. nævnes: albumin, lactalbuminer, ovalbumin, serumalbumin, hæmoglobin, α-, β- og γ-globuliner, lactoglobuliner, fibrinogen, urease, trypsin, lysozym, pepsin, protease og cytochrom.

Den omhandlede fremgangsmâde g0r det muligt særdeles let at adskille proteiner fra de opl0sninger, hvori de findes, sâsom valle, 01, blod, organekstrakter og aile industrielle spildevand, slagteriaffaldsvand, spildevand fra levnedsmiddelindustrien og fra stivelsesfabrikker, og fremgangsmâden er sâledes en metode til at rense disse spildevand og er derfor et middel til bekæmpelse af forureningen.

Sépareringen udfpres ved en temperatur, en ionstyrke og en pH der er forligelig med proteinet eller proteinerne, og opnâs ved at bringe opl0sningen, der skal behandles, i kontakt med ionbytterharpiksen, der vælges som funktion af sépareringsbetingelserne. Der opnâs sâledes en fiksering pâ ionbytterharpiksen, enten af det s0gte protein eller af andre proteiner i opl0sningen eller af hele opl0sningens proteinmængde.

Separeringen kan ligeledes opnâs ved under de samme betingelser at bringe oplpsningen i kontakt successivt med en eller flere anionbytterharpikser og/eller kationbytterharpikser. Der opnâs sâledes en selektiv fiksering af proteinerne fra opl0sningen pâ hver harpiks.

6

DK 156577 B

I det tilfælde hvor et 0nsket protein stammende fra en proteinopl0sning eller en ikke^-proteinholdig opl0sning, fikseres pâ en harpiks, frasepareres den derefter ved eluering med en opl0sning, der har et pH og/eller en ionstyrke, der er forskellig fra udgangsopl0sningens, men som stadig er forligelig med proteinet. Der opnâs saledes ikke blot en separering af proteinet fra opl0sningen, men ogsâ en oprensning og koncentrering deraf. Pâ denne mâde kan man f.eks. separere og koncentrere albumin, pepsin* proteiner fra valle med en kationbytterharpiks og lysosym med en anionbytterhar-piks.

I det tilfælde, hvor det 0nskede protein forbliver i opl0sning ved den omhandlede fremgangsmâde, og hvor de andre proteiner fikseres pâ ionbytteren, opnâs der en separering af den 0nskede protein fra de andre og sâledes en oprensning. Eluering af de fikserede proteiner f0rer til en selektiv eller ikke selektiv adskillelse af nævnte proteiner og til en opkoncentre-ring af disse. Dette er f.eks. tilfældet nâr det drejer sig om γ-globulin under anvendelse af en anionisk harpiks.

Nâr flere forskellige 0nskede proteiner fikseres samtidigt pâ en harpiks, medf0rer en eluering ved forskellige pH-værdier og/eller ionstyrker en separering af opl0sningens proteiner og herved en opkoncentrering.

Eluering med opl0sninger med stigende pH og/eller ionstyrke giver foruden en selektiv separering en oprensning og koncentrering. Dette er især tilfældet ved humant sérum.

I det tilfælde, hvor proteinerne skal fjernes fra en opl0sning deraf, fikseres de til en harpiks. Der opnâs 7

DK 156577 B

sâledes opl0sninger renset for protein. Eluering af de fikserede proteiner g0r det muligt at genanvende harpiksen. Det er især tilfældet ved klaring af 01 og ved behandling af opl0sninger indeholdende hæmoglobin med kationbytterharpikser.

Separeringen kan udf0res med identiske resultater bâde diskontinuerligt og kontinuerligt.

Ved kontinuerlig drift er de omhandlede ionbytterharpikser nemme at fylde i kolonnen, de har stor kapacitet og er lette at eluere.

De opnâede resultater er praktisk taget uafhængige af den behandlede opl0snings koncentration, men er afhængige af ionbytterharpiksens grupper, af pH, af ionstyrken og af kapaciteten samt af mængden af de opl0sninger, der skal behandles og af eluerïngsopl0sningen.

Den omhandlede fremgangsmâde kan anvendes inden for levnedsmiddelindustrien, især diætindustrien/ den farmaceutiske og veterinærindustrien.

F0lgende eksempler illustrerer nærmere opfindelsen: EKSEMPEL 1

Fremstilling af ionbytterharpiks 100 g siliciumoxid med en kornst0rrelsesfordeling pâ 100-200 ym, en specifik overflade pâ 24 m^/g, en middelporediameter pâ 140 nm og et porevolumen pâ 1 ml/g t0rres ved 150°C under reduceret tryk i 5 timer.

Det t0rrede siliciumoxid sattes til en opl0sning af 250 8

DK 156577 B

ml methylenchlorid, 60 ml destilleret styren, 20 ml vinyltriethoxysilan og 0,5 g azo-bis-isobutyronitril.

Methylenchloridet afdampedes ved stuetemperatur, hvorefter den imprægnerede siliciumoxid opvarmedes til 120°C i 6 timer under et tryk pâ 3 bar til opnàelse af tværbinding.

Den imprægnerede siliciumoxid suspenderes herefter i 300 ml xylen og opvarmedes til kogning i 2 timer. Efter filtrering vaskes siliciumoxidet med acetone og t0rres herefter.

En analyse viser et kulstofindhold pâ 4 vægt-% i forhold til det overtrukne siliciumoxid.

50 g af det fremstillede siliciumoxid suspenderes i 180 g chlormethylether, indeholdende 6 g stannichlorid, hvorefter blandingen opvarmes til kogning under tilbagesvaling i 4 timer i et vandfrit medium.

Efter afk0ling t0rres siliciumoxidet, vaskes med 200 ml af en blanding af dioxan og vand.(50:50) indeholdende 10 ml saltsyre, hvorefter der vaskes med vand indtil neutral reaktion og endelig t0rres produktet.

Kulstofindholdet er nu 4,1% og chlorindholdet er 1,90%.

Det opnâede produkt suspenderes i 150 ml af vandig 30% trimethylaminopl0sning og henstâr 8 dage ved stuetemperatur.

Efter t0rring og vask, opnâs en ionbytterharpiks med den 9

DK 156577 B

funktionelle gruppe CH,

j D

\ 0 VCH2-n^-CH3 Cl^ '- CH,

D

der har f0lgende analyse: - carbon 4,8% - chlor 2,0% - nitrogen 0,9% - mængde fikseret polymer 3,3 mg/m^ - ionbytterkapacitet 0,5 mækv./g.

Behandling af en albuminoplpsninq 10 g af den fremstillede ionbytterharpiks anbringes i en kolonne med en diameter pâ 1 cm og harpiksen sammenpresses og indstilles til pH 6,5 med en 0,01 M phosphatpuffer.

En albumînopl0sning pâ 1% i den samme puffer peroleres igennem kolonnen i en mængde pâ 180 ml/h indtil mætning af kolonnen, hvilket svarer til ca. 200 ml oplpsning.

Harpiksen vaskes herefter med 100 ml af nævnte puffer.

Den fikserede albumin elueres herefter ved udludning med en 1 M natriumchloridoplpsning i samme puffer, hvor mængden er 180 ml/h. 45 ml af denne oplpsning g0r det muligt at udvinde albumin i en 3,3% oplpsning.

Der konkluderes heraf, at ionbytteren har en albumin-kapacitet pâ 150 mg/g og at det er muligt at koncentrere en oplpsning af albumin.

10

DK 156577 B

Den samme operation gentages 30 gange og der observeres ingen opkvældning eller slid pâ ionbytteren.

EKSEMPEL 2

Eksempel 1 gentages med en 0,2% albuminopl0sning i stedet for en 1% l0sning.

De samme resultater opnâs, d.v.s. der opnâs den samme albuminkoncentration, uanset hvilken udgangskoncentra-tion, der anvendes.

EKSEMPEL 3

Eksempel 1 gentages idet proteinelueringen dog udf0res med en 0,05 M citratpuffer ved pH 6,5. Der opnâs 59 ml af en 2,5 vægt-% albuminopl0sning. Dette fors0g viser indflydelsen af elueringspufferens art pâ koncentra-tionen af den opnâede opl0sning.

EKSEMPEL 4

En albuminopl0sning behandles pâ samme mâde som i eksempel 1 idet der dog anvendes 41 g ionbytterharpiks i kolonnen og der anvendes en elueringshastighed pâ 80 ml/h i stedet for 180 ml/h.

Den opnâede albuminkoncentration var 7 vægt-%. Dette viser, at man ved at 0ge kolonnens h0jde og formindske elueringshastigheden kan 0ge den opnâede koncentration.

EKSEMPEL 5

Fremstilling af harpiks I 150 ml methylenchlorid indeholdende 6,5 g N,N-bis-

DK 156577 B

11 (epoxy-2,3-propyl) ethylamin i opl0sning og 3 g triethylentetramin, tilsættes 50 g siliciumoxid med en partikelstprrelse pâ 40-100 μπι, en specifik overflade pâ 37 m2/gf en porediameter pâ 110 nm og et porevolumen pâ 1,05 ml/g.

Methylenchloridet afdampes ved stuetemperatur. Silicium-oxidet imprægneres og opvarmes til 60°C 1 60 timer til tværbinding af polymeren, hvorefter der vaskes med kogende vand og herefter med acetone. Den fremstillede ionbytterharpiks udgdres af siliciumoxid overtrukket med en tværbunden polymer, der har den funktüonelle gruppe: -CH2-ljl-CH2- c2h5 og har endvidere f0lgende sammensætning: - carbon 8,8% - nitrogen 2,4% - fikseret polymermængde 3,3 mg/m^ - ionbytterkapacitet 1 mækw„/g.

Separering af γ-globulin 10 g ionbytterharpiks anbringes i en koleine som ovenfor og komprimeres. Harpiksen stabiliseres med 0,1 N salt-syre og herefter med 0,02 M phosphatpuffer med pH 6,5.

Der tilledes 20 ml af en affedtet opl0sning af humant sérum lyofiliseret til 1 vægt-% i samme phosphatpuffer.

Hastigheden var 100 ml/h. Harpiksen vaskes herefter med 50 ml af samme phosphatpuffer.

Oplpsningen, der kom ud af kolonnen, indeholder i elektroforetisk ren tilstand γ-globulin fra udgangs- 12

DK 156577 B

opl0sningen.

De andre proteiner: α-globuliner, β-globuliner, og albumin, der ligeledes var i udgangsopl0sningen, er fikseret til harpiksen. De udvindes ved eluering med en 3M natriumchloridopl0sning i samme phosphatpuffer.

Hvis elueringen udf0res med puffere med varierende ion-styrke ved at 0ge natriumchloridkoncentrationen opnâs opl0sninger, beriget pâ α-globuliner, β-globuliner og albumin.

EKSEMPEL 6

Premstilling af harpiks

Der gâs frem som i eks. 5/ idet dog siliciumoxidet har en kornst0rrelsesfordeling pâ 100 - 200 μπι, og der anvendes 6,5 g N,N-bis-(epoxy-2,3-propyl)butylamin i stedet for 6,5 g N,N-bis-(epoxy-2,3-propyl)ethylamin.

Den fremstillede ionbytterharpiks bestâr af siliciumoxid overtrukket med en tværbundet polymer, der har den funk-tionelle gruppe -CH2-19-CH2- og med f0lgende sammensætning: C4H9 - carbon 9,2% - nitrogen 2,5% - fikseret polymermængde 3,2 mg/m^ - ionbytterkapacitet 1,1 mækv./g.

Extraktion af proteiner 10 g af den fremstillede ionbytterharpiks anbringes i f0rnævnte kolonne og komprimeres. Harpiksen indstilles successivt med 0,1 N saltsyre, hvorefter der indstilles 13

DK 156577 B

med 0,1 N phosphatpuffer med pH 7,5.

Herefter tilledes i en mængde pâ 80 ml/h, ialt 30 ml af en 1 vægt-% opl0sning i samme phosphatpuffer af pulverformig ultrafiltreret mælkeserum, indeholdende 75 vægt-% protein. Harpiksen vaskes herefter med 100 ml af samme phosphatpuffer.

De udtagne opl0sninger fra kolonnen indeholder fedt-stoffet og lactosen, der var til stede i udgangsopl0sningen.

Proteinerne, lactalbuminer, lactoglobuliiner, serumalbumin og en ringe del immunoglobulüner, der var til stede i udgangsopl0sningen, fikseres ;pâ harpiksen.

Ved eluering med en 0,05 M Mac Ilvaine puffer med pH 4 opnâs en udvinding af de separerede og oprensede proteiner.

EKSEMPEL 7

Extraktion af proteiner 20 g ionbytterharpiks som i eks. 1, men aned en partikel-st0rrelsesfordeling pâ 200-500 μπι, anbringes i en kolon-ne med en diameter pâ 2,5 cm og komprimejres.

Harpiksen indstilles successivt med 0,1 ,11 saltsyre og 0,01 M tris-HCl-puffer med pH 7.

Der gennemhældes med en hastighed pâ 300 ml/h en mængde pâ 600 ml af en opl0sning dannet ud fra 300 ml af samme puffer og 300 ml affedtet mælkeserum med 0,5 vægt-% opl0selige proteiner. Harpiksen vaskes herefter med 100 ml af samme puffer.

14

DK 156577 B

Opl0sningerne, der kommer ud fra kolonnen, indeholder lactose fra udgangsoplpsningen.

Proteinerne, nemlig lactalbumin, lactoglobuliner, serumalbumin og en mindre del af immunglobuliner, der findes i udgangsopl0sningen, er fikseret pâ harpiksen.

De elueres ved at lede en natriumcitratpuffer pâ 0,1 M og pH 7 igennem kolonnen. Den opnâede opl0sning indeholder den totale mængde fixeret protein i en koncen-tration pâ 4 vægt-%.

Fremgangsmâden g0r det muligt at fremstille en blanding af rene proteiner fri for lactose og i en opl0sning langt mere koncentreret end udgangsopl0sningen.

Efter 30 successive fors0g kunne ældning af harpiksen ikke konstateres.

EKSEMPEL 8

Behandlinq af en pepsinopl0sning 3 g harpiks som i eks. 1 anbragtes i en kolonne med en diameter pâ 1 cm.

Harpiksen vaskedes med 100 ml destilleret vand, hvorefter der gennemhældtes 150 ml af en râ pepsin-opl0sning med 20 pepsinenheder pr. ml i en mængde pâ 100 ml/h. Harpiksen vaskedes herefter med 20 ml destilleret vand.

Opl0sningen, der kommer fra kolonnen, og vaskevandet indeholder ingen aktivitet. Al pepsinen er fikseret pâ harpiksen. Urenhederne forbliver i opl0sningen, hvilket en mâling af det t0rre extrakt viser.

15

DK 156577 B

Den fikserede pepsin elueres herefter ved gennemledning af en 1 M natriumchloridopl0sning i en mængde pâ 100 ml/h.

16 ml opl0sning er nok til at udvinde pepsinen i en opl0sning med 170 enheder pepsin pr. ml. Der kan sâledes opnâs en væsentlig koncentrering af opl0sningen.

Harpiksen anvendes igen efter vask med 50 ml destilleret vand. Efter 10 successive fors0g kan ældning af harpiksen ikke konstateres.

EKSEMPEL 9

Fremstilling af ionbytterharpiks 100 g siliciumoxid med en partikelst0rrelsesfordeling pâ 100-200 μπι, og en specifik overflade pâ 25 m^/g, en middelporediameter pâ 140 nm og et porevolumen pâ 1,1 ml/g imprægneres med en opl0sning af 200 ml methylen-chlorid, 24 g acrylsyre, 6 g diethylenglycoldimeth-acrylat og 0,4 benzoylperoxid.

Methy.lenchloridet afdampes ved stuetemperatur og atmosfaeretryk indtil konstant vægt. Herefter opvarmes den imprægnerede siliciumoxid til 80°C i 6 timer til opnâelse af polymérisation.

Den fremstillede siliciumoxid suspenderes herefter i 300 ml vand og opvarmes til kogning i 6 timer. Efter filtrering vaskes produktet med acetone og t0rres i vacuum ved 80°C.

Der opnâs en ionbytterharpiks med funktionelle grupper af typen -COOH, med f0lgende sammensætning: - carbonindhold 10,55 % 16

DK 156577 B

- fikseret polymermængde 7,2 mg/m2 - ionbytterkapacitet 1,05 mækv./g

Behandling af en lysozymoplpsning 10 g af den fremstillede ionbytterharpiks anbringes i en kolonne med en diameter pâ 1 cm og holdes komprimeret, hvorefter harpiksen bringes pâ NH 4-form ved gennem-ledning af 2 liter vandig 0,5 M ammoniumacetatopl0sning indstillet med puffer til pH 8,2.

Herefter indstilles harpiksen til pH 6,5 med 100 ml 0,02 M tris-maleinsyre-puffer.

Der ledes en opl0sning af 1 vægt-% lysozym i samme puffer igennem kolonnen i en mængde pâ 180 ml/h, indtil mætning af kolonnen. Dette svarer til ca. 200 ml opl0sning. Harpiksen vaskes herefter med 100 ml af en tris-maleinsyre-puffer med pH 8,2.

Den fikserede lysozym elueres herefter ved gennemledning af en 1 H natriumchloridopl0sning i samme puffer, i en mægnde. pâ 180 ml/h. 50 ml af opl0sningen er nok til at udvinde lysozymet i en opl0sning med en koncentration pâ 2,5 vægt-%.

Det kan konkluderes, at ionbytteren har en kapacitet med hensyn til lysozym pâ 125 mg/g, og at det er muligt at koncentrere en lysozymopl0sning.

EKSEMPEL 10

Fremstilling af ionbytterharpiks 100 g siliciumoxid med en partikelst0rrelsesfordeling pâ 100-200 ym, en specifik overflade pâ 37 m2/gf en 17

DK 156577 B

middelporediameter pâ 120 nm og et porevolumen pâ 0,95 ml/g imprægneres med en opl0sning af 150 ml methylenchlorid, 60 ml destilleret styren, 20 ml vinyltriethoxysilan og 0,5 g azo-bis-isobutyronitril.

Methylenchloridet afdampes ved stuetemperatur og atmosfæretryk indtil konstant vægt, hvorefter det imprægnerede siliciumoxid opvarmes til 120°C i 6 timer til udvirkning af tværbindingen.

Produktet suspenderes herefter i 300 ml xylen og opvarmes til kogning i 6 timer. Efter t0rring vaskes produktet i acetone og t0rres ved 80°C.

50 g af det fremstillede modificerede siliciumoxid suspenderes i 500 ml chloroform, og der tilsættes drâbe for drâbe 50 g HSO3CI opl0st i 50 ml chloroform. Der frigives saltsyredampe. Efter at tilsætningen er tilendebragt, omr0res blandingen og opvarmes til 50°C i 4 timer.

Efter tprring, vask med vand indtil neutral reaktion, herefter med acetone og tprring under vacuum ved 80°C opnâs en ionbytterharpiks med en funktionel gruppe: -SO3H, der har fplgende sammensætning: - carbonindhold 4 % - svovlindhold 1,4 % - fikseret polymermængde 2,8 mg/m2 - ionbytterkapacitet 0,43 mækv./g

Extraktion af hæmoglobin 10 g af denne ionbytterharpiks anbringes i en kolonne med en diameter pâ 1 cm, hvorefter harpiksen indstilles til pH 6,5 med en 0,02 M phosphatpuffer. Der tilledes 18

DK 156577 B

500 ml af en 0,2 vægt-% hæmoglobinopl0sning i samme puffer, i en mængde pâ 100 ml/h. Hæmoglobinen adsorberes pâ ionbytteren. Opl0sningen udtaget fra kolonnen indeholder ikke hæmoglobin og er sâledes renset.

Den adsorberede hæmoglobin elueres ved gennemledning af en 0,5 M ammoniumcarbonatopl0sning, hvorefter kolonnen vaskes successivt med 300 ml 0,1 N natriumhydroxid og 50 ml 1 N saltsyre f0r anvendelse igen.

EKSEMPEL 11

Behandlinq af valle 20 g af en ionbytterharpiks analog med den i eks. 1, anbringes i en kolonne med en diameter pâ 2,5 cm (kolonne nr. 1).

10 g af en harpiks som i eks. 9. anbringes i en kolonne med en diameter pâ 2,5 cm (kolonne 2).

De to koïonner anbringes i sérié, og harpiksindholdene vaskes med 500 ml vand.

500 ml valle indstillet til pH 7»5 ved tilsætning af 0,1 N natriumhydroxid filtreres for at fjerne uopl0selige bestanddele, og ledes herefter igennem kolonne nr. 1 og kolonne nr. 2 i en mængde pâ 300 ml/h.

En pr0ve pâ udfældning af proteiner med trichloreddike-syre viser, at valle, der kommer fra kolonne nr. 2, ikke mere indeholder protein. Harpiksindholdene i de to koïonner vaskes ved gennemledning af.100 ml vand.

Proteinerne: Lactalbumin, lactoglobuliner, serumalbumin og en meget ringe del immunglobuliner, der findes i 19

DK 156577 B

udgangsopl0sningen, er fikseret pâ harpilltsen i kolonne nr. 1. De elueres som beskrevet i eks. 7=.

Proteinerne fikseret pâ harpiksen i kolonne nr. 2 er . især immunoglobuliner, der ikke er fikseret pâ harpiksen i kolonne nr. 1. De elueres ved gennemledning af en 1 M ammoniumcarbonatopl0sning. Den opnâede opl0sning indeholder immunoglobuliner i en koncentration pâ ca. 3 vægt-%. Immunoglobulinerne udg0r ca. 16 ^ægt-% af hele udgangsopl0sningens proteinmængde.

Kolonnerne vaskes herefter ved gennemledæfing af 500 ml vand f0r de anvendes igen.

Efter 10 successive fors0g kunne ældning af harpiksindholdene ikke konstateres.

EKSEMPEL 12

Extraktion af proteiner fra 01 60 g af en ionbytterharpiks som i eks. 9 anbringes i en kolonne med en diameter pâ 2,5 cm, hvorefiter der vaskes med 250 ml vand.

3 liter 01, der ikke er klaret, hældes i en mængde pâ 100 ml/h igennem kolonnen. 011et, der kontmer ud af kolonnen, viser ikke noget bundfald ved tilsætning af picrinsyre, og har samme karakteristika som klaret 01.

Produkterne fikseret pâ harpiksen er især proteiner. De elueres ved gennemledning af 400 ml o,l 13 saltsyre.

Harpiksen vaskes ved gennemledning af 250 ml vand f0r anvendelse igen.

Claims

1. Fremgangsmâde til séparering af proteiner, hvorved en proteinopl0sning bringes i kontakt med en ionbytterharpiks, kendetegnet ved, at ionbytterharpiksen bestâr af en por0s mineralsk bærer med en partikelst0rrelsesfordeling mellem 4 μπι og 5 mm, en specifik overflade pâ 5-150 m2/g, en porediameter pâ 50-250 nm, et porevolumen pâ 0,4-2 ml/g, hvilken bærer er overtrukket med h0jst 15 mg/m2 af en film af tvær-bundet polymer, som indeholder eller bærer enten anionbyttergrupper, repræsenteret ved tertiære aminer eller kvaternære ammoniumsalte, eller kationbytter-grupper repræsenteret ved syregrupper, og som har en ionbytterkapacitet pâ mindre end 2 mækv./Q·

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at den mineralske bærer er et metaloxid fortrinsvis titanoxid, aluminumoxider eller siliciumoxider.

3. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at anionbyttergrupperne er repræsenteret ved formlerne -CH2~N-CH2 - eller -CH2-n(+)-(R)3X^-^ R hvor R , der kan være ens eller forskellige, betegner en alkyl eller hydroxyalkylgruppe med 1-4 carbonatomer, og X er en mineralsk eller organisk anion.

4. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at kationbyttergrupperne er carboxylsyre-, sulfonsyre- eller phosphonsyregrupper.

5. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at den tværbundne polymer er fremkommet ved polymérisation af epoxyforbindelser i nærværelse af DK 156577 B polyaminer; ved polymérisation af blandinger af for-maldehyd og urinstof, melamin, polyaminer eller phenoler; ved polymérisation af blandinger af vinyl-monomere, sâsom vinylpyridin, styren og derivater deraf, acrylsyre, methacrylsyre eller vinylbenzoesyre med poly-funktionelle monomère, sâsom diacrylat eller dimethacry-lat af mono- eller polyalkylenglycol, divinylbenzen, vinyltrialkoxysilan, vinyltrihalogensilan og bis-methylenacrylamid.

6. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at proteinerne, ogsâ omfattende pol$peptider og enzymer, er repræsenteret ved albumin, laetalbuminer, ovalbumin, serumalbumin, hæmoglobin, a, γ-globuliner, lactoglobuliner, fibrinogen, urease, trypsin, lysozym, pepsin, proteaser og cytochrom.

7. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at proteinopl0sningerne, der behandles, er repræsenteret ved mælkeserum, 01, blod, organextrakter og al slags industrispildevand.

8. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at et eller flere 0nskede proteiner fikseres pâ ionbytterharpiksen, og herefter elueres.

9. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at det 0nskede protein forbliver i opl0sning, og at de andre proteiner fra opl0sningen fikseres pâ ionbytterharpiksen.

10. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at aile proteinerne fikseres, og at <opl0sningen renses.