NO145508B

NO145508B - Anvendelse av ionebytterharpiks av poroest uorganisk baerermaterial med overtrekk av fornettet polymermaterial til separering av proteiner

Info

Publication number: NO145508B
Application number: NO762959A
Authority: NO
Inventors: Francois Meiller; Bernard Mirabel
Original assignee: Rhone Poulenc Ind
Priority date: 1975-08-28
Filing date: 1976-08-27
Publication date: 1981-12-28
Also published as: ES451047A1; SE426911B; BR7605661A; DK156577C; AU500134B2; NO762959L; IT1066221B; DK156577B; US4100149A; YU209676A; IE43536L; DE2638764C3; AU1721776A; SE7609479L; SU688124A3; NZ181884A; CA1069843A; NL7609562A; MX4333E; AR209193A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en ionebytterharpiks bestående av et porøst uorganisk bærermaterial med kornstørrelse 4 yum til 5 mm, spesifikk overflate 5-150 m 2/g, porediameter 50-250 nm, porevolum 0,4-2 ml/g og et overtrekk i en mengde på mindre enn 15 mg/m 2 av fornettet polymermaterial som enten inneholder anionbyttergrupper som f.eks. tertiære amino- eller kvaternære ammoniumsaltgrupper eller inneholder syregrupper som kationbyttergrupper og fremviser en ionebytterkapasitet mindre enn 2 mekv/g, til separering av proteiner.

Det er kjent å separere proteiner ved ionebytting ved anvendelse av cellulose eller dekstran, hvorpå det er fiksert enten tertiære aminer eller kvaternært ammonium, eller syrefunksjoner. I alle fall er disse ionebyttere uten mekaniske egenskaper, og kan følgelig ikke anvendes i kolonner, idet deres volum underkastes modifikasjoner i avhengighet av ionestyrken og pH i det anvendte miljø. Disse ionebyttere er videre biologisk nedbrytbare og kan ikke steriliseres.

De ionebytterharpikser som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse frembyr ikke disse ulemper, de har gode mekaniske egenskaper, er ikke følsomme overfor ionestyrken eller pH i det anvendte miljø, og de er heller ikke biologisk nedbrytbare og de kan steriliseres. De tillater, videre oppnåelse av meget rene proteiner.

Britisk patentskrift 871.541 anviser ionebyttere inneholdende inerte bærere, uten adsorberende egenskaper, med en stor spesifikk overflate, og som ikke er porøse i seg selv. Porøsiteten av ionebytterne oppnås ved hjelp av polymerene og denne porøsitet varierer med graden av for-netting.

I motsetning hertil inneholder ionebytterne som anvendes

i henhold til den foreliggende oppfinnelsen adsorberende bærere med liten spesifikk overflate (lavere enn 150 m 2/g) som er porøse i seg .selv. Polymeroverflåtene bærer ione-byttergruppene men innvirker ikke på porøsiteten.

Belegget i henhold til det motholdte britiske patentskrift påført på bærerne i henhold til den foreliggende oppfinnelse ville tette porene.

Sammensetningen av ionebytterne som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse gir dem en overlegen protein-kapasitet i forhold til produktene i henhold til.det britiske patentskrift.

US-patentskrift 2.739.906 beskriver ionebyttere tildannet av en ikke-porøs bærer med tilsynelatende densitet 1,2 g/cm<3 >og som er inert eller gjort inert ved anvendelse av silaner. På bæreren påføres en polymer.

I motsetning hertil tildannes ionebytterne som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse på en porøs bærer med tilsynelatende densitet lik eller lavere enn 0,8 g/cm og som ikke er inert.

Bæreren er dekket med en polymerfilm ved hjelp av impreg-nering med monomer som deretter polymeriseres.

US-patentskrift 2.809.943 vedrører ionebyttere som er forskjellig fra ionebytterne som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse av samme grunner som omhandlet under omtalen av US-patentskrift 2.739.906.

Ionebytterne i henhold til det nevnte US-patentskrift fremstilles spesielt for anvendelser hvor porøse ione-byttere er ineffektive.

DE-OS 1 952.222 omhandler ionebyttere tildannet fra en ikke-porøs uorganisk kjerne dekket ved hjelp av elektrostatisk adsorpsjon (lite stabil binding) med flere monomolekyl-

ære lag av forskjellige mikropartikler (uorganiske eller organiske) som danner en adsorberende porøs skorpe, med lav spesifikk overflate (0,5 m 2/g i eksempel 1 side 15)

og følgelig er deres ionebytterkapasitet lav.

I motsetning hertil dannes ionebytterne som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse av en porøs bærer med bestemte egenskaper, belagt med en -tynn polymerfilm inneholdende ionebyttergrupper, idet filmen er bundet til bæreren ved hjelp av meget stabile kovalente.bindinger. Den spesifikke overflate er mellom 5 og 150 m 2,/g som gir høye adsorpsjonskapasiteter for proteiner.

Ionebytterne i henhold til det nevnte DE-AS 1.951.222 anvendes ved kromatografering for analytisk separasjon. Hvis disse ionebyttere anvendes for separering av proteiner medfører arbeidsbetingelsene ødeleggelse av ionebytteren.

DE-OS 2.433.409 beskriver ionebyttere tildannet av en porøs bærer hvorpå det er podet et silisium-derivat inneholdende ionebyttergrupper. Det dreier seg om silisium-derivater som ikke har noe til felles med den foreliggende oppfinnelse. Videre hvis ionevekslerne i henhold til det nevnte DE-OS anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse blir de silisiumholdige podeprodukter eluert sammen med proteinene.

DE-OS 2.319.581 vedrører en ionebytter av fornettet styren-polymer inneholdende nøytraliserte sulfonsyregrupper.

En slik polymer har hverken de mekaniske egenskaper eller porøsitet som ionebytterne som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Videre anvendes ionebytteren i henhold til det nevnte DE-OS for kromatografisk fraksjonering av laktoserum, en teknikk som er meget forskjellig fra separering av proteiner ved fiksering.

Ingen av de nevnte publikasjoner beskriver ionebyttere identiske med ionebytterne som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse og ingen av de motholdte ione-byttere tillater separering av proteiner med betingelser og resultater som ved den foreliggende oppfinnelse.

Som porøs uorganisk bærer kan anvendes metalloksyder som f.eks. titanoksyd, aluminiumoksyd og spesielt silisiumoksyd.

Disse bærere har midlere porediametre på 500*10 — 1 0m til ;2500 • 10~<l0>mog foretrukket mellom 600«10~10 og ISOO-IO^m^en spesifikk overflate på 5 til 150 m /g og foretrukket 20 til ;2 ;-50 m /g og en kornstørrelse mellom 4 yum og 5 mm, alt etter den påtenkte anvendelse. De fineste partikler anvendes ;for analytiske formål og de større partikler for prepara-tive formål. ;De funksjonelle grupper, nemlig tertiære aminer eller kvaternære ammoniumsalter, er representert ved de generelle ;formler ;hvori R, som er like eller forskjellige, representerer en alkyl- eller '., hydroksyalkyl-gruppe med 1.-4 karbonatomer og X.er et uorganisk eller organisk anion, som f.eks. klorid, sulfat, nitrat, fosfat, sitrat. De sure funksjonelle grupper, henhv. karboksyl-syre,.sul-fonsyre eller fosfonsyre tilsvarer de generelle formler ;Disse funksjonelle grupper danner en del av den nettdahnede polymerkjede eller er fiksert til den nettdannede polymer som dekker hele overflaten av bæreren. ;De fornettede polymerer som dekker overflaten av den uorganiske bærer er produkter som i seg selv er kjent, oppnådd ved hjelp av vanlige konvensjonelle metoder for polymerisering. De fremstilles ved å gå ut fra monomérer som er i stand til nettdannelse i seg selv, eller med en annen monomer, eventuelt i nærvær av en katalysator. Blant disse monomérer kan nevnes epoksy-forbindelser som nettdannes med polyaminer som katalysatorer. Monomérer, som fornettes ved polykondensasjon uten katalysator med formaldehyd som f.eks. urea, melamin, polyaminene, fenolene. Vinylmonomer-ene som f.eks., vinylpyridin, styren og. dets derivater, akrylsyre, metakrylsyre, vinylbenzozyre som fornettes med polyfunksjonelle monomérer som diakrylat eller dimetakrylat av mono- eller polyalkylenglykol, divinylbenzen, vinyltrialkoksysilan, vinyltrihalogenosilan, bismetylen-akrylamid, i nærvær av en initiator som frigir radikaler som f .eks. organiske peroksyder og azonitrilene eller i nærver av ultrafiolette stråler. ;For oppnåelse av belegget på den uorganiske bærer ved ;hjelp av den fornettede polymer, impregneres bæreren med en oppløsning av den eller de angjeldende monomérer og eventuelt katalysator i et løsningsmiddel, som tillater en god fordeling av monomerene over hele overflaten av den uorganiske bærer, idet løsningsmidlet deretter avdampes og monomerene formettes ved hjelp av kjente metoder. Som løsningsmiddel anvendes alle produkter som løser monomerene og katalysatoren, med foretrukket lavt kokepunkt for lettere avdamping. ;Som eksempel nevnes metylenklorid, etyleter, benzen, aceton, etylacetat. ;En fremgangsmåte som er spesielt egnet for fremstilling av en anion-bytter ved belegging av bærere med epoksyforbind-else er beskrevet i den franske patetansøkning 74.29702 inngitt 30. august 1974 med tittel: "Modifiserte uorganiske bærere". ;I det tilfelle hvor den fornettede polymer på overflaten ;av den uorganiske bærer ikke i sin kjede inneholder funksjonelle grupper, som definert ovenfor, er det nødvendig å modifisere denne. Dette er spesielt tilfelle med fornettede polymerer på basis av styren og derivater, polymerer av formaldehyd med urea, melamin, polyaminer, fenoler. ;Denne modifikasjon bestar i tilfellet med polymerer av styren eller fenol-formaldehyd i på polymeren å fiksere enten karboksylsyregrupper, sulfonsyregrupper eller ±os-fonsyregrupper, ved hjelp av kjente fremgangsmåter, eller klormetylgrupper som deretter bringes til å reagere med et sekundært eller tertiært amin, idet denne reaksjon gjennomføres på i og for seg kjent måte. ;For fiksering av klormetylgrupper på polymeren er det for-delaktig, i tilfellet med polymerer av styren, å dispergere den uorganiske bærer belagt med polymeren i varm klormetyleter, i nærvær av en Lewis-syre. I tilfellet med en fenol-formaldehydharpiks kan man f.eks. dispergere den uorganiske bærer belagt med polymeren i epiklorhydrin og foreta en omsetning i varm tilstand. ;Denne modifisering, i tilfellet med polymerer av formaldehyd med polyaminer, urea, eller melamin består i å omdanne de primære aminer som foreligger i kjeden til tertiære aminer eller salter av kvaternært ammonium ved hjelp av konvensjonelle metoder,, som f.eks. ved reaksjon med et alkylsulfat eller et alkylhalogenid. ;Under operasjonen med belegging av den uorganiske bærer er mengden av den eller de anvendte monomérer slik at mengden av fornettet polymer som inneholder funksjonelle grupper, fordelt over overflaten av den uorganiske bærer, er mindre enn 15 og foretrukket mellom 1 og 8 mg/m <2>. ;De uorganiske bærere som er belagt med de formettede polymerer med således oppnådde funksjonelle grupper har en ionebytterkapasitet på mindre enn 2 milliekvivalenter/g og foretrukket mellom 0,3 og 1,2 milliekvivalenter/g. ;De oppnådde ionebytterharpikser er egnet for separering ;av alle proteiner som er oppløselige i vandig miljø, omtrent ved deres isoelektriske punkt. ;Blant disse proteiner, omfattende polypeptider og enzymer, kan blant andre nevnes albumin, laktalbumin, ovalbumin, serumalbumin, hemoglobin, alfa-, beta- og gamma-globuliner, laktoglbbuliner, fibrinogen, urease, trypsin, lysozym, pepsin, proteaser, cytokrom. ;Ionebytterharpiksene tillater meget lett separering.av proteiner fra deres løsninger, som laktoserum, øl, blod, organiske ekstrakter og alle industrielle utstrømninger, av vann fra slaktehus, næringsmiddelindustri, møller, idet de kan anvendes for rensing av de nevnte utstrømninger som et ledd i kampen mot forurensninger. ;Separeringen oppnås ved en temperatur, en ionestyrke og en pH som er forlikelig med det eller de angjeldende proteiner og ved å bringe oppløsningen som skal behandles, ;i kontakt med ionebytterharpiksen, valgt i avhengighet av betingelsene for separeringen. Det foregår da en fiksering på ionebytterharpiksen, enten av det ønskede protein, eller av det eller de andre proteiner som inneholdes i oppløsa ningen, eller av alle proteinene i oppløsningen. ;Separeringen kan likeledes oppnås under de samme betingelser ved å bringe oppløsningen som skal behandles i rekkefølge i kontakt med en eller flere anion- og/eller kation-bytter-harpikser. Det foregår da en selektiv fiksering av proteinene i oppløsningen på hver harpiks. ;I det tilfelle hvor det ønskede protein fikseres på en harpiks, ved å gå ut fra en proteinholdig løsning, separeres proteinet deretter ved eluering med en oppløsning med en pH og/eller en ionestyrke som er forskjellig fra fikserings-løsningen, men samtidig forlikelig med proteinet. Man oppnår da ikke bare separering av proteinet fra oppløsningen, men samtidig dets rensing og konsentrering. På denne måte kan man f.eks. separere og konsentrere albumin, pepsin, proteiner fra laktoserura med en anion-bytterharpiks og lysozym med en kation-bytterharpiks. ;I det tilfelle hvor det ønskede protein forblir i den behandlede proteinløsning og hvor de andre proteiner i blandingen fikseres, oppnås separeringen av det ønskede protein fra de andre proteiner såvel som dets rensing. Eluering av de fikserte proteiner fører eventuelt til en selektiv separering av de nevnte proteiner og selektiv konsentrering av dem. Dette er tilfelle bl.a. for gamma-globulin med en anionbytterharpiks. ;I det tilfelle hvor flere ønskede proteiner fikseres samtidig på en harpiks, medfører eluering ved forskjellig pH og/eller ionestyrke til at fikseringsløsningen gir en separering av proteinene fra deres oppløsning og til deres konsentrering. Eluering med oppløsninger med ønskede pH og/eller ionestyrke medfører foruten selektiv separering rensing og konsentrering. Dette er særlig tilfelle med serum fra mennesker. ;I det tilfelle hvor proteinene skal fjernes, fikseres de ;på en harpiks ved å gå ut fra deres oppløsning. Man oppnår da oppløsninger hvorfra proteinene er fjernet, slik at oppløsningene renses. ;Elueringen av de fikserte proteiner tillater fornyet anvendelse av harpiksen. Dette er tilfelle spesielt ved klaring av øl og behandling av oppløsninger som inneholder hemoglobin, med kationbytterharpikser. ;Separeringen kan gjennomføres med identiske resultater uan-sett om man arbeider diskontinuerlig eller kontinuerlig. ;Ved kontinuerlig drift tillater harpiksene en lett fylling av kolonnen, en stor gjennomstrømning og en lett eluering. ;De oppnådde resultater er praktisk uavhengig av konsentrasjonen, av den behandlede løsning, men er avhengig av natu-ren av ionebyttergruppen i harpiksen, pH,Lonestyrken og volumstrømmen av oppløsningene som skal behandles såvel som av elueringsløsningen. ;Ionebytterharpiksene av nevnte type er anvendelig innen næringsmiddelindustrien, spesielt for fremstilling av diett-næringsmidler, farmasøytiske og veterinær-produkter. ;I det følgende gis noen eksempler som skal illustrere oppfinnelsen. ;EKSEMPEL 1: ;l!£§2!§£iiii29_§Y_i2Il§^Ytterhar2iks. ;100 g silisiumoksyd med en kornstørrelse mellom 100 og 200 um, en spesifikk overflate på 24 m 2/g, en midlere porediameter på 1400- 10 -1 0m, og et porevolum på 1 ml/g tørkes ved 150°C under redusert trykk i 5 timer. ;Det tørkede silisiumoksyd som oppnås innføres i en opp-løsning av 250 ml metylenklorid, 60 ml destillert styren, 20 ml vinyltrietoksysilan og 0,5 g azobis-isobutyronitril. ;Metylenkloridet avdampes ved omgivelsenes temperatur og deretter oppvarmes det impregnerte silisiumoksyd ved 120°C ;i 6 timer, under et trykk på 3 bar, for å oppnå formetning. ;Silisiumoksydet bringes deretter i suspensjon i 300 ml xylen og oppvarmes til koking i 2 timer. Etter filtrering vaskes silisiumoksydet med aceton og tørkes deretter. ;Analysen gir et karboninnhold på 4 vektprosent i forhold til overtrukket silisiumoksyd. 50 g av det oppnådde silisiumoksyd bringes i suspensjon i 180 g klormetyleter, inneholdende 6 g tinnklorid, hvoretter blandingen oppvarmes under tilbakeløp i 4 timer i yannfritt miljø. ;Etter avkjøling avsuges silisiumoksydet på filteret, vaskes med 200 ml av en blanding av 50-50 dioksan-vann inneholdende 10 ml saltsyre, deretter med vann til nøytral reaksjon og tørkes tilslutt. ;Karboninnholdet er da 4,1% og klorinnholdet 1,90%. ;Det oppnådde produkt bringes i suspensjon i 150 ml av en vandig løsning med 30% trimetylamin som det holdes i kontakt med i 8 døgn ved omgivelsenes temperatur. ;Etter avsuging på filter og vasking oppnås en ionebytterharpiks inneholdende funksjonelle grupper. som har følgende egenskaper: ;§§handling_av_en_albuminl^snin2^;10 g av den oppnådde ionebytterharpiks anbringes i en kolonne med en cm diameter og holdes sammentrykket, hvoretter harpiksen innstilles til pH 6,5 med en fosfatbuffer 0,01 m. ;Man perkolerer en albuminløsning med en vektprosent konsentrasjon i den samme buffer, i en mengde på 180 ml/timer inntil metning av kolonnen, tilsvarende omtrent 200 ml løs-ning. Harpiksen vaskes deretter med 100 ml av den samme buffer. ;Det fikserte albumin elueres deretter ved perkolering med en oppløsning av 1 m NaCl i den samme buffer, i en mengde av 180 ml/time. 45 ml av oppløsningen tillater gjenvinning av albumin i oppløsning med 3,3 vektprosent. ;Det konstateres at harpiksen har en kapasitet for albumin . på 150 mg/g og tillater konsentrering av albuminløsningen ;Den samme operasjon gjentas 30 ganger og ingen utvidelse eller aldring av harpiksen observeres. ;EKSEMPEL 2 ;Eksempel 1 gjentas med 0,2 vektprosent albuminløsning i stedet for en prosent. ;De samme resultater oppnås, dvs. man oppnår den samme konsentrasjon av albumin og dette representerer en konsentrering av den behandlede oppløsning. ;EKSEMPEL 3. ;Eksempel 1 gjentas, men elueringen av proteinet gjennom-føres med en sitratbuffer 0,05 M, pH 6,5. Det oppnås 59 ml albuminløsning 2,5 vektprosent. ;Dette forsøk viser innvirkningen av arten av eluerings-bufferløsningen på konsentrasjonen av den oppnådde løsning. ;EKSEMPEL 4 ;Behandlingen gjennomføres med en oppløsning av albumin på samme måte som i eksempel 1, men man anvender 41 g ionebytterharpiks i en kolonne med 1 cm diameter og en eluering-mengde på 80 ml/time istedet for 180 ml/time. ;Konsentrasjonen av den oppnådde albuminløsning er 7 vektprosent. Dette viser at ved å øke den anvendte høyde av kolonnen og nedsette elueringstakten øker konsentrasjonen av den oppnådde løsning. ;EKSEMPEL 5 ;<F£§ro§tilling_av>_<h>arjDik^eni;I 150 ml metylenklorid inneholdende i løsning 6,5 g N,N, bis (2,3r epoksy propyl)- etylamin og 3 g trietylentetra-min innføres 50 g av et silisiumoksyd med en granulometri på 40 til 100 yum, en spesifikk overflate på 37 m 2/g, en porediameter på 1100* 10 ^m og et porevolum på 1.05 ml/g.

Metylenkloridet avdampes deretter ved omgivelsenes trykk.

Det impregnerte silisiumoksyd oppvarmes ved 60°C i 60 timer for oppnåelse av nettdannelsen, vaskes med kokende vann og deretter med aceton.

Den oppnådde ionebytterharpiks utgjøres av silisiumoksyd overtrukket med en fornettet polymer inneholdende de funksjonelle grupper

med følgende egenskaper: 10 g av den oppnådde ionebytterharpiks anbringes i en kolonne med 1 cm diameter og holdes sammentrykket. Harpiksen innstilles i likevekt med 0,1 N saltsyre og deretter med 0,02 M fosfatbuffer, pH 6,5.

Man perkolerer 20 ml av en løsning av av-fettet og fryse-tørket jtenneskeserum med en vektprosent i den samme fosfat-buf f er, i en mengde på 100 ml/time. Harpiksen vaskes deretter med 50 ml av den samme fosfatbuffer.

Den oppløsning som kommer ut fra kolonnen innholder elektro-foretisk rent gamma-globulin som var tilstede i utgangs-løsningen. De andre proteiner, alfa-globuliner, beta-globuliner og albumin, som likeledes var tilstede i utgangs-løsningen, er fiksert på harpiksen. De gjenvinnes ved eluering med en oppløsning av 3 M NaCl i den samme fosfatbuffer.

Hvis elueringen gjennomføres med buffere med økende ionestyrke, ved økning av konsentrasjonen av NaCl, oppnås oppløsninger anriket på alfa-globuliner, beta-globuliner og albumin.

EKSEMPEL 6

E^É5)§tilling_av_harp_iksen.

Man går frem som i eksempel 1, men med et silisiumoksyd med en kornstørrelse mellom 100 og 200 um og med 6,5 g N,N-bis (2,3- epoksy-propyl) butylamin istedet for 6,5 g N, N-bis (2/3-epoksy-oropyl ) etylamin.

Den oppnådde ionebytterharpiks utgjøres av silisiumoksyd overtrukket med en formettet polymer inneholdende funksjonelle grupper

og med følgende egenskaper:

E?SStrakS2gn_av_proteiner.

0 10 g av den oppnådde ionebytterharpiks anbringes i en kolonne med diameter 1 cm og holdes sammehtrykket .• Harpiksen innstilles i likevekt først med 0,1 N saltsyre og deretter med 0,01 M fosfatbuffer, pH 7,5..

Man perkolerer i en mengde på 80 ml/time 30 ml av en opp-løsning med 1 vektprosent i den samme fosfatbuffer ultra-filtrert laktoserum i pulverform, inneholdende 75 vektprosent proteiner. Harpiksen vaskes deretter med 100 ml av den samme fosfatbuffer.

11

Oppløsningen som kommer ut fra kolonnen inneholder fett-substanser og laktose inneholdt i utgangsoppløsningen.

Proteinene, laktalbuminene, laktoglobulinene, . serumalbumi-net og en liten mengde immunoglobuliner, tilstede i utgangs-oppløsningen, er fiksert på harpiksen. Ved eluering med en buffer Mac Ilvaine 0,05M, pH 4, gjenvinnes separerte og rensede proteiner.

EKSEMPEL 7

51S§££§ks;ion_ay_p^oteineri

20 g av en ionebytterharpiks tilsvarende som i eksempel 1, men med granulometri 200 til 500 um, anbringes i en kolonne med diameter 2,5 cm og holdes sammentrykket.

Harpiksen innstilles i likevekt først med 0,1 N saltsyre

og deretter med 0,01 M tris-HCl-buffer, PH 7.

Man perkolerer i en mengde på 300 ml/time 600 ml av en første oppløsning dannet av 300 ml av den samme buffer tris-HCl og 300 ml av-fettet laktoserum med 0,5 vektprosent av oppløselige proteiner. Harpiksen vaskes deretter med 100 ml av den samme buffer.

De oppløsninger som kommer ut fra kolonnen inneholder laktose tilstede i utgangsoppløsningen.

Proteinene, nemlig laktalbuminer, laktoglobuliner, serumalbumin og en liten mengde immunoglobuliner, tilstede i utgangsoppløsningen, er fiksert på harpiksen. De elueres ved å sende en strøm gjennom kolonnen av 0,1 M natrium-sitratbuffer, pH 7. Den oppnådde løsning inneholder alle de fikserte proteiner med en konsentrasjon på 4 vektprosent.

Denne fremgangsmåte tillater oppnåelse av en blanding av rene proteiner, uten laktose, i en oppløsning som er mye mer konsentrert enn utgangsoppløsningen.

Etter 30 etterfølgende operasjoner kunne det ikke iakttas

noen aldring av harpiksen.

EKSEMPEL 8

3 g av en ionebytterharpiks tilsvarende som i eksempel 1 anbringes i en kolonne med 1 cm diameter.

Harpiksen vaskes med 100 ml destillert vann og deretter perkoleres 100 ml av en løsning av råpepsin med 20 enheter pepsin pr. ml, i en mengde på 100 ml/timer gjennom kolonnen. Harpiksen vaskes deretter med 20 ml destillert vann.

Den oppløsning som kommer ut fra kolonnen og vaskevannet har ikke noen aktivitet idet alt pepsin er fiksert på harpiksen. Forurensningene forblir i oppløsningene, påvist ved bestemmelser i tørrstoffekstrakten.

Det fikserte pepsin elueres deretter ved perkolering av en oppløsning M NaCl i en mengde på 100 ml/time. 16 ml løsning tillater gjenvinning av pepsinet i oppløsning med 170 enheter pepsin/ml.

Den vesentlige større konsentrasjon av den oppnådde løs-ning er klar.

Harpiksen anvendes på nytt etter vasking med 50 ml destillert vann.

Etter 10 påfølgende operasjoner kunne man ikke konstatere noen aldring av harpiksen.

EKSEMPEL 9

EE§l?§£iiii22_5Y_i20§Y§l£5i§El25£Ei?Ss.i

100 g silisiumoksyd med en kprnstørrelse mellom 100 og 200 ^um, en spesifikk overflate på 25 m 2 /g, en midlere porediameter på 1400 Å og et porevolum på 1,1 ml/g impregneres med en oppløsning av 200 ml metylenklorid, 24 g akrylsyre, 6 g dietylenglykol-dimetakrylat og 0,4 g benzoylperoksyd.

Metylenkloridet avdampes ved omgivelsenes temperatur og atmosfæretrykk inntil konstant vekt. Deretter oppvarmes det impregnerte silisiumoksyd ved 80°C i 6 timer for polymerisering.

Silisiumoksydet bringes déretter i suspensjon i 300 ml vann og oppvarmes til koking i 6 timer. Etter filtrering vaskes silisiumoksydet med aceton og tørkes deretter under vakuum ved 80°C.

Det oppnås en ionebytterharpiks inneholdende funksjonelle grupper COOH med følgende egenskaper:

§§l}åD^iiG2_§Y_§Q_2EEi£§2i52_§Y_iY§°5Y.5}.L

10 g av den oppnådde ionebytterharpiks anbringes i en kolonne med 1 cm diameter og holdes sammentrykket, hvoretter harpiksen bringes til formen NH^<+> ved perkolering av 2 1 av en vandig løsning av ammoniumacetat 0,5 m puffet til pH 8,2.

Harpiksen innstilles deretter i likevekt ved pH 6,5 med 100 ml tris-maleinsyrebuffer 0,02 m.

Man perkolerer en oppløsning av lysozym en vektprosent i den samme buffer, i en mengde på 180 ml/time, til metning av kolonnen, tilsvarende omtrent 200 ml oppløsning. Harpiksen vaskes deretter med 100 ml tris-maleinsyrebuffer 0,02 m, pH 8,2.

Det fikserte lysozym elueres deretter ved perkolering av en løsning av 1 m NaCl i den samme buffer, i en mengde på 18+ ml/time. 50 ml løsning tillater gjenvinning av lysozymet i oppløsning med 2,5 vektprosent.

Dette viser at ionebytterharpiksen har en kapasitet for lysozym på 125 mg/g og tillater konsentrering av lysozym-løsninger.

EKSEMPEL 10

EESrostilling^ay^onebYtterhargiks^

100 g silisiumoksyd med en karnstørrelse på mellom 100 og 200 um, en spesifikk overflate på 37 m 2/g, en midlere porediaméter på 1200 Å og et porevolum på 0,95 ml/g impregneres med en oppløsning av 150 ml metylenklorid, 60 ml destillert styren, 20 ml vinyltrietoksysylan og 0,5 g azobis-isobutyronitril.

Metylenkloridet avdampes ved' omgivelsenes temperatur og atmosfæretrykk til konstant vekt, hvoretter det impregnerte silisiumoksyd oppvarmes ved 120°C i 6 timer for oppnåelse av nettdannelsen.

Silisiumoksydet bringes deretter i suspensjon i 300 ml xylen og oppvarmes til koking i 6 timer. Etter avsuging på filter vaskes silisiumoksydet med aceton og tørkes deretter ved 80°C. 50 g av det oppnådde modifiserte silisiumoksyd bringes i suspensjon i 500 ml kloroform og 50 g HSO^Cl i oppløsning i 50 ml kloroform tilsettes dråpevis. Det unnviker saltsyre. Etter innføringen oppvarmes den omrørte blanding ved 50°C i 4 timer.

Etter avsuging på filteret, vasking med vann til- nøytral reaksjon og deretter med aceton og tørking under vakuum ved 80°C oppnås en ionévekslerharpiks inneholdende funksjonelle grupper SO^H, med følgende egenskaper:

?!S§traks2on_av_hemoglobin_L

10 g av den oppnådde ionebytterharpiks anbringes i en kolonne med 1 cm diameter hvoretter harpiksen innstilles i likevekt ved pH 6,5 med 0,02 m fosfatbuffer.

Man perkolerer 500 ml av en hemoglobinløsning med 0,2 vektprosent i den samme buffer i en mengde på 100 ml/timer. Hemoglobinet adsorberes på ionebytteren. Den utstrømmende oppløsning er fargeløs og inneholder ikke noe hemoglobin og er dermed renset.

Det adsorberte hemoglobin elueres ved perkolering med en ammoniumkarbonatløsning 0,5 m, hvoretter kolonnen vaskes i rekkefølge med 300 ml 0,1 m natriumhydroksydløsning og 50 ml HC1, før fornyet anvendelse.

EKSEMPEL 11

§i^§s^iiS9_§Y_iå!st2§§?yn}i

20 g av en ionebytterharpiks i likhet med den i eksempel

1 anbringes i en kolonne med 2,5 cm i diameter (kolonne nr. 1). 10 g av en ionebytterharpiks tilsvarende den i eksempel 9 anbringes i en kolonne med 2,5 cm diameter (kolonne nr. 2).

De to kolonner anbringes i serie og harpiksene vaskes med 500 ml vann.

500 ml laktoserum innstilt til pH 7,5 Ved tilsetning av 0,1 N natriumhydroksyd filtreres for å fjerne uoppløselige bestanddeler og perkoleres deretter i kolonne nr. 1 og kolonne nr. 2 i en mengde på 300 ml/time.

Utfellingsprøve på proteiner ved hjelp av trikloreddiksyre viser at det laktoserum som kommer ut fra kolonne nr. 2 ikke mer inneholder protein-

Harpiksene i de to kolonner vaskes ved gjennomføring av

100 ml vann.

Proteinene: laktalbuminer, laktoglobuliner, serumalbuin og en liten mengde immunoglobuliner, som er tilstede i utgangs-løsningen, er fiksert på harpiksen i kolonne nr. 1. Disse elueres som beskrevet i eksempel 7.

De proteiner som er fiksert på harpiksen i kolonne nr. 2 er hovedsakelig immunoglobulinene som ikke er fiksert på harpiksen i kolonne nr.1. Disse elueres ved perkolering av en løsning av 1 m ammoniumkarbonat. Den oppnådde løsning inneholder immunoglobulinene i en konsentrasjon på omtrent 3 vektprosent. Immunoglobulinene representerer omtrent 16 vektprosent av den totale mengde proteiner i utgangsopp-løsningen.

Kolonnene vaskes deretter ved gjennomføring av 500 ml vann før fornyet anvendelse.

EKSEMPEL 12

Ekstraksjon_av_groteiner_fra_ø_l.

60 g av en ionebytterharpiks tilsvarende den i eksempel 9 anbringes i en kolonne med 2,5 cm diameter og vaskes med 250 ml vann. 3 liter uklart øl perkoleres i en mengde på 100 ml/timer. Det øl som kommer ut fra kolonnen gir ikke noe bunnfall

ved tilsetning av pikrinsyre og har egenskapene for et klaret øl.

De produkter som er fiksert på harpiksen er i det vesentlige proteiner. Disse elueres ved perkolering av 400 ml N/10 saltsyre.

Harpiksen vaskes ved gjennomføring av 250 ml vann før fornyet anvendelse.

Claims

Anvendelse av en ionebytterharpiks bestående av et porøst uorganisk bærermaterial med kornstørrelse 4 lim til 5 mm, spesifikk overflate 5-150 m 2/g, porediameter 50-250 mm, porevolum 0,4-2 ml/g og et overtrekk i en mengde på mindre enn 15 mg/m 2 av fornettet polymermaterial som enten inneholder anionbyttergrupper som f.eks. tertiære amino- eller kvaternære ammoniumsaltgrupper eller inneholder syregrupper som kationbyttergrupper og fremviser en ionebytterkapasitet mindre enn 2 mekv/g, til separering av proteiner.