SU1124977A1

SU1124977A1 - Способ получени сорбента

Info

Publication number: SU1124977A1
Application number: SU833600003A
Authority: SU
Inventors: Александра Николаевна Волкова; Альберт Иванович Крашенюк; Наталья Борисовна Федотова; Владимир Иванович Яковлев
Priority date: 1983-04-12
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1984-11-23

Abstract

1.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА дл выделени и очистки вирусов гриппа путем модификации поргистого стекла, отличающийс тем что, с целью повышени стабильности сорбента и обеспечени возможности повышени выхода и удельной активности вируса, модификацию осуществл ют трех-четырехкратной обработкой пористого стекла парс1ми Т;Сб при 160-180&deg;С в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина. 2. Способ по п.1, отличаю- щ и и с тем, что используют § раствор овальбумина при общем содержании последнего 150+10мг в расчете на 1 г сорбента.

Description

Изобретение относитс к медицинской промБп ленности и касаетс производства сорбентов дл очистки вирусов гриппа методом гель-хромато рафии . Наиболее распространенным методо дл вьщелени и очистки вирусов гриппа из вирусосодержащей жидкости вл етс метод эксклюзионной (гельхроматографии ) хроматографии с применением сорбентов на основе пористого стекла. При этом сорбент должен обладать минимальной сорбционной емкостью по отношению к виру , сам гриппа и сопутствующим белкам Метод основан на разделении вирусов и белков по принципу молекул рных сил. Отсутствие активных центров на поверхности сорбента исключает воз|иожность сорбции белков или вирусов что, в свою очередь, позвол ет наиболее полно выделить вирусы гриппа и отделить их от белка. Сорбент, иcпoльзye шй дл гель-хроматогра фии , должен обладать стабильностью исключающей попадание модификатора в целевой продукт, механическими свойствами, позвол ющими фильтровать и наполн ть колонку, быть нечувствительньам 1к микробному воздействию и к изменени м рН. Известен способ получени сорбен та дл выделени и очистки вирусов гриппа путем модифицировани макропористых стекол компонентами аллантоисной жидкости Ц . Недостатком этого способа вл ет с нестабильность получаемого сорбента вследствие того, что процесс модифицировани вл етс нестабильным , завис щим от принципиальной нестабильности различных параметров вирусосодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Кроме того,модифицированные стек ла можно стерилизовать только химически (формалином), а выход вируса достигаетс в жестких услови х по рН и концентрации НаСЕ. Известен также способ получени сорбента путем модификации носител титаносодержащими группами 2j . Недостатком этого способа вл ет с то/ что лолучаемый сорбент обладает большой сорбционной емкостью к белку и использование водных растворов дл модификации (пропитка ) не позвод ет получить необходимое число и расположение слоев, т.е требуемую структуру сорбента, В результате этого не обеспечиваетс во производимости результатов при выделении вируса гриппа. Наиболее близким к изобретению п технической сущности вл етс спосо получени -сорбента дл выделени и очистки вируса гриппа nyTeNs модификации пористого стекла поливинил пирролидоном (ПВП). Процесс обычно провод т в водном растворе в статических услови х, после адсорбции пористое стекло с модификатором отмывают дистиллированной водой и подвергают термообработке . Использование полученного сорбента позвол ет выдел ть вирус гриппа в зависимости от используемого штамма на 16-48% (выход вируса) при удельной активности 0,36-1,41 (отношение титра вируса к содержанию белка в пике). Этот сорбент в насто щее врем широко используетс в медицинской промышленности з . Недостатками известного способа вл ютс непрочна модификаци стекла , что приводит к сползанию модификатора с поверхности носител и попаданию в целевой продукт, необходимость повторного модифицировани сорбента поливинилпирролидоном через 7-10 хроматографических циклов (через 3 мес.), что вл етс нетехнологич ъ л , а также низкий выход вирусов гриппа при низкой степени его очист ки, высока стоимость ПВП и длительность процесса модификации носител . Целью изобретени вл етс повышение стабильности сорбента и обеспечение возможности повышени выхода и удельной активности вируса при выделении. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу-получени сорбента дл вьаделени и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, модификацию осуществл ют трех-четырех кратной обработкой пористого стекла парами Tici при 160-180 0 в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина. Кроме того используют раствор овальбумина при общем содержании последнего ISOtlO мг в расчете на 1 г сорбента. Технологи получени сорбента дл очистки вирусов гриппа состоит в попеременной обработке носител пористого стекла с размером пор ,. 2000 А, удельной поверхностью 25м /г парами четыреххлористого титана и воды при -t 16О-ISO С три-четыре раза и обработке, титансодержащего;; сорбента раствором овальбумина. Така обработка приводит к созданию на поверхности пористого стекла титансодержащих групп, св занных с поверхностью прочными ковалентными св з ми заданного состава и строени . В результате полученный сорбент не требует повторного модифицировани (количество титана на сорбенте после 200 хррматографнческих циклов оставалось практически равным исход ному содержанию - 0,24 мг-экв/г дл трехкратной обработки и 0,30 мг экв/г дл четырехкратной: обработки). Пр этом модификаци титан-оксидными группами приводит к снижению раство римости стекла и выходу кремни в раствор с 0,05 мг/мл без модификаций до 0,005 мг/мл после. Обработку овальбумином провод т путем сорб- ции из раствора в емкост х на 100 м при tt:4 C, Полученный сорбент отмы вают .от белка фоновым буфером. Обра ботка овальбумином сорбентов с трем и четырьм сло ми гидроксидных групп приводит к практически полном взаимодействию активных центров поверхности сорбентов с белком (85-95%). OTNMBKa белка фосфатным фоновым буфером рН 7,2 с 0,15М NaCl, а также десорбци белка буфер ными растворами рН 2,,0 с ионной силой с 0,15 - 1,5 М NaCl не приводит к сн тию белка, т.е. овальбумин св зан с поверхностью прочными химическими св з ми, при этом увеличение или снижение количества циклов модифицировани (один, два, п ть, шесть) при обработке овальбумином снижает количество химически сорбированного белка до 50%, что, в свою очередь, освобождает активные центры поверхности. Выбранный интервал температур 160-180 С обработки носител парами четыреххлористого титана обусловлен тем, что при этой температуре повер . ность стекла наиболее гидроксилирована . Увеличение температуры приводит к дегидратации ОН-групп на поверхности , а следовательно, к снижению количества, вступивших в реакцию с Т Сб гидроксилов, т.е. уменьшению модификатора в поверхностном слое и снижению активности. Уменьшение температуры обработки приводит к замедлению взаимодействи T.J а с гидроксильными группами а также не исключает возможности присутстви молекул рно-св занной воды, котора при взаимодействии с ТДСЦ может привести к частичному, нековалентному св зыванию модификатора с поверхностью носител , т.е. снижению устойчивости сорбента. Выбранное врем обработки носител парами Т|Свц100-120 мин обусловлено тем, что 100 мин это то врем , йри котором все гидроксильные группы поверхности вступают во взаимодействие с парами TiCl . Увеличение времени обработки выше 120 мин не целесообразно, так как поступающие пары, не реагиру , вывод тс из реактора . Уменьшение времени контакта снижает количество модификатора в поверхностном слое, что, в свою очередь, снижает количество активных центров, вступающих в реакцию с оваль бумином. Таким образом, необходимость трехчетырехкратного модифицировани обусловлена тем, что увеличение или снижение количества циклов модифицировани при обработке овальбумином снижает количество химически сорбированного белка до 50%. При этом освобождаютс активные центры поверхности, вступающие во взаимодействие с белком или вирусом при гель-хроматографии, что вл етс н едопус т имым. Пример. Навеску пористого стекла в количестве 1 г с размером пор 2000 А, очищенного от примесей и высушенного при температуре около 180°С, обрабатывают парами четыреххлористого титана в течение 100 мин при в реакторе проточного типа в токе воздуха. Затем удал ют пары TiCl и образовавшегос хлористого водорода и провод т гидролиз парами воды. Такую обработку провод т три раза. ; Количество титан-оксидных групп 0,24 мг.экв/г. Далее провод т сорбцию овальбумина в емкост х на 10.0 мл при 4°С с концентрацией овальбумина 2 мг/мл. Полученный сорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2. Емкость сорбента по овальбумину 100 мг/мл. Химическа сорбци белка овальбумина 85%. П р и Т, с 2. Аналогично примеру 1, но обработку парами четыреххлористого титана провод т 120 мин. Количество титан-оксидных групп 0,25 мг экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 108 мг/мл. Химическа сорбци овальбумина 87,4%. Пример 3. Аналогично примеру 1, но обработку парами TiCS провод т при t 180°С. Количество титан-оксидных групп 0,23 мг экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 105 мг- экв/г. Химическа сорбци овальбумина 86%. Пример 4. Аналогично примеру 1, но модификацию провод т четыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,30 мг.экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 120 мг/г. Химическа сорбци овальбумина 95%. Пример 5. Навеску пористого стекла с размером пор 2000 А в 1 г, очищенного от примесей и высушенного при t 180° , обрабатывают парами Т С14. в течение 100 мий при t 180° в реакторе приточного типа в токе воздуха. Затем удал ют пары TiCl и образовавшегос , хлористого водорода и провод т гидроЛИЗ парами воды. Такую обработку провод т четыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,31 мгэкв/г Емкость сорбента по овальбумину 118 мг/1. Химическа сорбци оваль йумина 93,6%. Гель-хроматографию провод т на колонке с диаметром 0,44 см, пло щaдью поперечного сечени 0,16 см высотой сло сбрбента 14-15 см, объем сорбента 2,2-2,4 мл при скорости элюции 100 мл/ч-см. В качес ве элюирующего буфера используют фоновый буфер, т.е. 0,1 М фосфа ный буфер рН 7,2на 0,15 М N зС1. На колонку нанос т вирусосодержащую aллaнtoиcнyю жидкость в объеме 0,1 мл (4-5 % от объема колонки). Запись хроматограммы провод т на приборе РЭППС-1М. Эффективность выделени и очист ки вируса оценивают по выходу виру са и величине удельной активности (отношение титра вируса к содержанию белка в пике). В работе используют штаммы виру сов гриппа Х-Ленинград-54/Н , N Стабл.1), А (УФА(, ) (табл.2;, А-385 (. 5 ) (табл.З). Опыты по очистке вирусов гриппа провод т на сорбентах на основе пористого стек ла и модификаторов окиси титана (при различном количестве циклов модифицировани ) и овальбумина. Дл сравнени испытаны сорбенты на основе пористого стекла и. модификатора поливинилпирролидона. Результаты представлены в табл. 1-3. Из приведенных данных видно, чт модификаци пористого стекла титаноксиднЕгЛ и группами и свальбумином независимо от примен емых штаммов вируса приводит к значительному увеличению выхода вируса по сравнению с известным. При этом резко сокращаетс количество белка в вирусном пике, т.е. повышаетс степень очистки вируса (удельна активность ) . Оптимальными свойствами обладают сорбенты, полученные в результате трех-четырехкратного модифицировани .пористого стекла титаноксидными группами и Ьвальбуми- ном. Таким образом, способ получени сорбента дл выделени и очистки вирусов 1риппа, заключающийс в модификации пористого стекла парами TiCl при 160-180с в течение 100-120 мин с последующим гидролизом продукта парами воды, причем процесс : модифицировани повтор ют три-четыре раза, и обработке овальбумином , позвол ет создать сорбент, который на стадии гель-хроматографии повьниает эффективность выделени вирусов гриппа независимо от используемого штамма вируса примерно в два раза при увеличении удель- ной активности в четыре-дев ть раз. Сорбент, полученный по предлагаемому способу, устойчив, не требует повторного модифицировани . Тем самым, увеличива срок .службы сорбента и снижа затраты на его получение , исключаетс переход модификатора с поверхности, а также ионов кремни в целевой продукт, что упрощает технологию получени вакцин . Таблица 1

Пористое стекло,модифицированное поливинилпирролидоном (известного)

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное -в результате, одного цикла обработки) и овальбумином .

1:328 16,0 343 0,96

1:328 16,0 261 1,26

0,09

Пористое стекло, модифицированное двум сло ми титана (полученное в результате двух циклов обработки) и овальбумином .

Пористое стекло, модифицированное трем сло ми титана (полученное в результате трех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное четырьм сло ми титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное п тью сло ми титана (полученное в результате п ти циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло,модифицированное шестью сло ми титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином. .Примечание.

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролидоном (прототип)

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное в результате одного цикла обработки) и овальбумином .

0,18

1:328

16,0 313 1,48

0,24

1:656

32,0 170 3,86

0,30

1;656 32,0 183

3,58

1:328 16,0 337

0,46

0,97

0,60

1:328 16,0 338

0,97

1:100 39,0 280 0,36

1:122 48,0 150 0,81

0,09 Исходный титр 1:2048. В табл. 1-3 титр вируса вл етс ) среднеарифметической величиной, рассчитанной из нескольких опытов. Таблица 2

Пористое стекло, модифицированное Д9УМЯ сло ми титана . (полученное- в результате двух циклов обработки) и овгшьбумином .

Пористое стекло, модифицированное трем сло ми титана (полученное в результате трех циклов обработки) и овальбумином

Пористое стекло, модифицированное шестью сло ми титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином.

Примечание. Исходный титр It 256.

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролидоном (известный)

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное в результате одного циклэ обработки) и овальбумином .

Продолжение табл. 2

.0,18

1:144 56,0 194 0,74

0,24

1:200 -78,0 92 2,17

0,30 1:212 83,0 76 2,80

0,46

1:130 51,0 180 0,70

1:.146 57,0 162 0,90

0,60

. v

Таблица 3

1:492 48,0 350 1,41

1:584 57,0 135 4,33

0,09

Пористое стекло, модифицированное двум сло ми титана (полученное в результате двух циклов обработки) и ов аль бумином

Пористое стекло, модифицированное трем сло ми титана (полученное в результате трех циклов обработки) и ов аль бумином.

Пористое стекло, модифицированное шестью сло ми титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овёшьбумином.

Примеч.а ни е. Исходный титр 1:1024.

Продолжение табл. 3

1:512 50,0 208 2,46

0,18

1:768 75,0 87,5 8,78

0,24.

1:748 73,0 60,0 12,47

0,30

1:512 50,0 184 2,78

0,46

1:584 57,0 1503,89

0,60

Claims

1.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, отличающийся тем что, с целью повышения стабильности сорбента и обеспечения возможности повышения выхода и удельной активности вируса, модификацию осуществляют трех-четырехкратной обработкой пористого стекла парами Т;Сб₄при 160-180°С в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина.

2. Способ поп.1, отличающийся тем, что используют раствор овальбумина при общем содержании последнего 150+10мг в расчете на 1 г сорбента.