SU1286268A1 - Способ получени сорбента дл очистки ферментов и белков - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к способу получени  сорбента дл  очистки ферментов и белков и позвол ет получить сорбент с повьтенной емкостью. Макропористый кремнезем по.следовательно- обрабатывают .Tf -глицидооксипропиЛ- триэтоксисиланом и фенилглицидиловым эфиром при соотношении 7-11. мМ эфира на 10 г модифицированного носител . Вторую стадию провод т в диоксане в присутствии эфирата трёхфтористого бора . 1.3.П.Ф-ЛЫ, 2 табл.

Description

to

00

О

Од

00

Изобретение относитс  к способу получени  сорбента дл  очистки ферментов и белков и может быть использовано в производстве высокоочищен- ных белковых препаратов и ферментов.

Цель изобретени  - повышение сорб ционной емкости сорбента.

Пример 1. 150 г силохрома С-80 обрабатывают при перемешивании 800 мл 2%-ной азотной кислоты в те- чение 2 ч при 90°С. После этого гид- роксилированный носитель отфильтровывают , промывают водой до нейтральной реакции промывных вод и отжимают на фильтре. Влажный полупродукт исполь- зуют дл  дальнейшей обработки без высушивани . Его обрабатывают 675 мл 10%-ого водного раствора эпоксипро- пилтриэтоксисилана при- рН 3,5-4,5 в течение 2 ч при , периодически перемешива . Продукт отфильтровывают промывают .водой, ацетоном и высушнпл шт.- Содержание эпоксигрупп дл  сило- хрома С-80 составл ет 50 мкмоль/г

В шестилитровую трехгорлую колбу, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником и капельной воронкой , заливают 966 мл эпихлоргидри- на и поднимают температуру до . В капельную воронку заливают раствор фенола, который получают при растворении 1 кг фенола в растворе NaOH (513 г NaOH раствор ют в 1835 мл дистиллированной воды). Раствор Фенола

ввод т в ЭПИХЛОРГИДРИН при ПОСТОЯ1Гном перемешивании смеси в течение 4,5-5 ч. После реакции смесь фильтруют , а фильтрат промывают в делительной воронке 6-8 порци ми воды (по 1-1,5 л). Верхний слой собирают, высушивают над безводным MgSO. Продукт очищают вакуумдистилл цией при 92°С (6 мм рт.ст.). Получают 460 - 480 мл фенилглицидилового эфира (вы- ход - 50%).

20 г глицидилсилильного силохрома .С-80, полученного, на первой стадии, заливают 80 мл абсолютного диоксана, содержащего 2 мл (7,4 1 лиганда на 10 г носител ) фенилглицидилового эфира, полученного на второй стадии, добавл ют 1,6 мл свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора, смесь перемешивают 5 мин при комнатной температуре , затем 2 ч при . Продукт отфильтровыва от, промывают диок саном, водой, ацетоном и высушивают

о

5

Q С

п г

при 110-115°С. Концентраци  лиганда в сорбенте 79,5 мкмоль/г.

Пример 2. 20,Ог глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру 1, заливают. 80 мл. абсолютного диоксана, содержащего 3 мл фенилглицидилового эфира (И мМ лиганда на 10 г носител ) и реакцию провод т по примеру I. Концентраци  лиганда в сорбенте 103 мкмоль/г.

ПримерЗ. НаЮОг глицидилсилильного силохрома С-.120, полученного по. примеру 1 (при использовании в качестве носител  силохрома С-120), заливают 350 мл абсолютного диоксана, добавл ют 20 мл фенилглицидилового эфира (11 мМ лиганда на 10 г носител ), добав.а ют 7,4 мл эфирата трехфтористого бора и реакцию провод т по примеру 1. Концентраци  лиганда в сорбенте 122,3 мкмоль/г.

П р и м е р 4. 70 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру , заливают 245 мл абсолютного диоксана, содержащего 10,5 мл фенилглицидилового эфира (П мМ лиганда на 10 г носител ), полученного по примеру 1, добавл ют 4,9-мл (0,7 мл на 10 г носител ) свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора и реакцию провод т по примеру 1. Концентраци  лиганда в сорбенте 84,8 мкмоль/г.

.П р и м ер 5. 20,5 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру I, заливают 102,5 мл 5 мМ раствором НС 1 и эпоксигруппы носител  гидролизуют до диольных перемешиванием суспензии 2 ч при комнатной температуре. Носитель отфильтровывают, промывают водой, этанолом и высушивают . 20 г по.пученного диольиого силохрома С-80 заливают 80 мл абсолютного диоксана, содержащего 2 мл фенилглицидилового эфира (7,4 мМ лиганда на .10 г носител ), добавл ют I,6 мл эфирата трехфтористого бора, смесь перемешивают 5 мин при комнатной температуре и 2 ч при . Сорбент промывают диоксаном, водой, ацетоном и высушивают. Концентраци  лиганда в сорбенте 69,4 мкмоль/г.

Сорбционную емкость сорбентов определ ют в услови х статической сорбции в 0,02 М натрий-фосфатном буфере . рН 7., 1, содержащем 2 М NaCl. 1 г сорбента , полученного по примерам 1-5, уравновешивают исходным буфером, декантируют и заливают 3 мл раствора

альбумина человеческой сыворотки (Реанал, ВНР) с концентрацией 20 мг/м в буфере с 2 М NaCl. Суспензию сор- бента перемешивают 2 ч при комнатной температуре, после чего сорбент пере нос т на стекл нный фильтр. Несорби- рованный белок отмывают буфером с 2 М NaCl. Сорбированный белок десор- бируют 0,02 М натрий-фосфатным буфером , рН 7,1, без NaCl. Концентрацию альбумина определ ют измерением оптической плотности .растворов при 280 нм по калибровочной кривой.

Сравнительные данные концентрации лиганда и сорбционной емкости сорбентов , полученных по предлагаемому и известному способам.приведены в табл.I.

Примерб. В табл.2 приведены данные хроматографических испыта- НИИ сорбентов по предлагаемому и известному способам при выделении трипсина .

Услови  испытаний: количество сорбента 1 г, колонка размером 8x120 мм буфер: 20 мМ трис-НС1, содержащий 2 мМ СаС и 3 М NaCl при рН 6,8.

л - 5 -

1286268

Десорбцию осуществл ют линейным градиентом 3,0-0 К хлорида натри . Скорость элюировани  15 мп/ч.

Claims (2)

1.Способ получени  сорбента дл  очистки ферментов и белков, включающий активирование макропористого кремнеземного носител  Г -глицидо- оксипропилтриэтоксисиланом с последующей обработкой гидрофобным ароматическим лигандом в присутствии эфира- та трехфтористого бора в среде диок- сана и промывкой продукта, отличающийс  тем, что, с целью повышени  сорбционной емкости сорбента , в качестве лиганда используют фе- нилглицидиловый эфир.

2.Способ поп.1,отличаю- щ и и с   тем, что обработку лигандом провод т при соотношении 7-11 t лиганда на 10 г активированного носи- тел  в 35-40 мл диоксана, содержаще-, го 0,7-0.,8 мл зфирата трехфтористого бора.

Таблица 1

1

С-80 Фенилглицидиловый 79,5 эфир

103,0

84,8

69,4

С-120 Фенилглицидиловый 122,3 эфир

МСА-1500 Фенол. 17,6

Бензиловый спирт 37,0 Бензиловый спирт 52-56 Октиловый спирт Дециловь1й спирт

32

38 32 32 51,0

9,6

8,8

2,4 1,8

Известный

Бензиловый спирт,конц, лиганда 56,3мкмоль/г 4,02

Фенилглици- диловый эфир, конц.лиганда 84,8 мкмоль/г 2,45

28,20 0,60 14,92 17,2 60,99 0,12 20,00 2,33 13,35

73,80 0,87 35,51 48,22 65,34 0,87 100,0 20,65 42,82

а б л и ц а 2