SU1273392A1

SU1273392A1 - Способ очистки трипсина

Info

Publication number: SU1273392A1
Application number: SU853842016A
Authority: SU
Inventors: Станислав Александрович Кудинов; Мария Вячеславовна Колодзейская; Татьяна Николаевна Пивненко; Анатолий Петрович Мелешевич; Ирина Павловна Федорова; Валерий Николаевич Акулин; Леонид Менделеевич Эпштейн; Надежда Дмитриевна Морозова
Original assignee: Институт биохимии им.А.В.Палладина; Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии; Институт Физической Химии Им.Л.В.Писаржевского; Киевский Государственный Университет Им.Т.Г.Шевченко
Priority date: 1985-01-16
Filing date: 1985-01-16
Publication date: 1986-11-30

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии . Цель изобретени - повьшение активности целевого продукта. На колонку , заполненную сорбентом 1,6-диамингексан-целлюлозы , уравновешенную фосфатным буфером с рН 6,0-6,2, нанос т экстракт из пилорических придатков кеты. Промывание колонки провод т фосфатным буфером. Десорбцию целевого продукта осуществл ют 2830% изопропиловым спиртом, содержащим 1-1,5% NaCl. Полученный препарат содержит чистый трипсин, гомогенньй при электрофорезе в полнакриламидном б геле. 2 табл. (О

Description

N5

СО СО со

Claims

to 1 Изобретение относитс к медицине, в частности биотехнологии, к способам получени протеолитических ферментов . Цель изобретени - повьппение активности целевого продукта. Поставленна цель достигаетс за счет использовани определенного режима экстракции, а также хроматографии на 1,6-диамингексан-целлюлозе, при этом десорбцию целевого продукта осуществл ют смесью 28-30% изопропилового спирта и 1,0-1,5% NaCl. Пример 1. Получение биоспе цифического сорбента (1,6-диамингексан-целлюлозы ). Бумагу, фильтровальную или хроматографическую , облучают У-лучами на кобальтовой установке или ускоренными электронами, поглощенна доза 2030 при мощности дозы 50,0 2 ,510 рад/с. После этого 50 г измельченной бумаги (1x1 см) помещают -в колбу емкостью 1 л с обратным холодильником , добавл ют 6,2 г 1,6-ди аминогексана, растворенного в воде (количество ГМДА эквивалентно 3% альдегидных групп, содержащихс в 50 г облученной бумаги). Смесь кип т т в течение 3-х ч. охлаждают, бумагу многократно промывают водой до тех пор, пока рН промывных вод не будет равен 7,0. После этого бумагу отжимают, сушат. Полученный сорбент используют дл очистки трипсина. Пример 2. На колонку, заполненную 10 мл сорбента 1,6-диамин гексан-целлюлозы, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0, нанос т 20 мг экстракта из пилорических придатков кеты (рН 6,0), растворенного в 2 мл дистиллированной воды. Эстеразна активность исходно го препарата: 520 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ - тозил-Ъ-аргинин метило вьй эфир) - трипсиноподобна активность; 1620 ед/мг белка (субстрат БТМЭ - бензоил-Ъ-тирозин метиловый эфир) - химотрипсиноподобна активность . Промывание колонки провод т 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0. Десорбцию целевого продукта осущест вл ют 28%-ным изопропиловым спиртом содержащим 1,0% UaCl. Полученный препарат содержит чис тый трипсин, гомогенный при; электро форезе в полиакриламидном геле. 922 Выход препарата от сорбированного трипсина составл ет 88%, удельна активность - 5200 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ), что в 10 раз выше трипсиноподобной активности исходного препарата; химотрипсиноподобна активность отсутствует в конечном продукте . Пример 3. Все операции провод т по примеру 2 за исключением того, что дл экстракции целевого продукта и его хроматографии используют 0,01 М фосфатный буфер, рН 6,2. Удельна активность препарата 5200 ед/мг белка. . Пример 4. Все операции провод т по примеру 2 за исключением того, что десорбцию целевого продукта осуществл ют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,2% NaCl. Выход целевого продукта от сорбируемого составл ет 90%, удельна активность (субстрат ТАМЭ) - 5720 ед/мг белка, что в 11 раз выше трипсиноподобной активности исходного препарата Конечный продукт электрофоретически гомогенен и не содержит химотрипсиноподобной активности. Пример 5о Все операции провод т-по примеру 2, за исключением того, что десорбцию целевого продукта осуществл ют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,5% NaClo Выход целевого продукта составл ет 84,5, удельна активность 6000 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ). Использование изопропилового спирта и NaCl дл десорбции трипсина в концентраци х, вьш1е или ниже указанных в формуле, приводит к снижению его активности на 20-30%. Применение же одного спирта без NaCl дает незначительный выход фермента. Характеристика препарата трипсина представлена в табл. 1 и
2. Формула изобретени Способ очистки трипсина путем по-, лучени экстракта из пилорических придатков лососевых рыб и его хроматографии на 1,6-диамингексан-носителе , отличающийс тем, что, с целью повышени активности целевого продукта, экстракцию провод т фосфатным буфером рН 6,0-6,2 с последующей хроматографией на 1,63 -диамингексан-целлюлозе в том же буфере и десорбцией целевого продукта 12733924 смесью 28-30% изопропилового спирта и 1,0-1,5% NaCl. Таблица 1

Таблица