О
«аи Ф Г . 1Г Изобретение относитс к микробио логической промьппленности, точнее к способам получени и очистки ферментных препаратов, и может Оыть использовано в технологии производ-т ства высокоочищенных ферментов. Известен способ очистки фосфо ипазы D из Streptomyces hachijoensis включающий хроматографирование фильт рата культуральной жидкости на ДЭАЭцеллюлозе , лиофилизацию, гельфильтра цию через сефадекс Г-50, лиофилизацию и препаративное изоэлектрофокусирование . Выход фосфолипазы D составл ет 53,3% от активности филь paта культуральной жидкости, удельна активность 630 ед/мг белка (за . единицу активности фосфолипазы J) принимают количество фермента, отщепл ющее 1 иМэтанЬЛамина за 1 мин при 37°CJ р . Недостатками этого способа вл ютс многостадийность и применение препаративного изоэлектрофокусировани на заключительной стадии очистки. Препаративное изоэлектрофокусирование вл етс сложным :методом, требующим дорогосто щей . импортной аппаратупы, а пс следующа отмьшка препарата фермента от амфолинов ведет к снижению ферментативной активности и преп тствует его применению дл получени больших количеств высокоочищенной фосфолипазы D .. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту вл етс способ получени фосфолипазы D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus, включающий . высаливание бесклеточной культуральной жидкости сернокислым аммонием до 80%-ного насыщени с последующим диализом против 20-ти кратного объема 10 мМ трис-ДС1 буфера рН 8,0; содержащего 1М NaCl, в течение 18 ч при 4с и хроматографию на нониламинооксипропилсефарозе . Выход фермента 54% от общей активности фосфолипазы D в культуральной жидкости , удельна активность препарата 1700 ед/мг белка(за единицу активнос ти фосфолипазы D прини1 ают количество фермента, которое вьщел ет 1 JU М титруемьпс щелочью кислот за 1 мин при 37 с1 Сорбционна емкость нониламинооксипропилсеФарозы 300 ед. фосфолипазной активности на 1 г сорбента 2 . Недостатками известного способа вл ютс невысокий выход и удельна активность целевого продукта, а также высока стоимость полученной фосфолипазы D , так как дл выделени фермента необходимо синтезировать специальный сорбент. Целью изобретени вл етс увеличение выхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевление способа. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени фосфолипазы D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus ,. включающему диализ и последуюп ую хроматографию, хроматографию провод т на силохроме С-80, содержащем силанольные группы, осуществл элюцию целевого продукта 8-12 мМ трис-НС1. буфером с рН 7,9-8,1, содержащим 1,4-1,6 М хлористый натрий . Сущность способа заключаетс в том, что хроматографию провод т на колонке с силохромом С-80, содержащим силанольные группы и характеризующимс удельной поверхностью JO90 , диаметром пор 400-500 А, объемом ,2-1,4 , размером зерен 80-160 мкм, неправильной формой зерен. При хроматографии диализата культуральной жидкости на этом сорбенте сорбированна фосфолипаза элюируетс 8-12 мМ трис-НС1 буфером, содержащим 1 ,4-1 ,6 М НаСГ,1 при рН 7,9-8,1.. Пример. Способ очистки фосфолипазы Р из культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus в оптимальных услови х. Получение бесклеточной культуральной жидкости, содержащей фосфолиnasyD . Продуцент фосфолипазы D.Streptomyces cinnamomeus шт, 11 О2с культивируют на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: соева мука 30; фруктоза 1; КНуР0 2; 3, при рН 7,2 в течение 48 ч при и скорости вращени качалки 2,5 с. Клетки микроорганизмов отдел ют центрифугированием при 12000 X .g и температуре 2 С в течение 30 мин. Диализ. Бесклеточную культуральную идкость в объеме 34 мл дпализируют против 10 мМ трис-ИС буфера р11 8,0 в течение 18 ч при . Выпавший осадок отдел ют центрифугированием при 12000 X g и 2°jC в течение 30 мин. Активность диализата культу ральной жидкости 32,7 ед/мл, белка 0,23 мг/мл, удельна активность 142,2 ед/мг белка(j KTHBHOCTb опреде л ют по методу прототипа. Хроматографи диализата культу ральной жидкости на силохроме С-80. Хроматографию провод т на стекл нно колонке размером 0,5«5 см, содержащей 0,33 г силохрома С-80, уравновешенного 10 мМ трис-НС1 буфером рН 8,0. Скорость протекани во врем сорбции и промьшки 0,2 мл/мин. 34 м диализата культуральной жидкости, содержащего-7,84 мг белка и 1112 ед активности фосфолипазы D , нанос т на колонку. Несорбированные белки отмывают 50 мл исходного буфера, сорбированную фосфолипазу Б элюиру ют 10 мМ трис-НС буфером рН 8,0, содержащим 1,5 М NaCl со скоростью протекани 2,5 мл/мин. Выход фосфол пазы D 90,6%, удельна активность препарата 2664 ед/мг белка. П р;и м е р 2. Получение бесклеточной жидкости и диализ провод т по примеру 1. Дл сорбции и элюции Используют буфер с мол рностью 8 ил 12 мМ. Выход и удельна активность фосфолипазы при замене 10 мМ буфера на 8 или 12 мМ практически не измен етс . Вли ние рН буфера и мол рности хлористого натри на эффективность разделени фосфолипазы J) и примесных белков при хроматографии., ка силохроме С-80, приведены в таблице. Приведенные примеры показывают, что дл достижени положительного эффекта необходимо использовать дл элюции 8-12 мМ трис-НС буфер с рН 7/9-8,1, содержащий 1,4т1,6 М хлористый натрий . Снижение рН буфера приводит к дестабилизации фермента, а увеличение рН не позвол ет осуществить сорбцию за счет приближе и к изоэлектрической точке(8,44) . Таким образом, предлагаемый способ позвол ет увеличить выход целевого продукта в 1,7 раза, а удельную активность в 1,6 раз, по сравнению С известным способом. Следует также отметить, что сорбционна емкость силохрома С-80 в 7 раз вьше сор5ционной емкости нониламинооксипропилсефаррзы , используемой дл очистки фосфог липазы 1} по известному способу. Кроме того, предлагаемый дл очистки фосфолипазы и силохром С-80 вл етс дешевым широкодоступным сорбентом, который можно успешно использовать в технологии очистки больших количеств фосфолипазы TD .