KR0151573B1 - 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물의 배양액중 글루코아밀라아제, 아밀라아제, 트랜스글루코시다아제등이 혼재된 혼합효소계내에서 필요한 트랜스글루코시다아제만을 선택적으로 분리하여 정제하는 방법에 관한 것으로, 좀더 상세히 설명하면 아스파질러스속 곰팡이를 이용하여 글루코아밀리아제, 아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제가 포함된 배양액을 제조한 후 원심분리기 및 압착여과기로 미생물을 제거하고 한외여과로 농축하여 한외여과농축액을 제조한 다음, 이에 음이온교환수지만을 일외 처리하여 글루코아밀라아제 및 아밀라아제를 흡착시켜 제거한 후 여과분리하므로써 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제를 간편하게 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제방법

본 발명은 미생물의 배양액중 글루코아밀라아제(glucoamylase), 아밀라아제(amylase), 트랜스글루코시다아제(transglucosidase)등이 혼재된 혼합효소계내에서 필요한 트랜스글루코시다아제만을 선택적으로 분리하여 정제하는 방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 혼합효소액내에서 글루코아밀라아제와 아밀라아제를 이온교환수지를 이용하여 흡착 제거하고 트랜스글루코시다아제를 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

트랜스글루코시다아제는 맥아당(maltose)을 기질로 하여 이소말토스(iso-maltose), 파노오스(panose), 이소말토테트라오스(iso-maltotetraose)등의 이소말토올리고당(iso-maltooligosaccharides)을 생성하는 전이효소로서 이소말토올리고당은 비발효성당으로 인체내의 장내에서 유용한 비피더스균의 증식효과와 충치의 예방효과 뿐만아니라 온도 및 pH에 안정성이 뛰어나고 보습성이 높아 식품가공산업에 있어서 새롭게 각광을 받고 있는 식품소재이다. 또한 수분활성도를 낮추는 기능을 가지고 있어 식품의 저장성을 연장하는 효과도 있다.

일반적으로 트랜스글루코시다아제는 곰팡이에서 분비되는 것으로 알려져 있으며, 효모의 추출물내에서도 소량이 존재하는 것으로 알려져 있다. 효모내의 트랜스글루코시다아제나 곰팡이에서 분비되는 트랜스글루코시다아제의 분리 및 정제에 관한 선행특허로 일본 특개소 제56-27236호에서는 음이온교환수지와 양이온교환수지를 사용하여 흡착 및 탈착에 의한 분리정제를 시도하고 있으나 이온교환수지를 번갈아 사용하는 번거로움과 공정의 복잡성등의 단점이 있다.

따라서 본 발명의 목적은 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제를 간단한 단일공정으로 처리하여 분리정제하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은 아스파질러스속 곰팡이를 이용하여 글루코아밀라아제, 아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제가 포함된 배양액을 제조한 후 원심분리기 및 압착여과기로 미생물을 제거하고 한외여과로 농축하여 한외여과농축액을 제조한 다음, 이에 음이온교환수지를 사용하여 글루코아밀라아제 및 아밀라아제를 흡착시켜 제거한 후 여과분리하므로써 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제를 분리정제하는 것으로 이루어진다.

이하 본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 의한 혼합효소내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법은 우선 트랜스글루코시다아제를 다량분리하는 미생물인 아스퍼질러스속(Aspergillus Sp.)의 곰팡이, 예를 들어 아스퍼질러스 우사미(Asp. usamii), 아스퍼질러스 아와모리(Asp. awamori), 아스퍼질러스 포이티더스(Asp. foetidus)중 하나 이상을 선택하고, 이를 하기 표1의 배지를 제조한 후 하기 표2의 배양조건에 따라 배양한다.

배양이 끝난 배양액의 미생물을 6,000-12,000rpm에서 원심분리기를 사용하거나 또는 압착여과기로 분리제거하고, 밀리포어사(미국)의 한외여과를 이용하고 멤브레인(Membrane)의 분자량 컷오프사이즈(cut-off size)는 10,000을 사용하여 농축하므로써 정제를 위한 시료, 즉 한외여과농축액을 제조한다.

상기의 방법에 따라 제조된 한외여과농축액 시료에 음이온교환수지를 처리할 때 한외여과농축액의 조건으로는 pH는 4.2-5.2, 전기전도도(conductivity)가 500-2,000 마이크로씸(㎲), 바람직하게는 800-1,200㎲, 트랜스글루코시다아제의 역가는 시료 1ml에 300-1,000TGU(transglucosidase activity unit) 그리고 포도당 당량(DE:Dextrose Equivalent)은 10㎲/ml이하의 범위로 한다. 이러한 조건은 농축액내 단백질 이외의 물질을 제거하므로써 수지의 흡착효율을 증대시킨다.

상기 트랜스 글루코시다아제의 역가 측정 방법은 0.02몰 아세테이트 완충용액(pH 5.0) 1ml와 2% 알파메칠글루코오스(α-methylglucose)용액 1ml를 시험관에 넣고, 40℃에서 1ml에 0.3-0.8 TGU가 되도록 적당하게 희석된 효소(트랜스글루코시다아제)용액 0.5ml를 가하여 1시간 동안 반응시킨 후, 5분간 가열하여 반응을 정지시킨 다음 이 반응액을 글루코오스 정량키트(시그마사 제품)을 이용하여 글루코오스를 정량하여 역가를 측정하는데, 이때 1 TGU는 상기 조건에서 1㎲의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.

상기와 같은 조건에서 한외여과액 시료에 음이온교환수지를 5-40%(w/v), 바람직하게는 약 10-30%(w/v)를 사용하여 처리하므로써 불필요한 글루코아밀라아제와 아밀라아제를 흡착시켜 제거한 후 여과분리하면 정제된 트랜스글루코시다아제를 간편하게 얻는데, 이때 음이온교환수지의 무게는 아세테이트 완충용액(pH 4.2-5.2)으로 평형을 시킨 수분함유량이 약 50-80% 상태의 무게이며, 이때 사용량이 5% 미만에서는 트랜스글루코시다아제의 흡착이 거의 일어나지 않으며, 40% 정도에서 트랜스글루코시다아제의 흡착이 완결된다.

또한, 본 발명에 사용된 음이온교환수지는 DEAE cellulose를 단독으로 사용하거나 DEAE cellulose, WA30(삼양사 제품) 또는 Amberite(시그마사 제품)을 두가지 또는 그 이상으로 조합처리하여 사용한 것이며, 음이온교환수지의 사용방법으로는 배치(batch)식 또는 컬럼(column)충전식을 포함하는 방법으로 이는 한외여과농축액의 일회식처리 방법과 연속식 처리방법을 포함한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 살펴보지만 하기예에 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

전분, 콘스팁리쿼, 암모늄설페이트, 알파아밀라아제, 소이빈밀 및 소포제가 각각 10%, 3%, 0.3%, 0.05%, 3% 및 0.1%(w/v)로 조성된 배지에서 아스퍼질러스 아와모리 pH 5.0, 분당회전수 300, 온도 30℃, 공기량 1.5vvm의 반응조건에서 5일 동안 배양한 후 11,000rpm으로 회전하는 원심분리기를 이용하여 배양된 곰팡이를 분리제거하고 분자량 컷오프사이즈가 10,000인 멤브레인을 사용하여 한외여과농축액을 제조하였다.

디이에이이셀룰로오스(DEAE cellulose), WA30(삼양사) 및 Amberite(시그마사) 세가지 이온교환수지의 각 효소(글루코아밀라아제, 글루코오스 및 트랜스글루코시다아제)에 대한 흡착의 정도를 알아보기 위해서 이온교환수지 각각의 처리농도를 상기 제조된 한외여과농축액의 20%(w/v)로 사용하고 이온교환수지의 평형을 위한 완충액으로 pH 5.2, 30 mM의 디이에이이셀룰로오스를 사용하였다. 한외여과농축액 100ml에 미리 평형을 맞춘 세종류의 이온교환수지를 각각 처리한 후 1시간 동안 교반하면서 처리하고, 처리가 끝난 다음 흡입여과에 의하여 분리정제하였다. 이렇게 정제된 효소액내의 효소 역가를 측정하여 각 효소의 흡착정도를 비교하고 그 결과를 표3에 기재하였다.

상기 표3과 같이 트랜스글루코시다아제는 상기 이온교환수지에 전혀 흡착되지 않으며, 상기 이온교환수지 중에서 DEAE cellulose가 글루코아밀라아제 및 아밀라아제의 흡착효과가 가장 양호함을 알 수 있었다.

[실시예 2]

실시예1과 같은 한외여과농축액 100ml에 각각의 이온교환수지를 25%(w/v) 처리한 후 상온에서 1시간 동안 교반하여 처리한 다음 정제된 여과액을 얻었다. 이때의 이온교환수지 처리 전후의 트랜스글루코시다아제의 회수율을 측정하였고, 상기 정제된 시료를 이용하여 반응시켜 생성된 이소말토올리고당의 함량을 측정하였으며, 또한 각각의 이온교환수지를 혼합 처리하였을때 회수율 및 이소말토올리고당의 함량을 측정하였고 그 결과는 하기 표4에 기재하였다. 이때의 반응 조건으로는 이온엿(두산종합식품, 환원당 함량 48%)을 기질로 하여 25 브릭스(Brix)의 용액을 제조하고(pH 5.0), 여기에 기질 고형분 대비 0.15%(w/v,500 TGU기준)의 효소를 첨가하여 50℃에서 약 20시간을 반응시켰다.

상기 표4에서와 같이 DEAE cellulose를 단독으로 사용하거나 DEAE cellulose, WA30 또는 Amberite를 두가지로 조합처리하였을 경우에 이소말토올리고당의 함량이 기존의 미국, 일본수입제품 사용시보다 높은 결과를 얻었다.

Claims (8)

1. 아스파질러스속 곰팡이를 이용하여 글루코아밀라아제, 아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제가 포함된 배양액을 제조한 후 원심분리기 또는 압착여과기로 미생물을 제거하고 한외여과로 농축하여 한외여과농축액을 제조한 다음, 이에 음이온교환수지를 처리하여 글루코아밀라아제 및 아밀라아제를 흡착시켜 제거한 후 여과분리하므로써 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 음이온교환수지의 처리시 한외여과농축액의 조건이 pH가 4.2-5.2, 전기전도도가 500-2,000㎲, 포도당 당량(DE)이 10㎲/ml 이하 및 트랜스글루코시다아제의 역가가 시료 1ml에 300-1,000 TGU의 범위임을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 전기전도도가 800-1,200㎲임을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 음이온교환수지가 DEAE cellulose를 단독으로 사용하거나 DEAE cellulose, WA30(삼양사 제품) 또는 Amberite(시그마사)를 두가지 또는 그 이상을 조합처리하여 사용한것임을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 음이온교환수지의 사용양이 한외여과농축액의 5-40%(w/v)임을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 음이온교환수지의 사용양이 한외여과농축액의 10-30%(w/v)임을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 음이온교환수지의 처리무게가 아세테이트 완충용액(pH 4.2-5.2)으로 평형을 시킨 수분함유량이 약 50-80% 상태에서의 무게임을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 음이온교환수지의 사용방법이 배치식 또는 컬럼충전식을 포함하는 방법으로, 이는 한외여과농축액의 일회식 처리 방법과 연속시 처리방법을 포함함을 특징으로 하는 혼합효소계내에서 트랜스글루코시다아제의 분리정제 방법.