SU1723121A1 - Способ получени гиалуронидазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к микробиологической промышленности , и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов дл  приготовлени  лекарст- венных средств. Цель изобретени  - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы. Способ заключаетс  в том, что штамм Streptomyces actinocidus 77 выращивают глубинным способом, фильтрат культуральной жидкости подкисл ют до рН 4,4-4,6, осветл ют и сорбируют на карбоксильном катионите КМ-2п. Сорбент промывают и гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем при перемешивании и уголь отдел ют. Удельна  активность продукта 60 МЕ/мг, степень очистки 30. 2 з.п. ф-лы, 5.табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии ,-в частности к микробиологической промышленности , и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов дл  приготовлени  лекарственных средств.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ, в котором продуцент гиалуронидазы - штамм Streptomyces actinocidus 77 - выращивали глубинным способом, культуральную жидкость концентрировали вакуум-выпариванием при 40- 60°С и рН 7,5-8,5, фермент выдел ли осаждением из культуральной жидкости 3-4 объемами этилового спирта. В результате получали препарат гиалуронидазы с активностью 450-800 МЕ/г (колоримерический метод) и удельной активностью 7-10 МЕ/мг белка.

Недостатками данного технического ре-

шени   вл ютс  низка  активность и степень чистоты гиалуронидазы.

Цель изобретени  - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы.

Штамм Streptomyces actinocidus 77 выращивают глубинным способом на питательной среде определенного состава, фильтрат культуральной жидкости подкисл ют 2N сол ной кислотой до рН 4,4-4,6, осветл ют центрифугированием или фильтрацией и сорбируют на карбоксильном катионите КМ-2п (40-60 объемов на объем сорбента) со скоростью 50-100 мл/ч/см2, сорбент промывают 0,01 М ацетатным буфером рН 4,4-4,6, гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем в концентрации 1,0-1,5% при перемешивании и уголь отдел ют. Десорбцию можно провоXJ Ю СО

ю

дить либо в статических услови х при рН 8,5-8,7, либо в динамике растворами щелочи , аммиака или раствором фосфорнокислого натри  двузамещенного.

В табл, 1 представлены данные по подбору условий сорбции гиалуронидазы из 1 л фильтрата культуральной жидкости на колонке с карбоксильным катионитом Ш-2п объемом 20 мл (Ф 1,1 см, I 5 см). Дл  сравнени  приведены данные по сорбции гиалуронидазы на колонке тех же размеров с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) и некоторых других карбоксильных катионитах.

Из табл. 1 следует, что из п ти испытанных карбоксильных катионитов только КМ- 2п практически полностью сорбировал гиалуронидазу. Сорбцию фильтрата культуральной жидкости на катионите необходимо проводить в интервале рН 4,4-4,6, при этом на стадии подкислени  гиалуронидаз- на  активность сохран етс  на 60-70%, при снижении рН до 4,2 гиалуронидаза инакти- вируетс  сильнее и активность сохран етс  лишь на 50%. При увеличении рН до 4,8 количество фермента в проскоке достигает 15%, что уменьшает выход фермента.

Важное значение имеет скорость сорбции фильтрата культуральной жидкости на катионите. Оптимальным  вл етс  интервал 50-100 мл/ч/см . При уменьшении скорости ферментный раствор при кислых значени х рН (4,5) длительное врем  сорбируетс  на колонку, что приводит к снижению стабильности гиалуронидазы. В результате увеличени  скорости сорбции пропорционально повышаетс  выход фермента в проскоке и соответственно снижаетс  количество гиалуронидазы в элюате.

Гиалуронидазу десорбируют различными щелочными растворами в статических услови х в воду путем сдвига рН или в динамических услови х путем пропускани  различных элюентов через колонку с сорбентом .

Данные по подбору условий десорбции приведены в табл. 2 (сорбцию фермента проводили в оптимальных услови х; рН 4,5, скорость 70 мл/ч/см ).

Из табл. 2 следует, что десорбцию гиалуронидазы в статических услови х необходимо проводить при рН выше 8,5, при этом выход на стадии составл л 55-60%. Увеличение рН выше 8,8 приводило к элюции большого количества балластных белков, что вызывало уменьшение удельной активности в конечных препаратах (см. табл. 5).

В табл. 3 приведены экспериментальные данные по подбору условий обесцвечивани  растворов гиалуронидазы активированным углем.

Результаты опытов свидетельствуют о том, что при концентрации угл  1,0-1,5% происходит обесцвечивание раствора гиалуронидазы на 75-78% при сохранении активности на стадии до 85-90%. При снижении концентрации угл  в растворе остаетс  значительное количество пигментов, что отрицательно вли ет на качество препаратов . Увеличение концентрации угл  до

0 2,0% приводит к снижению выхода гиалуронидазы на стадии обесцвечивани .

Схема получени  гиалуронидазы по предлагаемому способу представлена в табл. 4.

5 Как видно из табл. 4, предлагаема  схема позвол ет получить гиалуронидазу высокой степени очистки с удельной активностью 60 МЕ/мг белка и общим выходом фермента 35%,

0 Пример (по прототипу). Продуцент гиалуронидазы Streptomyces actinocidus 77 выращивали в ферментере емкостью 250 л (заполнение 180 л) на среде, содержащей 3% гидролизата БВК, 0,8% сульфата аммо5 ни , 0,1 % «аНРСм. Аэраци  в процессе культивировани  дробна : первые 12 ч роста - 9 м /ч, затем до конца культивировани  27 м /ч, рН в начале культивировани  6,8, врем  выращивани  56 ч. По окончании

0 выращивани  мицелий отдел ют центрифугированием , фильтрат культуральной жидкости (150 л) упаривали в 10 раз. К концентрату добавл ли 4 объема охлажденного этилового спирта, осадок отдел ли на

5 нутч-фильтре и лиофилизировали. Получали препарат гиалуронидазы с активностью 450 МЕ/г и удельной активностью 8 МЕ/мг белка .

П р и м е р 1. Продуцент гиалуронидазы

0 выращивали на той же питательной среде, в теж же услови х, что и в примере по прототипу , мицелий отдел ли центрифугированием . Получали 150 л фильтрата культуральной жидкости с активностью 13 МЕ/мл и удель5 ной активностью 2,0 МЕ/мг белка. Фильтрат подкисл ли 2N сол ной кислотой до рН 4,5 и сорбировали на колонку (d 12 см, I 28 см) с 3,0 л карбоксильного катионита КМ- 2п кислотного гидролиза (биокарб К), урав0 повешенного 0,01 М ацетатным буфером рН 4,5. Скорость сорбции - 70 мл/ч/см2, врем  сорбции 19 ч. Катионит после сорбции переносили в емкость с мешалкой, дважды (по 3 л) отмывали 0,01 М ацетатным буфером рН

5 4,5. Гиалуронидазу десорбировали с катионита в статических услови х 7,5 л дистиллированной воды путем доведени  рН до значени  8,7 раствором 2 М едкого натри . Перемешивали смесь 15 мин, элюат отфильтровывали через капроновую ткань, затем

проводили повторную десорбцию фермента в тех же услови х. Элюаты объедин ли. Выход активности на стадии сорбции-десорбции составил 39%, активность 55 МЕ/млчК 15л элюата добавл ли 150 гактивированно- го угл  марки Б и перемешивали 30 мин. Уголь отдел ли центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. Ферментный раствор упаривали под вакуумом при 30°С до активности в растворе 130 МЕ/мл. Получили 3,5 л раствора, общий выход на стадии 92%. Удельна  активность 60 МЕ/мг белка, общий выход на схеме 39%, степень очистки 30 раз.

П р и м е р 2. Стадии получени  и очист- ки гиалуронидазы до стадии десорбции проводили аналогично примеру 1. Десорбцию с катионита проводили непосредственно на колонке в динамических услови х, использу  0,2 М раствор N32HP04. Элюирование производили со скоростью 14 мл/ч/см2. Фракции с гиалуронидазой объедин ли. Объем элюата - 30 л, рН -7,5. Выход активности на стадии сорбции - десорбции составил 38%. Активность 28 МЕ/мл. К 30 л элюата добавили 360 г активированного угл , перемешивали 30 мин и уголь отдел ли. Ферментный раствор обессоливали и концентрировали ультрафильтрацией. Объем полученного концентрата 5,2 л, активность 131 МЕ/мл. Удельна  активность 70 МЕ/мг белка, общий выход 34%, степень очистки 35.

Примеры 3-10. Продуцент гиалуронидазы выращивали как в примере 1, мице- лий отдел ли центрифугированием. Услови  сорбции и десорбции представлены в табл. 5.

Из табл. 5 следует, что десорбцию гиалуронидазы в статических услови х необхо- димо проводить при рН 8,5-8,8, при этом

выход фермента составл ет 31-35%, а удельна  активность достигаетс  49-60 МЕ/мг белка (примеры 4-6). Увеличение рН при десорбции больше 9,0 приводит к значительному снижению удельной активности в препарате. Наилучшие результаты по десорбции гиалуронидазы в динамике получены при использовании 0,2 М раствора форсфорнокислого натри  двузамещенно- го, при этом удельна  активность достигает 70 МЕ/мг белка (пример 10). Таким образом, предлагаемый способ позвол ет получать фермент с высокой степенью очистки. По сравнению с примером-прототипом удельна  активность гиалуронидазы выше в 7-9 раз (примеры 4, 10).

Claims (3)

1.Способ получени  гиалуронидазы. предусматривающий глубинное выращивание продуцента Streptomyces actinocidus 77, отделение мицели , выделение фермента из полученной культуральной жидкости и очистку, отличающийс  тем, что, с целью повышени  активности и степени чистоты гиалуронидазы, культуральную жидкость подкисл ют до рН 4,4-4,6, а очистку фермента ведут сорбцией через колонку с карбоксильным катионитом КМ-2п кислотного гидролиза со скоростью 50-100 мл/ч/см и десорбцией с катионита щелочными растворами, полученный элюат обесцвечивают активированным углем в концентрации 1,0-1,5% при перемешивании .

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что фермент десорбируют с катионита в статических услови х при рН 8,5-8,8.

3.Способ по п.1,отличающийс  тем, что фермент десорбируют промыванием катионита в колонке 0,2 М N32HP04.

Таблица 1

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица5