SU1655987A1 - Способ получени очищенной нейраминидазы холерного вибриона - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехноло гии, а именно к получению ферментов, в частности нейтраминидазы холерного вибриона . Целью изобретени   вл етс  упро щение и ускорение способа, а также увеличение выхода целевого продукта. Способ заключаетс  в том, что используют штамм Escherichia coli HB 101 pRD 39 № 124, содержащий гены нейраминидазы холернсмо виб риона. Культуральную жидкость диализируют против дистиллированной воды, концентрируют и очищают гель- фильтрацией с использованием трехком- понентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1. Элюцию ведут 0,01 М ацетатным буфе ром, рН 5,6. Удельна  активность целевого продукта 4300 ед/мг, выход по активности 83%, врем  очистки 1,5 - 2 ч. Продукт гомогенен по данным ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС-Na. 2 ил. сл С

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , к получению ферментов, частности нейраминидазы холерного вибриона.

Целью изобретени   вл етс  упрощение и уморение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Способ заключаетс  в том, что используют штамм Escherichia coli HB 101 pRD 39, fvfe 124 (коллекци  государственного научно- исследовательского института стандартизации и контрол  медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасе- вича), содержащий гены нейраминидазы холерного вибрирна. Культуральную жидкость штамма кишечной палочки диализуют против дистиллированной воды, концентрируют , затем развод т и очищают гель- фильтрацией с использованием 3- компонентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1 Элюцию ведут 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,6.

На фиг,1 показан профиль элюции фермента при фильтрации культуральной жидкости Е coli 124 через ультрагели АсА, где 1 - оптическа  плотность при 280 нм, 2 - ней- раминидазна  активность.

П р и м е р 1. Культивирование штамма- продуцента осуществл ют глубинным способом в колбах на 3000 мл, содержащих 500 мл бульона Хоттингера с 0,1% хлори- $того кальци , рН 7,2 при шуттелировании и 30°С в течение 8 - 10 ч. В питательную среду

о сл сл о со

4

внос т 5 об.% 18- часового посевного материала Е.соМ № 124, выросшего на среде этого же состава. После выращивани  клетки отбрасывают центрифугированием, а культуральную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют или концентрируют любым доступным способом в 7- 10 раз.

Дл  очистки 3 г лиофильно высушенного фильтрата Е.соМ № 124 раствор ют в минимальном количестве дистиллированной воды и нанос т на колонку (2х100см), заполненную последовательно ультрагел ми АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1 и уравновешенную 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,6. Скорость элюции 60 мл/ч, объем фракций 5 мл. Нейраминидаза опережает пиг- менти св занные с ним низкомолекул рные белки и выходит четким, компактным пиком активности. Фракции, обладающие нейра- минидазной активностью, объедин ют и анализируют чистоту в электрофорезе поли- акриламидного гел .

Нейраминидазную активность определ ют тиобарбитуровым методом. За единицу активности принимают также такое количество фермента, которое отщепл ет 1 мкг N-ацетилнейраминовой кислоты от овомуцина-белка куриных  иц в течение 15 мин при 37°С.

Удельна  активность полученного фермента 4300 ед/мг. Выход по активности 83%.

Таким образом, благодар  эффекту дозы гена в клетках предлагаемого штамма- продуцента E.coll № 124 получают высокоактивную культуральную жидкость (суммарный выход фермента определ етс  активностью исходного препарата), а использование дл  очистки 3- компонентной фильтрующей системы ультрагелей позвол ет одноэтапно получить гомогенный препарат нейраминидазы холерного вибриона в течение 1,5 - 2 ч.

На фиг.2 приведены результаты э,лект- рофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натри , подтверждающие гомогенность полученного препарата нейраминидазы.

Формул-а изобретени 

Способ получени  очищенной нейраминидазы холерного вибриона, включающий очистку культуральной жидкости культуры продуцента, отличающийс  тем, что,

с целью упрощени  и ускорени  способа и увеличени  выхода целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма продуцента Escherlchla colt ГИСК № 124, а очистку ведут гель-фильтрацией через систему ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1.

ед/мг

-то

-2000

Щиг.1

70,8

92,5

66,2

Фиг г

Claims (1)

1. • Формула изобретения

   Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона, включающий очистку культуральной жидкости культуры продуцента, отличающийся тем, что. с целью упрощения и ускорения способа и увеличения выхода целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма продуцента Escherichia coll ГИСК № 124, а очистку ведут гель-фильтрацией через систему ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1.

   зг,5

   70,8 :

   ' - 21,5

   7 -·· МА

   Фиг2