WO2020085951A1 - Способ получения рекомбинантной нейраминидазы из clostridium perfringens - Google Patents

Способ получения рекомбинантной нейраминидазы из clostridium perfringens Download PDF

Info

Publication number
WO2020085951A1
WO2020085951A1 PCT/RU2019/050186 RU2019050186W WO2020085951A1 WO 2020085951 A1 WO2020085951 A1 WO 2020085951A1 RU 2019050186 W RU2019050186 W RU 2019050186W WO 2020085951 A1 WO2020085951 A1 WO 2020085951A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nanh
neuraminidase
protein
chromatography
preparation
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/050186
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Викторович ЕРШОВ
Ольга Анатольевна ЕРШОВА
Вячеслав Сергеевич ЛЕОНОВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Publication of WO2020085951A1 publication Critical patent/WO2020085951A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology, and in particular to methods for the isolation and purification of recombinant proteins, in particular to the production of a highly purified preparation of recombinant NanH neuraminidase.
  • the main areas of application of the obtained bacterial neuraminidase NanH is its inclusion in the technological process of production of a number of therapeutic drugs, as well as biomedical research in the field of glycobiology, immunology and oncology.
  • the invention solves the problem of obtaining large quantities of highly purified enzymatically active recombinant NanH neuraminidase suitable for use at the remodeling stage in the preparation of therapeutically functional glycoprotein preparations with desired properties, as well as a tool for studying the structure, biosynthesis, regulation and function of stained glycoconjugates, for analysis and of revealing the links between disorders in the structure of glycoconjugates during oncogenesis and other pathological conditions in humans and animals x.
  • the method allows to obtain a preparation of recombinant NanH neuraminidase having a higher degree of purity compared to a commercial product, homogeneous in the target product, with a lower content of endotoxins in comparison with a commercial preparation, as well as a low content of producer residual DNA.
  • FIG. 1 Hydrolysis of the a-ketoside bond by sialidase (neuraminidase) between sialic acid and glycoprotein (glycolipid).
  • FIG. 2 Plasmid map pMT1617 (expression vector based on pET15 for the production of clostridial neuraminidase NANH_CLOPF).
  • FIG. 3. The dynamics of biomass accumulation during cultivation of the producer strain in a volume of 15 l according to the proposed scheme.
  • FIG. 4 The cultivation parameters of the producer strain in a volume of 15 l
  • FIG. 5 Analysis of the accumulation of neuraminidase protein by electrophoresis under reducing conditions in 8% PAAT during cultivation of the producer strain in a volume of 15 l.
  • FIG. 6 The result of the allocation of NanH. Analysis by electrophoresis in PAAT. Comparison of the commercial drug neuraminidase and the resulting drug NanH.
  • FIG. 7 Comparison of chromatographic profiles of neuraminidase (Worthington) and NanH neuraminidase of MBC “Generium” using gel filtration.
  • FIG. 8 The result of the analysis of GF HPLC. Industrial NanH Series.
  • FIG. 9 The result of the effect of reducing the amount of sialic acids in the protein preparation during the processing of NanH on a column on the number of isoforms and pi.
  • Neuraminidase NanH is an enzyme belonging to the glycosyl hydrolase family.
  • the nomenclature name is exo-a-sialidase. Also used are the names: a-neuraminidase, N-acylneuraminidate glycohydrolase, sialidase.
  • Sialidases hydrolyze the a-ketoside bond between opal acids and glycoproteins, as well as glycolipids and polysaccharides (Figure 1), they also modulate the content of sialic acid on the cell surface and regulate the immune system (Sheh-Yi Sheu b, Huen -juin Tseng a, Shu-ping Huanga, Chin-hsiang Chien, Cloning, ex-pression, and deletion analysis of large nanH of Clostridium perfringens ATCC 10543, // Enzyme and Microbial Technology - 2002. -V.31.- P.794-803, Annt M. Berry, Robert A. Lock, and James C.
  • sialidase Siliadases are widespread in nature, including viruses, protozoa, bacteria, fungi, mycoplasma and other microorganisms, birds, higher animals and people.
  • sialidase refers to the influenza virus (JN Var-ghese, WG Laver & R. M. Colman, Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neu-raminidase at 2.9 A resolution, // Nature- 1983, - V.303 , - P. 35-40), it is believed that it plays an important role in virus replication and release from infected cells.
  • sialidases play an important role in lysosomal catabolism, as well as in the modulation of functional molecules associated with many biological processes ( Koman-door E.
  • sialidases can be used to remove sialic acids as nutrients from various stained substrates or to recognize sialic acids located on the surface of cells. Despite the fact that bacterial sialidases have many similar structural features, their biochemical properties, especially their substrate specificity, vary widely. Bacterial sialidases can catalyze the hydrolysis of terminal sialic acids, bound a (2,3) -, and (2,6) - or a (2,8) - by bonding with a different range of substrates.
  • some of these enzymes can catalyze the transfer of sialic acids under special environmental conditions, including NanH neuraminidase, from sialoglycans to asia- loglycoconjugates through the mechanism of transglycosylation reaction and can be used in the synthesis of complex sialyl oligosaccharides using chemo-enzymatic approaches and analysis of the structure of the obtained glycans.
  • NanH neuraminidase can catalyze the transfer of sialic acids under special environmental conditions, including NanH neuraminidase, from sialoglycans to asia- loglycoconjugates through the mechanism of transglycosylation reaction and can be used in the synthesis of complex sialyl oligosaccharides using chemo-enzymatic approaches and analysis of the structure of the obtained glycans.
  • neuraminidase neuraminidase
  • SU 1655987 A1 Method for preparing purified neuraminidase from cholera vibrio, 1987, US Patent 3259550, Production of neuraminidase // 1966, US Patent 4071408, Neuraminidase // 1978.
  • the resulting neuraminidases are usually contaminated with glycohydrases, proteases, phospholipases, hemolysins., Bacterial endotoxins.
  • the claimed invention provides a method for producing recombinant NanH neuraminidase expressed in Escherichia coli in a microorganism that is generally not considered pathogenic to humans.
  • neuraminidase from Clostridium perfringens an anaerobic gram-positive genus Closrtidium perfringens, which causes gas gangrene isolated from culture fluid, was described in Stephan Nees, Rudiger W. Veh and Roland Schauer, Purification and Characterization of Neuraminidase from Clostrid perfumeens -Seyler's Z. Physiol. Chem .- 1975.- V.
  • Clostridium perfringens produces three neuraminidases, two of which have a molecular weight of 71 kDa (Nani) and 129 kDa (NanJ) and are secreted exosialidases (Jihong Li, Francisco A. Uzal and Bruce A. Me Clane, Clostridium perfringens Sialidases: Potential Contributors to Intestinal Pathogenesis and Therapeutic Targets. // -2016. -Toxins- VS- P.341-356), while the “small”, 43 kDa (NanH) isoenzyme remains in the cells (Peter Roggentin, Reinhard G. Kleineidam, Roland Schauer.
  • Nani 71 kDa
  • the large form of Nani is one of the most studied and best known bacterial salidases. It is obtained from Closrtidium perfringens on an industrial scale and used for scientific work. (Christina Traving, Roland Schauer, Peter Roggentin. Gene structure of the 'large' sialidase isoenzyme from Clostridium perfringens A99 and its relationship with other clostridial nanH proteins.
  • the gene was subcloned into Escherichia coli pLys S strain BL21 (DE3) with reduced protease activity.
  • the authors then obtain NanH as a fusion protein (a protein fused to a sequence of 6 histidines at the N terminus) using affinity chromatography on Ni-NTA agarose and subsequent hydrolysis of the fusion protein with aminopeptidase K, followed by dialysis and ion-exchange HPLC chromatography on EMD TMAE - 650S followed by concentration of the active fractions and dialysis to transfer to the finished buffer.
  • the yield from 1 L of the bacterial culture was about 1 mg of the purified NanH enzyme.
  • the inventors propose a new method for producing recombinant NanH neuraminidase from Clostridium perfringens, where the recombinant protein is produced in E. coli, and the protein is purified from the soluble fraction of the cell lysate using metal chelate chromatography followed by separation chromatography.
  • the yield of the highly purified active drug NanH neuraminidase is at least 1.0 g per liter of bacterial culture.
  • the main technical result of the invention is the production on an industrial scale of an active NanH protein having a high degree of purification of at least 87% chromatographic purity.
  • This protein is suitable for use in the manufacture of drugs and glycobiological studies.
  • a strain of a genetically modified microorganism E.coli NANH_CLOPF was created: the strain was obtained by transforming the recipient host strain BL2l (DE3) with plasmids pLysS carrying the T7 lysozyme gene, which is an inhibitor of T7 RNA polymerase, pMT 1617 (pETl5bFAN) carrying the gene of the NANH CLOPF protein, an integral part of which is a sequence of 20 amino acid residues containing a hexahistidine tag and 382 amino acid residues of sialidase (NanH) Clostridium perfringens.
  • Figure 2 the strain was obtained by transforming the recipient host strain BL2l (DE3) with plasmids pLysS carrying the T7 lysozyme gene, which is an inhibitor of T7 RNA polymerase, pMT 1617 (pETl5bFAN) carrying the gene of the NANH CLOPF protein, an integral part of which is a sequence
  • a plasmid map pMT1617 is presented (an expression vector based on pET15b for the preparation of clostridial neuraminidase NANH CLOPF).
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the NanH protein optimized for translation into E. coli is shown in SEQ III N01.
  • expression was constructed a plasmid vector encoding a chimeric protein with N-terminal chimerization composed of six histidine peptide sequences, a thrombin recognition site, and 382 amino acid residues of sialidase (NanH) from Clostridium perfringens. (the amino acid sequence represented by SEQ W NO 2),
  • the target NanH protein is recovered from cells by lysis of bacterial cells using a high pressure homogenizer.
  • the preparation of an active, chromatographically homogeneous with a low content of bacterial endotoxins and host DNA NanH preparation is achieved by chromatographic purification, which includes metal chelate chromatography and separation anion exchange chromatography.
  • the main purification of the target protein from bacterial endotoxins and impurity proteins is carried out at the stage of anion exchange chromatography.
  • concentration anion exchange chromatography allows the target NanH protein to be eluted in high concentration and in a finished buffer, excluding the steps of concentration and buffering on membranes and hollow fibers.
  • the target protein is further purified from bacterial endotoxins and impurity proteins.
  • NanH genetic engineering constructs (HECs) of pMT1617 (pETl5b-NANH_CLOPF) are obtained.
  • HECs genetic engineering constructs
  • pET15b (+) vector Novagen
  • NANH CLOPF synthetic nanH gene
  • NanH sequence was checked on the website http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html.
  • the correspondence of the translated amino acid sequence ordered is confirmed by alignment in the MEGA 6.0 program.
  • the absence of unwanted restriction sites was confirmed using CloneManager 9.0 software.
  • the absence of unwanted restriction sites was confirmed using CloneManager 9.0 software.
  • the synthesis and restriction mapping of the synthetic gene pAPGl lO-NANH_CLOPE was performed.
  • the fragment encoding clostridial neuraminidase NanH (NANH_CLOPF) from plasmid pAPGl lO-NANH_CLOPF was cloned into the vector plasmid pET15b at the Ndel, BamHII restriction sites. The fragments obtained during restriction were purified and used for ligation.
  • Chemically competent E. coli XL10-GOLD cells were transformed with a ligase mixture. Cells were seeded to obtain transformed clones.
  • Plasmid DNA was then isolated and restriction mapping was performed using BsrFI restriction endonuclease. A sample of plasmid DNA was transferred for sequencing to the company "Eurogen”. The resulting sequence was aligned with the "theoretical" sequence pMT1617.
  • plasmid DNA GIC pMT1617 was transformed into strains BL2l (DE3) pLysS. Based on analytical expression, NanH superproducing clones were selected. Then, the super producer NanH strain was obtained. To obtain the target NanH protein, preparative expression was performed by culturing the producer in a complete nutrient medium with a relative dissolved oxygen content of at least 10% at a temperature of 37 ° C, pH value of 6, 5-7, 6. The duration of the cultivation process is 6-8 hours.
  • IPTG isopropyl-R-E-1-thiogalactopyranoside
  • the stage of biosynthesis of the hybrid protein begins.
  • the expression of the neuraminidase protein is under the control of a promoter that is depressed by introducing an IPTG solution to a final concentration of 0.0238 wt.%. Cultivation was carried out for 6-8 hours.
  • the level of biosynthesis of variants of the target protein of neuraminidase is at least 0.65 g / l of culture fluid.
  • Bacterial biomass was collected by centrifugation and stored at minus 70 ° C. Cell biomass was lysed, the lysate was clarified by centrifugation, and NanH protein was isolated from the lysate by binding to the target protein by metal chelate column chromatography with Ni2 + IMAC Sepharose FF. The enzyme was annealed by anion exchange chromatography on Q Sepharose FF. At each stage, the degree of purification was monitored by electrophoresis in PAAT.
  • the protein yield is at least 1.0 g per liter of bacterial culture.
  • the final product obtained according to the invention has the following parameters:
  • the specific activity of the NanH preparations of the present invention is from 20 units / mg protein and above.
  • the content of bacterial endotoxins in the NanH preparation of the present invention is not more than 4.3 IU / mg protein.
  • the residual DNA content of the producer strain in the NanH preparation of the present invention is not more than 4.47 pg / mg protein.
  • NanH based on an optimized synthetic DNA sequence with a short sequence of six histidines at the N-terminus of the recombinant protein occurs without removing the hexahistidine tag, which makes it possible to simplify the purification and remove the use of expensive tag removers from the purification scheme.
  • the amino acid sequence of NanH is represented by SEQ W NO 2.
  • a commercially available sorbent IMAC Sepharose 6 FF in metal chelate chromatography.
  • the use at this stage of washing with acidic buffer with high ionic strength can significantly remove impurities of cellular proteins from the target product.
  • Anion exchange chromatography is then carried out, for which the sorbent Q Sepharose FF can be used.
  • the use of these sorbents does not limit all embodiments of the invention, and a specialist can use any known sorbents suitable for metal chelating and anion-exchange chromatography of proteins with hexahistidine tag in protein purification.
  • An essential condition necessary to achieve a technical result is the sequence of stages of metal chelate and anion exchange chromatography.
  • the conditions for landing and removal of the target protein are selected for each stage and each sorbent using conventional techniques known to a qualified specialist, so as to maximize purification target protein from contaminating impurities of cellular proteins and bacterial endotoxins.
  • a highly purified active drug NanH was obtained, suitable for use in the manufacture of drugs and glycobiological studies, with a yield of at least 1 g per liter of bacterial culture.
  • Concentration of the purified preparation was carried out using concentration anion exchange chromatography, for which the sorbent Q Sepharose FF can also be used.
  • the specific activity of the NanH preparations obtained by the method disclosed in the invention is 20 units / mg protein and higher; the content of bacterial endotoxins is less than 4.3 EU / mg protein; the residual DNA content of the producer strain is not more than 4.47 pg / mg protein.
  • the claimed method allows to obtain a recombinant NanH preparation having a higher degree of purity compared to commercial analogues, the comparison results are presented in Table 1.
  • the producer strain was cultured in a fermenter (Biotron LiFlus SP / SL-20L, South Korea) in a volume of nutrient medium of 15 l. while maintaining a pH of 7.0-7.1. Cultivation was carried out at a temperature of 37 ° C. The relative content of dissolved oxygen was maintained at a level of 25-100% by stirring at a speed of 800 rpm and air supply with a volumetric flow rate of 15 l / min. Before starting the process, a 50% glucose solution is aseptically introduced into the cooled nutrient medium to a final concentration of 0.5%. The inoculum in a volume of 0.75 l, grown to an optical density measured at a wavelength of 600 nm (OD600) equal to 1.3 p.u.
  • Cultivation is carried out for 10 hours.
  • the final optical density is 27.2 pu
  • the biomass yield is 100 g / l.
  • Productivity for the target product is 1 g / l of culture fluid.
  • Fig.Z. presents the dynamics of biomass accumulation during cultivation of the producer strain
  • Fig.4. presents the parameters of cultivation
  • Fig.5. An analysis of the accumulation of neuraminidase protein during cultivation by electrophoresis is presented.
  • Example 2 Isolation and purification of NanH protein from bacterial biomass. Obtaining an industrial series of the drug NanH.
  • the frozen cell biomass of 128 g is suspended in 160 ml of buffer A with PMSF up to 0.003% for 15 min on ice and destroyed in a Panda Plus 2000 high-pressure flow homogenizer (GEA Niro Soavi).
  • the homogenizer is washed with 250 ml of purified water cooled to 0 ° C, adjusted to buffer A cooled to 0 ° C, setting of stage II is 135 bar, setting of stage I is 630-780 bar, then the cell suspension is lysed in this mode, collecting the lysate into a container placed in an ice bath, the homogenizer is washed with 30 ml of buffer A.
  • the lysis is repeated 2 more times in the same mode.
  • a 1,400 ml lysate was clarified by centrifugation at 33250 x g (JLA-16.250) at 4 ° C for 120 minutes.
  • the supernatant is 1300 ml, diluted with buffer A to 1400 ml, adjusted to pH 7.8 with 2 M NaOH, filtered through a Sartopor 2,300 depth filter, imidazole is added to a concentration of 3 mM and applied to a Ni2 + IMAC Sepharose column equilibrated with buffer A. After application, the column is washed buffer A, sodium acetate buffer with 1 M NaCl, pH 5.8, washed with a buffer containing 15 mm imidazole. The target protein is eluted with 300 mM imidazole.
  • the eluate with M 2+ IMAC Sepharose was diluted 6 times, adjusted to pH 7.8 with 2M NaOH, clarified by centrifugation at 33250 x g (JLA-16.250) at 4 ° C for 20 minutes and applied to a Q Sepharose FF column equilibrated with 20 buffer mM Tris HC1, pH 7.8. Wash with the same buffer until the eluate of the adsorbed components is released and then with 20 mM Tris HC1, 5tM EDTA, pH 7.5 buffer to an optical density of 20 mAEG. Elute the target protein with the same buffer.
  • the eluate was diluted 5 times and again applied to a Q Sepharose FF column, equilibrated with 20 mM Tris HCl buffer, pH 7.8. Wash off with equilibration buffer until the eluate leaves the adsorbed components, then with 20 mM Tris HC1, 5tM EDTA, pH 7.5 buffer until conductivity reaches 2.7 mSm / sm, elute with the same buffer containing 70 mM NaCl. 2.5 Dilution, sterilizing filtration and packaging.
  • the eluate with Q Sepharose FF -2 is diluted with the finished buffer: 20 mM Tris HC1, 5tM EDTA, 70 mM NaCl, pH 7.5 to a protein concentration of 1.0 -3.0 mg, ml, and sterilely filtered through FIFTER-MAX, “rapid ”-150 ml, 0.22 pm, aliquot and store at minus 20 ° C.
  • the purity of the sample by GF HPLC is: 90.0%.
  • Residual DNA of producer strain (E. colli): ⁇ 1.7 pg / mg.
  • the Neuraminidase Assay Kit (Sigma-Aldrich, cat # MAK121) was used.
  • the neuraminidase activity in the sample is directly proportional to the amount of product, the content of which is measured colorimetrically at a wavelength of 570 nm.
  • the linear measurement range is between 0.1-10 units / F.
  • the activity of the samples is higher than 10 units / L, dilute the samples in BHF for neuraminidase (20 mM Tris HCl, 5mM EDTA, 70 mM NaCl, pH 7.5), and then in the same buffer, but containing BSA at a concentration of 0.1 mg / ml (taking into account further dilution factor).
  • BHF neuraminidase
  • a sample in a volume of 20 ⁇ l was added to two wells of a 96-well plate. One well will be used to determine the activity of the sample, the second as a blank (Sample blank).
  • the optical density of the samples and standards was measured after 20 minutes at a wavelength of 570 nm.
  • AMsample, AMblank, AMwater - the difference in optical densities of the sample, Sample blank and water.
  • t is the time between measurements of optical density (30 min).
  • Electrophoresis is carried out in a 4-20% gradient PAGE under reducing conditions, stained with silver salts (Thermo Scientific).
  • Sample preparation of samples is carried out by diluting the samples to a concentration of ⁇ 50 ⁇ g / ml by adding a buffer for applying samples (S.b.) with the addition of a 2 M solution of dithiothreitol (DTT). Warm up for 5 minutes at (100 ⁇ 2) OS. Centrifuged for 1 min., 13000 rpm and apply samples (solutions obtained by diluting the samples) 10 ⁇ l per well of gel, molecular weight markers - 5 ⁇ l per well of gel.
  • DTT dithiothreitol
  • Electrophoresis is carried out at a voltage of 400 V, current strength of 30 mA, until the dye. Then stained with silver salts according to the instructions for the Thermo Scientific kit. The results are presented in Fig.6.
  • Example 5 Testing purified preparations of recombinant NanH in comparison with a commercial preparation of neuraminidase for the content of bacterial endotoxins.
  • Positive result the formation of a dense clot of gel. When the tube is turned 180 degrees, the gel does not break. Negative result: the gel does not form or breaks when the tube is turned over.
  • Example 6 Testing the chromatographic purity of purified recombinant NanH preparations in comparison with a commercial neuraminidase preparation
  • the chromatographic purity of the NanH MBC Generium is shown in FIG. 8 is significantly higher than the commercial preparation of neuraminidase, the results are presented in Table 4. Table 4. Comparison of the commercial preparation of neuraminidase and the resulting preparation of recombinant NanH chromatographic purity.
  • Example 7 Testing purified recombinant NanH preparations for residual DNA of a producer strain.
  • Testing for the residual DNA of the producer strain is carried out by real-time quantitative PCR, not more than 20 pg / mg.
  • QPCR quantitative polymerase chain reaction
  • the Taqman system was chosen, in which, upon propagation of a specific DNA sequence, the probe is degraded by DNA polymerase.
  • the samples were purified using the QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). The final volume during elution was 50 ⁇ l. 10 ⁇ l of sample was added to the qPCR reaction (sample). The number of repeats for each sample is 3.
  • the amount of DNA in the sample is less than 0.5 pg below the limit of reliable detection.
  • the results of the analysis are presented in Table 5.
  • Example 8 The study of the effect of reducing the amount of sialic acids in the protein preparation when processing NanH on a column on the number of isoforms and pi.
  • VIELDGALIMSTR YDYSGYRAA YISHDLGTTWEIYEPLNGKILTGKGSGCQGSFIKA TTSNGHRI

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам выделения и очистки рекомбинантных белков, в частности к получению высокоочищенного препарата рекомбинантной нейраминидазы NanH. Получение активного, хроматографически гомогенного с низким содержанием бактериальных эндотоксинов и ДНК хозяина препарата NanH в промышленных масштабах достигается благодаря схеме хроматографической очистки, включающей в себя металлохелатную хроматографию и разделяющую хроматографию. Нейраминидазу ДНК, без удаления содержащейся на N- конце рекомбинантного белка короткой последовательности из шести гистидинов, что позволяет упростить очистку и удалить из схемы очистки применение дорогостоящего препарата тромбина. Уже на первой стадии металлохелатной хроматографии происходит максимальная очистка целевого белка от контаминирующих примесей клеточных белков. В результате применения предлагаемого способа получения нейраминидазы NanH получен более высокий, по сравнению с применяемыми ранее способами, выход целевого белка: не менее 1,0 г с 1 л культуральной жидкости.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ НЕИРАМИНИДАЗЫ ИЗ
CLOSTRIDIUM PERFRIN GEN S
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам выделения и очистки рекомбинантных белков, в частности к получению высокоочищенного препарата рекомбинантной нейраминидазы NanH. Основными сферами применения полученной бактериальной нейраминидазы NanH является включение её в технологический процесс производства ряда терапевтических препаратов, а также биомедицинские исследования в области гликобиологии, иммунологии и онкологии.
Изобретение решает задачу получения больших количеств высокоочищенной ферментативно-активной рекомбинантной нейраминидазы NanH, пригодной для использования на стадии ремоделирования в получении терапевтически функциональных препаратов гликопротеинов с заданными свойствами, а также в качестве инструмента для изучения структуры, биосинтеза, регуляции и функции сталированных гликоконьюгатов, для анализа и выявления связей между нарушениями строения гликоконьюгатов при онкогенезе и других патологических состояниях человека и животных.
Способ позволяет получить препарат рекомбинантной нейраминидазы NanH, имеющей более высокую степень чистоты по сравнении с коммерческим препаратом, гомогенной по целевому продукту, с более низким содержанием эндотоксинов в сравнении с коммерческим препаратом, а также низким содержанием остаточной ДНК продуцента.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Гидролиз a-кетозидной связи сиалидазой (нейраминидазой) между сиаловой кислотой и гликопротеином (гликолипидом).
Фиг. 2. Плазмидная карта рМТ1617 (экспрессионный вектор на основе рЕТ15Ь для получения клостридиальной нейраминидазы NANH_CLOPF).
Фиг. 3. Динамика накопления биомассы при культивировании штамма - продуцента в объеме 15 л по предлагаемой схеме. Фиг. 4. Параметры культивирования штамма-продуцента в объеме 15 л.
Фиг. 5. Анализ накопления белка нейраминидазы методом электрофореза в восстанавливающих условиях в 8% ПААТ при культивировании штамма-продуцента в объеме 15 л.
Фиг. 6. Результат выделения NanH. Анализ электрофорезом в ПААТ. Сравнение коммерческого препарата нейраминидазы и полученного препарата NanH.
Фиг. 7. Сравнение хроматографических профилей нейраминидазы (Worthington) и нейраминидазы NanH МБЦ «Генериум» при помощи гель- фильтрации.
Фиг. 8. Результат анализа ГФ ВЭЖХ. Промышленная серия NanH.
Фиг. 9. Результат влияния снижения количества сиаловых кислот в препарате белка при обработке NanH на колонке на количество изоформ и pi.
Отсутствие отечественных коммерчески доступных препаратов рекомбинантной нейраминидазы NanH из Clostridium perfringens, экспрессированных в E.coli, и чрезвычайно высокая стоимость препаратов у зарубежных производителей делает коммерчески невыгодным использование этих препаратов при производстве лекарственных средств. Препараты данных фирм производятся не в соответствии со стандартами «Надлежащей производственной практики» /«Good Manufacturing Practice» (GMP) и предназначены только для аналитических исследований.
Нейраминидаза NanH — фермент, относящийся к семейству гликозил- гидролаз. Номенклатурное название — экзо-а-сиалидаза. Также употребимы названия: а-нейраминидаза, N-ацилнейраминидатгликогидролаза, сиалидаза.
Сиалидазы гидролизуют a-кетозидную связь между опаловыми кислотами и гли-копротеинами, а также гликолипидами и полисахаридами (Фиг.1), они также модулиру-ют содержание сиаловой кислоты на поверхности клетки и регулируют иммунную си-стему (Sheh-Yi Sheu b, Huen-juin Tseng a, Shu-ping Huanga, Chin-hsiang Chien, Cloning, ex-pression, and deletion analysis of large nanH of Clostridium perfringens ATCC 10543, //Enzyme and Microbial Technology - 2002. -V.31.- P.794-803, Annt M. Berry, Robert A. Lock, and James C. Paton, Cloning and Characterization of nanB, a Second Streptococcus pneumoniae Neuraminidase Gene, and Purification of the NanB Enzyme from Recombinant Escherichia coli, // Journal of bacteroliology - 1996,- V.178.-N.16.-P. 4854-4860).
Силиадазы широко распространены в природе, включая вирусы, простейших, бак-терии, грибы, микоплазму и другие микроорганизмы, птиц, высших животных и людей. Возможно, наиболее широко изученная сиалидаза относится к вирусу гриппа (J.N. Var-ghese, W. G. Laver & Р. М. Colman, Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neu-raminidase at 2.9 A resolution, // Nature- 1983, - V.303, - P. 35-40), считается, что она играет важную роль в репликации вируса и высвобождении из инфицированных клеток. У лю-дей сиалидазы играют важную роль в лизосомальном катаболизме, а также в модуляции функциональных молекул, связанных со многими биологическими процессами (Koman-door Е. Achyuthan, Ann М. Achyuthan, Comparative enzymology, biochemistry and pathophys-iology of human exo-a-sialidases (neuraminidases), // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology - 2001. -V. 129.- P. 29-64). Нарушение их экс- прессии и биосинтеза может привести к медицинским проблемам, таким как онкология, сиалидоз и галактосиалидоз. Изменения в сиалидазной активности также обнаруживают-ся при неврологических и психических расстройствах, таких как эпилепсия, алкоголизм, шизофрения и тяжелая депрессия. (Miyagi Т, Yamaguchi К., Mammalian sialidases: physiolog-ical and pathological roles in cellular functions, // Glycobiol - 2012, -V, 22. -P. 880-896).
В бактериях сиалидазы могут использоваться для удаления сиаловых кислот в ка-честве питательных веществ из различных сталированных субстратов или для распозна-вания сиаловых кислот, расположенных на поверхности клеток. Несмотря на факт, что бактериальные сиалидазы обладают многими схожими структурными особенностями, их биохимические свойства, особенно их субстратная специфичность, широко варьируются. Бактериальные сиалидазы могут катализировать гидролиз концевых сиаловых кислот, связанных а (2,3) -, а (2,6)- или а (2,8)- связью с различным диапазоном субстратов. Кроме того, некоторые из этих ферментов могут катализировать перенос сиаловых кислот при особых условиях среды, в том числе и нейраминидаза NanH, из сиалогликанов в асиа- логликоконъюгаты через механизм реакции трансгликозилирования и могут быть ис-пользованы в синтезе сложных сиалилолигосахаридов с помощью хемоэнзиматических подходов и анализа структуры полученных гликанов. (Seonghun Kim, Doo-Byoung Oh,Hyun Ah Kang, Ohsuk Kwon, Features and applications of bacterial sialidases //Appl Micro-biol Biotechnol -2011.- V.91. -P.1-15 ).
Хемоэнзиматический синтез с использованием ферментов, особенно сиалидаз, ко-торые могут выборочно проводить региостереоспецифическое формирование связи при мягких условиях реакции, был выделен в качестве перспективного метода для преодоле-ния ограничений, связанных с классическим химическим синтезом. Schmidt D, Sauerbrei В, Thiem J., Chemoenzymatic synthesis of sialyl oligosaccharides with sialidases employing transglycosylation methodology// J Org Chem- 2000. - V. 65.- P.8518-8526. Региоселектив-ный гидролиз бактериальными сиалидазами может быть использован в качестве инстру-мента для анализа структуры сталированных гликанов (Estrella R.P., Whitelock J.M., Rou-bin R.H., Packer N.H., Karlsson N.G., Small-scale enzymatic digestion of glycoproteins and pro- teoglycans for analysis of oligosaccharides by LC-MS and FACE gel electrophoresis,/// Methods Mol Biol- 2009.- V.534.-P.171-92.).
Таким образом, очевидна потребность в качественных препаратах сиалидаз, отвечающим постоянно растущим требованиям фармакологии и гликобиологии.
Многие микроорганизмы или бактериальные источники, используемые в настоящее время для производства нейраминидаз, являются либо патогенами человека, либо эти микроорганизмы и источники требуют относительно сложных ростовых сред и условий и дают лишь небольшие количества желаемого фермента, нейраминидазы (SU 1655987 А1, Способ получения очищенной нейраминидазы из холерного вибриона, 1987, US Patent 3259550, Production of neuraminidase // 1966, US Patent 4071408, Neuraminidase // 1978). Кроме того, получающиеся в результате нейраминидазы обычно загрязняются гликогидразами, протеазами, фосфолипазами, гемолизинами., бактериальными эндотоксинами. Эти примеси трудно удалить из полученной нейраминидазы. В заявленном изобретении предоставлен способ получения рекомбинантной нейраминидазы NanH, экспрессированной в Escherichia coli, в микроорганиизме, обычно не считающимся патогенным для человека. Впервые нейраминидаза из Clostridium perfringens, анаэробного грам- позитивного рода Closrtidium perfringens, вызывающего газовую гангрену, выделенная из культуральной жидкости, охарактеризована в публикации Stephan Nees, Rudiger W. Veh and Roland Schauer, Purification and Characterization of Neuraminidase from Clostridium perfringens, // - Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.- 1975.- V. 356. -P. 1027 -1042. Гены нейраминидазы были успешно клонированиы и секвенированы (Peter Roggentin, Bernd Rothe, Friedrich Lottspeich, Roland Schauer. Cloning and sequencing of a Clostridium perfringens sialidase gene.//- 1988.- FEBS Lett. - V. 238(1). - P.31-34).
В последующих исследованиях было выяснено, что Clostridium perfringens производит три нейраминидазы, две из которых имеют молекулярную массу 71 кДа (Nani) и 129 kDa (NanJ) и являются секретируемыми экзосиалидазами (Jihong Li, Francisco A. Uzal and Bruce A. Me Clane, Clostridium perfringens Sialidases: Potential Contributors to Intestinal Pathogenesis and Therapeutic Targets. // -2016. -Toxins- V. S.- Р.341-356), в то время как «маленький», 43 кДа (NanH) изофермент остается в клетках ( Peter Roggentin, Reinhard G. Kleineidam, Roland Schauer. Diversity in the Properties of Two Sialidase Isoenzymes Produced by Clostridium perfringens spp.// - 1995- Biol. Chem. Hoppe-Seyler.-V. 376.- P 569-575). Большая форма Nani (71 кДа) одна из самых изучаемых и наиболее известных бактериальных саилидаз. Ее получают из Closrtidium perfringens в промышленных масштабах и используют для научных работ. (Christina Traving, Roland Schauer, Peter Roggentin. Gene structure of the 'large' sialidase isoenzyme from Clostridium perfringens A99 and its relationship with other clostridial nanH proteins. //Glycoconjugate Journal.- 1994. -V. 11.- P.141-151., Akihisa Takamizawa, Shigeru Miyata, Osamu Matsushita, Masato Kaji, Yuki Taniguchi,Eiji Tamai, Seiko Shimamoto, and Akinobu Okabe, High-level expression of clostridial sialidase using a ferredoxin gene promoter-based plasmid. //- 2004.- Protein Expression and Purification,- V. 36-P.70-75. ) В то время как малая форма, хотя она и была клонирована и секвенирована одной из первых, долгое время не была хорошо изучена, поскольку все попытки очистить этот фермент из культуральной жидкости Clostridium perfringens были либо безуспешными, либо фермент выделялся в очень небольших количествах и был загрязнен примесями двух других ферментов. В работе Peter Roggentin, Reinhard G. Kleineidam and Roland Schauer. Diversity in the Properties of Two Sialidase Isoenzymes Produced by Clostridium perfringens spp. // - 1995.- Biol. Chem. Hoppe-Seyler.- V. 376. - Р. 569-575., впервые была получена и охарактеризована клонированная в Escherichia coli «малая», (43 кДа) нейраминидаза NanH.
В публикации Susanne Kruse, Reinhard G. Kleineidam, Peter Roggentin, Roland Schauer, Expression and Purification of a Recombinant“Small” Sialidase from Clostridium perfringens A99. // Protein expression and purification.- 1996. -V.7. -P. 415— 422., был предложен способ получения очищенной NanH в исследовательских целях, по сути наиболее близкий к заявленному изобретению. Структурный ген очищали с помощью метода ПЦР и вводили в плазмидный вектор pQE-lO, перенося шестигидидиновую аффинную метку (His6) на N-конец белка. Чтобы свести к минимуму протеолитическую деградацию белка, ген субклонировали в штамм BL21 (DE3) Escherichia coli pLys S с уменьшенной протеазной активностью. Затем авторы получают NanH в виде фьюжен-белка (белка, слитого с последовательностью из 6 гистидинов на N конце) с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA agarose и последующим гидролизом фьюжен-белка аминопептидазой К, с последующим диализом и ионообменной ВЭЖХ хроматографией на EMD ТМАЕ- 650S с последующим концентрированием активных фракций и диализом для перевода в буфер готовой формы. Выход с 1 л бактериальной культуры составил по данным авторов около 1мг очищенного фермента NanH.
Данный метод выделения имеет свои очевидные недостатки для получения фермента в промышленных масштабах:
1. Низкий выход целевого белка.
2. Данная схема очистки с использованием аминопептидазы К является неприемлемой для масштабного производства препарата.
3. Использование ВЭЖХ чрезвычайно повышает стоимость продукта в связи с использованием дорогостоящих колонок, сорбентов, высокоочищенных растворителей. Масштабирование хроматографического разделения, как правило, проводится при низком давлении и целью является производство максимально возможного количества продукта в кратчайшие сроки и при минимуме затрат.
4. Авторы не сообщают об уровне содержания в препарате бактериальных эндотоксинов. Удаление бактериальных эндотоксинов является принципиальным и необходимым требованием, как с точки зрения российских, так и международных стандартов (ГФ XIII, Document Q AS/ 11.452 FINAL July 2012). Однако оно является технически трудновыполнимой задачей, поэтому содержание бактериальных эндотоксинов в промежуточных продуктах, применяемых при производстве ЛС, является критическим параметром.
5. Не оцениваются такой потенциально опасный контаминант, как клеточная ДНК, в том числе потенциально онкогенная.
Для решения задачи получения высокоочищенной нейраминидазы NanH в промышленных объемах авторы изобретения предлагают новый способ получения рекомбинантной нейраминидазы NanH из Clostridium perfringens, где рекомбинантный белок продуцируют в E.coli, а очистку белка из растворимой фракции клеточного лизата с проводят помощью металлохелатной хроматографии с последующей разделяющей хроматографией. Выход высокоочищенного активного препарата нейраминидазы NanH, пригодного для использования на производстве ЛС и гликобиологических исследований, составляет не менее 1,0 г с литра бактериальной культуры.
Основным техническим результатом изобретения является получение в промышленных масштабах активного белка NanH, имеющего высокую, не менее 87% хроматографической чистоты степень очистки. Данный белок пригоден для использования на производстве ЛС и гликобиологических исследований.
Для осуществления изобретения был создан штамм генно-инженерно- модифицированного микроорганизма E.coli NANH_CLOPF: штамм получен трансформацией реципиентного штамма-хозяина BL2l(DE3) плазмидами pLysS, несущей ген Т7 лизоцима, являющегося ингибитором Т7 РНК полимеразы, рМТ 1617 (pETl5b-NANH_CLOPF), несущей ген белка NANH CLOPF, составной частью которого являются последовательности 20 аминокислотных остатков, содержащих гексагистидиновый тэг, и 382 аминокислотных остатков сиалидазы (NanH) Clostridium perfringens. На Фиг.2. представлена плазмидная карта рМТ1617 (экспрессионный вектор на основе рЕТ15Ь для получения клостридиальной нейраминидазы NANH CLOPF). Оптимизированная для трансляции в E.coli нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующий белок NanH, приведена в составе SEQ Ш N01. Таким образом, был сконстурирован экспрессионный плазмидный вектор, кодирующий химерный белок с N-концевой химеризацией, составленной пептидными последовательностями шести гистидинов, сайт узнавания тромбина, а также 382 аминокислотных остатков сиалидазы (NanH) из Clostridium perfringens. (аминокислотная последовательность представлена SEQ Ш NO 2),
Рефолдинг продукта не требуется, так как он синтезируется в бактериальной цитоплазме преимущественно в растворенном состоянии при культивировании штамма- продуцента E.coli с уровнем биосинтеза вариантов целевого белка не менее 1г/л культуральной жидкости. Целевой белок NanH извлекают из клеток при лизисе бактериальных клеток с использованием гомогенизатора высокого давления.
Получение активного, хроматографически гомогенного с низким содержанием бактериальных эндотоксинов и ДНК хозяина препарата NanH достигается благодаря хроматографической очистке, включающей в себя металлохелатную хроматографию и разделяющую анионообменную хроматографию .
Основная очистка целевого белка от бактериальных эндотоксинов и примесных белков осуществляется на стадии анионообменной хроматографией.
В некоторых случаях включение в процесс дополнительной стадии - концентрирующей анионообменной хроматографии - позволяет элюировать целевой белок NanH в высокой концентрации и буфере готовой формы, исключая стадии концентрирования и перевода в буфер на мембранах и полых волокнах.
Если концентрация ЭДТА в элюирующем буфере при проведении элюции целевого белка не превышает концентрацию 5 мМ, целевой белок дополнительно очищается от бактериальных эндотоксинов и примесных белков.
Материалы и методы
Для экспрессии NanH получают генно-инженерные конструкции (ГИК) рМТ1617 (pETl5b-NANH_CLOPF). Для получения ГИК, кодирующих NanH, была разработана схема клонирования на базе вектора рЕТ15Ь(+) (Novagen), предполагающая получение версии, имеющей 6><His-tag на N-конце. Для получения соответствующей ГИК в компании TOP Gene Technologies был заказан синтетический ген nanH (NANH CLOPF), (предполагающий получение геномной последовательности бактерии Clostridium perfringens, кодирующей 382 аминокислотных остатка сиалидазы (NanH), слитой на 5’ -конце с частью векторной последовательности материнской плазмиды рЕТ15Ь(+)), кодирующий NANH CLOPF, фланкированный сайтами рестрикции Ndel, ВашШ и содержащий на З’-конце последовательности стоп-кодоны (TGATAA). В TOP Gene Technologies провели кодон-оптимизацию последовательности для экспрессии белка в E.coli, принимая во внимание требование об отсутствии в последовательности «внутренних» сайтов эндонуклеаз рестрикции Ndel, ВашШ, Xhol. Кодон- оптимизация полученной последовательности NanH проверена на сайте http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html. Соответствие транслируемой аминокислотной последовательности, заказанной подтверждено с помощью выравнивания в программе MEGA 6.0. Отсутствие нежелательных сайтов рестрикции подтверждено с помощью программного обеспечения CloneManager 9.0. Отсутствие нежелательных сайтов рестрикции подтверждено с помощью программного обеспечения CloneManager 9.0.
Для получения ГИК рМТ1617 (pETl5b-NANH_CLOPF) проведена наработка и рестрикционное картирование синтетического гена pAPGl lO-NANH_CLOPE. Согласно разработанной схеме проведено клонирование фрагмента, кодирующего клостридиальную нейраминидазу NanH (NANH_CLOPF) из плазмиды pAPGl lO- NANH_CLOPF, в векторную плазмиду рЕТ15Ь по сайтам рестрикции Ndel, BamHII. Полученные в ходе рестрикции фрагменты очищали и использовали для лигирования. Лигазной смесью трансформировали химически компетентные клетки E.coli XL10-GOLD. Клетки высевали для получения трансформированных клонов.
Затем выделяли плазмидную ДНК и проводили рестрикционное картирование с использованием эндонуклеазы рестрикции BsrFI. Образец плазмидной ДНК передавали на секвенирование в компанию "Евроген". Полученная последовательность была выравнена с «теоретической» последовательностью рМТ1617.
Для проведения аналитической экспрессии плазмидную ДНК ГИК рМТ1617 трансформировали в штаммы BL2l(DE3) pLysS. На основании аналитической экспрессии отбирали клоны-суперпродуценты NanH. Затем получали штамм- суперпродуцент NanH. Для получения целевого белка NanH проводили препаративную экспрессию путем культивирования продуцента в полноценной питательной среде с относительным содержанием растворенного кислорода не менее 10% при температуре 37оС, значении pH - 6, 5-7, 6. Длительность процесса культивирования составляет 6-8 часов. Индукцию экспрессии целевого продукта на этапе биосинтеза обеспечивали внесением раствора изопропил-Р-Э- 1 -тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ в питательной среде на 3-3,5 ч роста по достижении оптической плотности культуры 4, 0-5, 0 о.е.
С 3-3,5 часа культивирования плотности начинается этап биосинтеза гибридного белка. Экспрессия белка нейраминидазы находится под контролем промотора, который дерепрессируется внесением раствора ИПТГ до конечной концентрации 0,0238 мас.%. Культивирование проводили в течение 6-8 ч.
Уровень биосинтеза вариантов целевого белка нейраминидазы составляет не менее 0,65 г/л культуральной жидкости. Бактериальную биомассу собирали центрифугированием и хранили при минус 70°С. Клеточную биомассу лизировали, лизат осветляли центрифугированием и проводили выделение белка NanH из лизата путем связывания целевого белка металлохелатной хроматографией на колонке с Ni2+ IMAC Sepharose FF. Доочигцали фермент анионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. На каждом этапе контроль степени очистки проводили электрофорезом в ПААТ.
Выход белка составляет не менее 1,0 г на литр бактериальной культуры.
Конечный продукт, полученный по изобретению, имеет следующие параметры:
- содержание белка (УФ-спектрофотометрия) - не менее 1,0 мг/мл; - содержание бактериальных эндотоксинов (ГФ XIII, гель-тромб тест с ЛАЛ- реактивомОФС.1.2.4.0006.15) не более 5 ЭЕ/мг;
- Хроматографическая чистота (ГФ ВЭЖХ) не менее 90%;
- Ферментативная активность (Колориметрический метод,“Neuraminidase Assay Kit” (Sigma-Aldrich ) не менее 20 U/мг; - Остаточная ДНК штамма-продуцента (Количественный ПЦР в реальном времени) не более 5 пг/мг;
С использованием методов очистки настоящего изобретения удалось получить препарат NanH с хроматографической чистотой, определенной с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ, 90% гомогенности.
Удельная активность препаратов NanH по настоящему изобретению составляет от 20 единиц/мг белка и выше.
Содержание бактериальных эндотоксинов в препарате NanH по настоящему изобретению составляет не более 4.3 ЕЭ /мг белка.
Содержание остаточной ДНК штамма продуцента в препарате NanH настоящего изобретения составляет не более 4,47 пг/мг белка.
Получение NanH на основе оптимизированной синтетической последовательности ДНК с короткой последовательностью из шести гистидинов на N- конце рекомбинантного белка происходит без удаления гексагистидинового тэга, что позволяет упростить очистку и удалить из схемы очистки применение дорогостоящих препаратов для удаления тэга. Аминокислотная последовательность NanH представлена SEQ Ш NO 2.
В первой стадии авторы изобретения применяют в металлохелатной хроматографии коммерчески доступный сорбент IMAC Sepharose 6 FF. Применение на этой стадии промывок кислым буфером с высокой ионной силой позволяет в значительной степени удалить примеси клеточных белков из целевого продукта. Далее проводят анионообменную хроматографию, для которой может быть использован сорбент Q Sepharose FF. Применение данных сорбентов не ограничивает все варианты реализации изобретения, и специалист может применять в очистке белка любые известные сорбенты, пригодные для металлохелатной и анионообменной хроматографии белков с гексагистидиновым тагом. Существенным условием, необходимым для достижения технического результата, является в последовательность стадий металлохелатной и анионообменной хроматографии. Условия посадки и съема целевого белка подбираются для каждой стадии и каждого сорбента с помощью обычных технических приемов, известных квалифицированному специалисту, таким образом, чтобы максимально очистить целевой белок от контаминирующих примесей клеточных белков и бактериальных эндотоксинов. Таким образом был получен высокоочищенный активный препарат NanH, пригодный для использования на производстве ЛС и гликобиологических исследований, с выходом не менее 1 г с литра бактериальной культуры. Концентрирование очищенного препарата проводили с помощью концентрирующей анионообменной хроматографии, для которой также может быть использован сорбент Q Sepharose FF.
С использованием метода очистки, предложенного в заявленном изобретении, удалось получить препарат NanH с хроматографической чистотой, определенной с помощью ВЭЖХ, не менее чем 87%-ной гомогенности.
Удельная активность препаратов NanH, полученных раскрытым в изобретении способом, составляет 20 единиц/мг белка и выше; содержание бактериальных эндотоксинов составляет менее 4.3 ЕЭ /мг белка; содержание остаточной ДНК штамма продуцента составляет не более 4,47 пг/мг белка. Заявленный способ позволяет получить препарат рекомбинантной NanH, имеющий более высокую степень чистоты по сравнению с коммерческими аналогами, результаты сравнения представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Сравнение качества полученных промышленных серий препаратов рекомбинантной NanH и коммерческого препарата нейраминидазы.
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Пример 1. Микробиологический синтез белка NanH
Штамм-продуцент культивировали в ферментере (Biotron LiFlus SP/SL-20L, Юж. Корея) в объеме питательной среды 15 л. при поддержании pH на уровне 7,0- 7,1. Культивирование вели при температуре 37 °С. Относительное содержание растворенного кислорода поддерживали на уровне 25-100% путем перемешивания со скоростью 800 об/мин и подачи воздуха с объемным расходом 15 л/мин. Перед началом процесса в охлажденную питательную среду асептически вносят 50% раствор глюкозы - до конечной концентрации 0,5%. Инокулят в объеме 0,75 л, выращенный до оптической плотности, измеренной при длине волны 600 нм (ОД600), равной 1,3 о.е. (оптических единиц), вносят в ферментер со стерильной питательной средой, содержащей гидролизат казеина - 1,6%, дрожжевой экстракт - 1%, дигидрофосфат калия - 0,68%, сульфат аммония 0,33%, гидрофосфат натрия 0,71%. В ходе процесса культивирования производят мониторинг основных параметров роста культуры: ОД600, pH, морфология клеток, относительное содержание растворенного кислорода. На 3,0 час культивирования, когда оптическая плотность культуры достигает 4,4 о.е., вносят индуктор - стерильный раствор, содержащий 23,8% ИПТГ до конечной концентрации 0,0238% (1 мМ).
Культивирование проводят на протяжении 10 часов. Конечная оптическая плотность -27,2 о.е., выход биомассы - 100 г/л. Продуктивность по целевому продукту составляет 1 г/л культуральной жидкости.
На Фиг.З. представлена динамика накопления биомассы при культивировании штамма-продуцента, на Фиг.4. представлены параметры культивирования, на Фиг.5. представлен анализ накопления белка нейраминидазы при культивировании методом электрофореза.
Пример 2. Выделение и очистка белка NanH из бактериальной биомассы. Получение промышленной серии препарата NanH.
2.1 Дезинтеграция биомассы. Буфер A - 20 mM Tris HC1, 0.5 M NaCl, pH 7.8;
Замороженную биомассу клеток 128 г суспендируют в 160 мл буфера А с PMSF до 0,003% в течение 15 мин на льду и разрушают в проточном гомогенизаторе высокого давления Panda Plus 2000 (GEA Niro Soavi). Гомогенизатор промывают 250 мл охлажденной до 0 °С водой очищенной, настраивают по охлажденному до 0°С буферу А, настройка II ступени - 135 бар, настройка I ступени - 630-780 бар, затем лизируют суспензию клеток в этом режиме, собирая лизат в емкость, помещенную в ледяную баню, промывают гомогенизатор 30 мл буфера А. Лизис повторяют еще 2 раза в том же режиме. Лизат объемом 1400 мл осветляют центрифугированием 33250 х g (JLA-16.250) при 4°С в течение 120 мин.
2.2. Металлохелатная хроматография.
Супернатант 1300 мл, разбавляют буфером А до 1400мл, доводят pH до 7,8 2М NaOH, фильтруют через глубинный фильтр Sartopor 2 300, добавляют имидазол до концентрации 3 мМ и наносят на колонку с Ni2+ IMAC Sepharose, уравновешенную буфером А. После нанесения колонку промывают буфером А, натрий -ацетатным буфером с 1 М NaCl, pH 5.8, промывают буфером, содержащим 15 мМ имидазола. Целевой белок элюируют 300 мМ имидазола.
2.3. Разделяющая хроматография.
Элюат с М 2+ IMAC Sepharose разбавляют в 6 раз, доводят pH до 7,8 2М NaOH, осветляют центрифугированием 33250 х g ( JLA-16.250) при 4°С в течение 20 мин и наносят на колонку Q Sepharose FF, уравновешенную буфером 20 mM Tris НС1, pH 7.8. Отмывают тем же буфером до выхода элюата не сорбировавшихся компонентов а затем буфером 20 mM Tris НС1, 5тМ EDTA, pH 7.5 до оптической плотности 20 мАЕГ. Элюируют целевой белок этим же буфером.
2.4 Концентрирующая хроматография.
Элюат после хроматографии на Q Sepharose FF-1 разбавляют в 5 раз и вновь наносят на колонку Q Sepharose FF, уравновешенную буфером 20 mM Tris НС1, pH 7.8. Отмывают буфером для уравновешивания до выхода элюата не сорбировавшихся компонентов, затем буфером 20 mM Tris НС1, 5тМ EDTA, pH 7.5 до выхода проводимости 2.7 mSm/sm, элюируют этим же буфером, содержащим 70 мМ NaCl. 2.5 Разведение, стерилизующая фильтрация и фасовка.
Буфер F-20 mM Tris НС1, 5mM EDTA, 70 mM NaCl, pH 7.5;
Элюат с Q Sepharose FF -2 разбавляют буфером готовой формы : 20 mM Tris НС1, 5тМ EDTA, 70 mM NaCl, pH 7.5 до концентрации белка 1,0 -3,0 мг,мл, и стерильно фильтруют через FIFTER-MAX,“rapid” -150 ml, 0.22 pm, аликвотируют и хранят при минус 20° С.
Получено:
670,0 мл, e280 = 1,65, С= 2.2 мг/мл, 1474 мг Содержание бактериальных эндотоксинов: От 0,3 до 0,6 ЕЭ/мл.
Активность на синтетическом субстрате: 34.9 U/мг.
Чистота образца по ГФ ВЭЖХ составляет: 90,0%.
Остаточная ДНК штамма продуцента (E.colli): < 1,7 пг/мг.
Пример 3. Анализ активности рекомбинантной NanH.
Для определения активности NanH используют набор“Neuraminidase Assay Kit” (Sigma-Aldrich, cat# MAK121). Нейраминидазная активность в образце, определяемая при ферментном высвобождении сиаловой кислоты, прямо пропорциональна количеству продукта, содержание которого измеряется колориметрически при длине волны 570 нм.
В этом методе линейный диапазон измерения находится в пределах 0.1-10 units/F.
Для проведения анализа вносят 20 мкл ЮтМ стандарта (cat#MAKl2lF) в 480 мкл воды очищенной для получения 400 mM стандартного рабочего раствора. Затем в пробирки вносят 0, 15, 30, и 50 мкл стандартного рабочего раствора, добавляют воды очищенной до конечного объема 50 мкл. Концентрация полученных стандартных растворов - 0(вода), 120, 240 и 400 mM. Вносят по 20 мкл каждого стандартного образца в лунки 96-луночного планшета. Если активность образцов выше 10 units/L, разбавляют образцы в БГФ для нейраминидазы (20 mM Tris НС1, 5mM EDTA, 70 mM NaCl, pH 7.5), а затем в том же буфере, но содержащем БСА в концентрации 0,1 мг/мл (учитывая в дальнейшем коэффициент разбавления). Образец в объеме 20 мкл вносят в две лунки 96- луночного планшета. Одна лунка будет использоваться для определения активности образца, вторая в качестве бланка (Sample blank).
Готовят реакционную смесь для образцов и стандартов, а также для Sample blank (не содержит субстрат) согласно процедуре, указанной в инструкции к набору:
Добавляют 80 мкл реакционной смеси в каждую лунку планшета, перемешивают и инкубирую при температуре 37°С в защищенном от света месте.
Измеряют оптическую плотность образцов и стандартов через 20 минут при длине волны 570 нм.
Продолжают инкубацию планшета при температуре 37°С еще в течение 30 минут. Измеряют оптическую плотность образцов и стандартов при длине волны 570 нм.
Вычисление нейраминидазной активности препарата NanH производят по формуле: units/L=AMsample-AMblank-AMwatei7Slope*t где:
AMsample, AMblank, AMwater - разность оптических плотностей образца, Sample blank и water.
81оре-наклон калибровочной кривой. t- время между измерениями оптической плотности (30 мин).
Результаты тестирования образцов, полученных способом, описываемым в нашем изобретении и коммерческого образца, представлены в таблице 2. Таблица 2. Результаты тестирования ферментативной активности различных партий нейраминидазы NanH
Figure imgf000019_0001
Пример 4. Электрофоретическое разделение белков
Электрофорез проводят в 4 - 20% градиентном ПААГ в восстанавливающих условиях, окрашивают солями серебра (Thermo Scientific).
Пробоподготовку образцов проводят разведением образцов до концентрации ~50 мкг/мл добавлением буфера для нанесения проб (S.b.) с добавлением 2 М раствора дитиотреитола (ДТТ). Прогревают в течение 5 минут при (100 ± 2) ОС. Центрифугируют 1 мин., 13000 об/мин и наносят пробы (растворы, полученные при разведении образцов) по 10 мкл в лунку геля, маркеры молекулярной массы - 5 мкл в лунку геля.
Электрофорез проводят при напряжении 400 В, силе тока 30 мА, до выхода красителя. Затем окрашивают солями серебра по инструкции к набору Thermo Scientific. Результаты представлены на Фиг.6. Пример 5. Тестирование очищенных препаратов рекомбинантной NanH в сравнении с коммерческим препаратом нейраминидазы на содержание бактериальных эндотоксинов.
Анализ на содержание бактериальных эндотоксинов проводят методом гель- тромб теста в соответствии с ГФ XIII, гель-тромб тест с ЛАЛ-реактивом ОФС.1.2.4.0006.15. Образцы разводят водой для лал-теста («Пиротест», Россия). Используют для работы: LAL-реактив Endosafe (Charles River, USA) с чувствительностью 0,03 ЕЭ/мл; Контрольный стандартный образец эндотоксина (Charles River, USA) с содержанием 20 ЕЭ/мл. В пробирки для анализа помещают по 100 мкл образцов и по 100 мкл LAL-реактива и инкубируют в течение 60 мин при температуре 37 ОС. Положительный результат: образование плотного сгустка геля. При переворачивании пробирки на 180 градусов гель не разрушается. Отрицательный результат: гель не образуется или разрушается при переворачивании пробирки.
Содержание эндотоксинов в конечной точке выражается в ЕЭ/мл и рассчитывается по формуле: «С» = (разведение в конечной точке) c (чувствительность LAL-реактива). Полученные результаты представлены в Таблице
3. Таблица 3. Результат гель-тромб теста на содержание бактериальных эндотоксинов. Сравнение коммерческого препарата нейраминидазы и полученных препаратов рекомбинантной NanH.
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Примечания к таблице: «+» - положительный результат, эндотоксины присутствуют; «-» - отрицательный результат, эндотоксины не обнаруживаются.
Положительный результат: образование плотного сгустка геля. При переворачивании пробирки на 180 градусов гель не разрушается. Отрицательный результат: гель не образуется или разрушается при переворачивании пробирки.
Содержание эндотоксинов в конечной точке выражается в ЕЭ/мл и рассчитывается по формуле: «С» = (разведение в конечной точке) c (чувствительность ЕАГ-реактива).
Пример 6. Тестирование хроматографической чистоты очищенных препаратов рекомбинантной NanH в сравнении с коммерческим препаратом нейраминидазы
Тестирование производят методом ВЭЖХ гель- фильтрации на колонке с Superdex200 Increase 10/300 GL ( GE ) на хроматографической системе ВЭЖХ Alliance 2695, UV/Visible Detector 2487 (Waters). В качестве подвижной фазы используют буфер 0,02 М NaH2P04; 0,3 М NaCl; pH = 7.0. Анализ коммерческого препарата нейраминидазы был выполнен в одной повторности в связи с малым количеством образца и его высокой стоимостью. Анализ NanH от МБЦ «Генериум» был выполнен в трех повторностях. Сравнение хроматографических профилей испытуемых образцов показывает (Фиг.7.), что NanH МБЦ «Генериум» существенно более однородна по составу, тогда как коммерческая нейраминидаза более гетерогенна, что вызывает трудности в определении основного пика на хроматограмме коммерческого образца.
Хроматографическая чистота NanH МБЦ «Генериум», представлен на Фиг. 8, значительно выше, чем коммерческого препарата нейраминидазы, результаты представлены в Таблице 4. Таблица 4. Сравнение коммерческого препарата нейраминидазы и полученного препарата рекомбинантной NanH по хроматографической чистоте.
Figure imgf000023_0001
Пример 7. Тестирование очищенных препаратов рекомбинантной NanH на остаточную ДНК штамма продуцента.
Тестирование на остаточную ДНК штамма продуцента проводят методом количественного ПЦР в реальном времени, не более 20 пг/мг. Для дизайна количественной полимеразной цепной реакции (The quantitative polymerase chain reaction - QPCR) была выбрана система Taqman, в которой при размножении специфической последовательности ДНКа, зонд деградируется ДНКа-полимеразой. Перед проведением тестирования образцы были очищены с использованием набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Конечный объём при элюции составил 50 мкл. В реакцию qPCR (пробу) добавляли 10 мкл образца. Количество повторов для каждого образца - 3. Количество ДНК в пробе менее 0,5 пг ниже предела достоверного обнаружения. Результаты анализа представлены в Таблице 5.
Таблица 5. Результаты теста на остаточную ДНК штамма продуцента.
Figure imgf000023_0002
Пример 8. Изучение влияния снижения количества сиаловых кислот в препарате белка при обработке NanH на колонке на количество изоформ и pi.
Ремоделирование белка нейраминидазой NanH производства ОМВТ «Генериум» проводили на колонке с аффинным сорбентом. В полученном ремоделированном белке определяли количество изоформ pi методом изоэлектрического фокусирования в денатурирующих условиях в предзалитом полиакриламидном геле (ПААТ) с окрашиванием раствором кумасси Р 250, с использованием прибора для изофокусирования «Multiphor II», результаты представлены на Фиг. 9. Для ремоделированного бела характерно уменьшение числа изоформ и смещение их pi в более щелочную область по сравнению с образцом белка до ремоделирования и другими образцами белка, что говорит о значительном уменьшении сиаловых кислот в образце белка после обработки нейраминидазой
NanH.
Список последовательностей
SEQ Ш NO. 1
Первичная последовательность фрагмента ДНК вектора рМТ1617, заключающего ген белка NANH CLOPF.
ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT
ATG TGC AAC AAA AAC AAT ACC TTT GAA AAA AAC CTG GAT ATT AGC CAT AAA CCG GAA CCG CTG ATT CTG TTT AAC AAA GAT AAC AAC ATT TGG AAC AGC AAA TAT TTT CGC ATT CCG AAC
ATT CAG CTG CTG AAC GAT GGT ACC ATT CTG ACC TTT AGC GAT ATT CGC TAT AAT GGT CCG
GAT GAT CAT GCG TAT ATT GAT ATT GCG AGC GCA CGC AGC ACC GAT TTT GGC AAA ACC TGG
AGC TAT AAC ATT GCG ATG AAA AAC AAT CGC ATT GAT AGC ACC TAT AGC CGC GTG ATG GAT
AGC ACC ACC GTG ATT ACC AAC ACC GGT CGC ATT ATT CTG ATT GCA GGC AGC TGG AAC ACC AAT GGC AAC TGG GCG ATG ACC ACC AGC ACC CGT CGC AGC GAT TGG AGC GTG CAG ATG ATT
TAT AGC GAT GAT AAT GGC CTG ACC TGG AGC AAC AAA ATT GAT CTG ACC AAA GAT AGC AGC
AAA GTG AAA AAC CAG CCG AGC AAC ACC ATT GGT TGG CTG GGT GGC GTG GGC AGC GGC ATT
GTG ATG GAT GAT GGC ACC ATT GTG ATG CCG GCG CAG ATT AGC CTG CGC GAA AAC AAC GAA
AAC AAT TAC TAT AGT CTG ATT ATT TAT AGC AAA GAT AAT GGC GAA ACC TGG ACC ATG GGC
AAC AAA GTG CCG AAC AGC AAC ACC AGC GAA AAC ATG GTG ATT GAA CTG GAT GGT GCG CTG ATT ATG AGC ACC CGC TAT GAT TAT AGC GGC TAT CGT GCA GCG TAT ATT AGC CAT GAT CTG
GGC ACC ACC TGG GAA ATT TAT GAA CCG CTG AAT GGC AAA ATT CTG ACC GGC AAA GGC AGC
GGC TGC CAG GGC AGC TTT ATT AAA GCG ACC ACC AGC AAT GGC CAT CGC ATT GGC CTG ATT
AGC GCA CCG AAA AAC ACC AAA GGC GAA TAT ATT CGC GAT AAC ATT GCG GTG TAT ATG ATT
GAT TTT GAT GAT CTG AGC AAA GGC GTG CAG GAA ATT TGC ATT CCG TAT CCG GAA GAT GGC
AAC AAA CTG GGT GGT GGC TAT AGC TGC CTG AGC TTT AAA AAC AAC CAT CTG GGC ATT GTG
TAT GAA GCG AAT GGC AAC ATT GAA TAT CAG GAT CTG ACC CCG TAT TAT AGC CTG ATT AAC
AAA CAG TGA TAA GGA TCC
SEQ ID NO 2
Аминокислотная последовательность NANH с гексагистидиновым тагом
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMCNKNNTFEKNLDISHKPEPLILFNKDNNIWNSKYFRIPNIQ
LLNDGTILTFSDIRYNGPDDHAYIDIASARSTDFGKTWSYNIAMKNNRIDSTYSRVMDSTTVITN
TGRIILIAGSWNTNGNWAMTTSTRRSDWSVQMIYSDDNGLTWSNKIDLTKDSSKVKNQPSNTI
GWLGGVGSGIVMDDGTIVMPAQISLRENNENNYYSLIIYSKDNGETWTMGNKVPNSNTSENM
VIELDGALIMSTR YDYSGYRAA YISHDLGTTWEIYEPLNGKILTGKGSGCQGSFIKA TTSNGHRI
GLISAPKNTKGEYIRDNIAVYMIDFDDLSKGVQEICIPYPEDGNKLGGGYSCLSFKNNHLGIVY
EANGNIEYQDLTPYYSLINKQ

Claims

Формула изобретения
1. Способ получения рекомбинантной нейраминидазы NanH, включающий экспрессию в E.coli плазмиды, содержащей ген белка NanH, слитого с последовательностью из шести гистидинов, металлохелатную хроматографию и концентрирование, отличающийся тем, что в процессе очистки белка гидролиз гистидинового тага не производится, и после металлохелатной хроматографии проводят разделяющую хроматографию.
2. Способ по п.1, где для экспрессии белка применяют плазмиду рЕТ15Ь.
3. Способ по любому из пп. 1-2, где для экспрессии белка применяют штамм
4. Способ по п. 1, где для металлохелатной хроматографии применяют IMAC
5. Способ по п. 1, где в качестве разделяющей хроматографии применяют анионообменную хроматографию.
6. Способ по п. 5, где концентрирование проводят путем хроматографии.
7. Способ по п. 6, где для концентрирования применяют анионообменную хроматографию .
8. Способ по любому из пп. 5-7, где при концентрировании применяют Q
9. Способ по п. 8, где при элюции белка в концентрирующей хроматографии применяют ЭДТА в концентрации не более 5 мМ.
PCT/RU2019/050186 2018-10-22 2019-10-16 Способ получения рекомбинантной нейраминидазы из clostridium perfringens WO2020085951A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018137064 2018-10-22
RU2018137064A RU2698774C1 (ru) 2018-10-22 2018-10-22 Способ получения рекомбинантной нейраминидазы nanh из clostridium pereringens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020085951A1 true WO2020085951A1 (ru) 2020-04-30

Family

ID=67851791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050186 WO2020085951A1 (ru) 2018-10-22 2019-10-16 Способ получения рекомбинантной нейраминидазы из clostridium perfringens

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2698774C1 (ru)
WO (1) WO2020085951A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071408A (en) * 1976-11-01 1978-01-31 Research Corporation Neuraminidase
SU1655987A1 (ru) * 1989-03-27 1991-06-15 Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт Способ получени очищенной нейраминидазы холерного вибриона

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071408A (en) * 1976-11-01 1978-01-31 Research Corporation Neuraminidase
SU1655987A1 (ru) * 1989-03-27 1991-06-15 Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт Способ получени очищенной нейраминидазы холерного вибриона

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRUSE SUSSANE ET AL.: "Expression and Purification of a Recombinant ''Small'' Sialidase from Clostridium perfringens A99", PROTEIN EXPR PURIF., vol. 7, no. 4, June 1996 (1996-06-01), pages 415 - 22, XP027390281 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2698774C1 (ru) 2019-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016294206B9 (en) Novel endos mutant enzyme
Li et al. Site-specific immobilization of endoglycosidases for streamlined chemoenzymatic glycan remodeling of antibodies
CN108588061B (zh) 一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体
US11142752B2 (en) Pullulanase mutant
Stojković et al. Coliphage N4 N-acetylmuramidase defines a new family of murein hydrolases
KR20220128581A (ko) 락토오스의 효소적 헥소사미니드화
CN111088183B (zh) 一种海洋弧菌及其在制备热稳定特性的ι-卡拉胶酶中的应用
CN116949004B (zh) 一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用
RU2698774C1 (ru) Способ получения рекомбинантной нейраминидазы nanh из clostridium pereringens
CN105647888B (zh) 内切几丁质酶及其编码基因和在生产几丁二糖中的应用
KR20120028304A (ko) 신규 단백질 및 그것을 코드하는 유전자
CN113151327B (zh) 一种蜡样芽胞杆菌高产麦芽五糖α-淀粉酶的突变体及其应用
RU2698460C1 (ru) Способ получения рекомбинантной в-1,4-галактозидазы bgaa из streptococcus pneumoniae
CN109022397A (zh) 一种降解主产物为新琼二糖的内切型β-琼胶酶及其应用
JP6993637B2 (ja) フコース含有糖鎖を特異的に切断するエンドグリコシダーゼ
Seydametova et al. Development of a quantitative assay for 2´-fucosyllactose via one-pot reaction with α1, 2-fucosidase and l-fucose dehydrogenase
RU2693660C1 (ru) Способ получения рекомбинантной бета-n-ацетилглюкозаминидазы strh из streptococcus pneumoniae
CN113564146A (zh) 一种耐热β-半乳糖苷酶及其在乳糖降解的应用
Roy et al. Cloning, sequence analysis, and characterization of a novel β-glucosidase-like activity from Pichia etchellsii
CN106119233B (zh) 头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用
CN116121225B (zh) 一种低温海藻糖酶、其编码序列、重组菌株及应用
RU2787186C1 (ru) Рекомбинантный белок нуклеазы бактерий Serratia marcescens для гидролиза нуклеиновых кислот
EP2599867A1 (en) Novel enzyme protein, process for production of the enzyme protein, and gene encoding the enzyme protein
CN109182306A (zh) 一种降解产物均一的β-琼胶酶及其应用
EP4151742B1 (en) Transgenic cell line and genetically engineered bacterium expressing fructosamine deglycase, and use of fructosamine deglycase

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19874906

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205 DATED 07/09/2021)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19874906

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1