KR20220128581A - 락토오스의 효소적 헥소사미니드화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 패밀리 GH20 헥소사미니다아제로부터의 글리코시다아제를 사용하여 모유 올리고당 (HMO) 코어 구조를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린을 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 의해 촉매작용되는 락토오스와 반응시켜 락토-N-트리오스 II (LNT II) 및/또는 락토-N-테트라오스 (LNT) 를 생산하는 방법을 제공한다. 특정한 최적화된 효소가 반응을 촉매작용하기 위해서 식별된다.

Description

락토오스의 효소적 헥소사미니드화
본 발명은 패밀리 GH20 헥소사미니다아제로부터의 글리코시다아제를 사용하여 모유 올리고당 (HMO) 코어 구조를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린을 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 의해 촉매작용되는 락토오스와 반응시켜 락토-N-트리오스 II (LNT II) 및/또는 락토-N-테트라오스 (LNT) 를 생산하는 방법을 제공한다. 특정한 최적화된 효소가 반응을 촉매작용하기 위해서 식별된다. 추가로, 본 발명은 또한 락토-N-트리오스 II 또는 락토-N-테트라오스를 생산하기 위한, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도에 관한 것이다.
상이한 엔도-유형 글리코시다아제 (예를 들어, Endo M, Endo A, Chitinases) 가 상응하는 이당류 옥사졸린을 공여체 기질로서 사용하여, N-연결된 올리고당 코어 삼당류 Man(β1-4)-GlcNAc(β1-4)-GlcNAc 및 이의 유도체의 합성에 적용되었다.1, 2 매우 과량의 수용체 기질 (32 배) 및 20 % 의 아세톤 (v/v) 을 사용하였음에도 불구하고, N-연결된 올리고당 코어 삼당류 Man(β1-4)-GlcNAc(β1-4)-GlcNAc 는 키티나아제-촉매작용된 반응에서 이당류-옥사졸린으로부터 32 % 수율 (6.4 mM) 로만 수득되었다.2 인공적인 키틴 및 다른 글리코사미노글리칸 유도체는 패밀리 GH18 키티나아제 및 GH56 히알루로니다아제를 촉매로서 사용하여, 개질된 이당류 옥사졸린의 중합에 의해 합성되었다.3 또한, Endo A 에 의한 이당류 옥사졸린의 중합도 설명되었다.4
헥소사미니다아제는 종종 매우 낮은 트랜스-글리코실화 활성을 갖는 히드롤라아제이다. 가수분해 문제를 해결하고 매력적인 수율을 제공하기 위해서, 상이한 글리코시드 히드롤라아제 패밀리로부터의 효소는 돌연 변이되어 트랜스-글리코실화 활성을 향상시키고, 가수분해를 감소시키거나 또는 억제한다. 그러나, 글리코시드 히드롤라아제의 비활성을 최적화시키는 경우, 높은 수율을 달성하기 위해서는, 트랜스-글리코실화에 적합한 공여체-기질 및 반응 조건을 확인하는 것이 또한 필요하다.
비. 비피둠 (B. bifidum) JCM1254 로부터의 헥소사미니다아제 BbhI (β-N-아세틸헥소사미니다아제) 및 LnbB (락토-N-비오시다아제) 는 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 구성원이다. 탄수화물-활성-효소 데이터 베이스는 2018 년 11 월 20 일자 업데이트된 버전의 http://www.cazy.org 에서 입수 가능하다 (Lombard, V.; Golaconda Ramulu, H.; Drula, E.; Coutinho, P. M.; Henrissat, B., The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013, Nucleic Acids Res., 2014, 42 (D1), D490-D495.). 자동화된 탄수화물-활성 효소 주석 (dbCAN) 에 대한 데이터 베이스는 CAZy 데이터 베이스로부터의 패밀리 분류를 기반으로 생성된 주석 데이터를 제공한다 (http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/index.php, Yin Y, Mao X, Yang JC, Chen X, Mao F and Xu Y, dbCAN: a web resource for automated carbohydrate-active enzyme annotation, Nucleic Acids Res. 2012 Jul; 40(Web Server issue):W445-51). LNT II 및 LNT 를 생산하기 위한 글리코실화는 반응식 1 에 나타나 있다. 최근에, Xiao 와 동료들은 야생형 BbhI 을 사용하여, 트랜스-글리코실화에 의해 적당한 수율 (37 %) 로 LNT II 의 생체 촉매적 합성을 입증하였다.5 그러나, 집중적인 반응 최적화 (기질 농도, 유기 용매 농도, pH, 온도) 에도 불구하고, 최대 수율은 낮은 공여체 대 수용체 비율로 인해, 및 LNT II 의 2 차 가수분해로 인해 크게 손상되었다. 또한, LnbB 는 트랜스-글리코실화 활성을 나타냈지만, LNT 는 매우 낮은 수율 (< 4 %) 로만 수득되었다.6 다른 연구자들은 특정한 돌연변이를 GH20 헥소사미니다아제에 도입함으로써, N,N-디아세틸키토비오스로부터의 N-Ac-글루코사민에 의해 락토오스의 트랜스글리코실화를 개선하려고 시도하였지만, LNT II 수율은 0.5 % 에서 5 % 로 증가하는데 그쳤으며, LNT II 는 2 개 이상의 이성질체성 삼당류로 오염된 상태를 유지하였다.7
Figure pct00001
반응식 1: 락토-N-트리오스 II (LNT II) 및 락토-N-테트라오스 (LNT) 를 생성하기 위한 트랜스글리코실화 반응. 공여체로서 당 옥사졸린 및 수용체로서 락토오스로부터의 트랜스-글리코실화 반응이 나타나 있다. 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 로부터의 패밀리 GH20 헥소사미니다아제의 야생형 및 돌연변이 효소를 사용하였다. LNT II 는 β-N-아세틸헥소사민다아제 BbhI 에 의해 GlcNAc-옥사졸린으로부터 합성하였으며, LNT 는 락토-N-비오시다아제 LnbB 에 의해 락토-N-비오스-옥사졸린 (LNB-옥사졸린) 으로부터 합성하였다.
본 발명의 목적은 효소의 비활성을 최적화할 뿐만 아니라, 적합한 공여체-기질 및 반응 조건을 식별함으로써, BbhI 및 LnbB 에 의한 LNT II 및 LNT 로의 락토오스의 트랜스-글리코실화의 상업적 사용성을 개선하는 기술을 제공하는 것이었다. 특히, 본 발명의 목적은 종래 기술에 기재된 방법과 비교하여, 트랜스글리코실화의 수율, 최종 생성물 농도 및 공간-시간-수율을 증가시키는 것이었다.
상기 목적은 하기의 단계를 포함하는, 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스의 제조 방법에 의해 충족된다:
(i) 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린을 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 의해 촉매작용되는 락토오스와 반응시켜 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스를 수득하는 단계.
바람직하게는, 단계 (i) 은 락토-N-트리오스 II 또는 락토-N-테트라오스, 또는 둘 모두의 제조에 적합한 조건하에서 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린은 락토-N-트리오스 II 또는 락토-N-테트라오스, 또는 둘 모두의 형성에 적합한 조건하에서, 락토오스 및 하나 이상의 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소와 접촉시킨다.
본 발명의 문맥에서, 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소와 락토오스 및 옥사졸린 공여체-기질의 반응은 HMO 코어 구조를 적합한 수율로 수득하는 유망한 방법을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 효소는 효소의 EC 분류에 따른 EC 3.2.1.- 클래스의 효소이다 (www.brenda-enyzmes.org, Schomburg et al., The BRENDA enzyme information system - From a database to an expert system, J Biotechnol, 2017, 261, 194-206; www.expasy.org, Artimo et al., ExPASy: SIB bioinformatics resource portal, Nucleic Acids Res. 40(W1): W597-W603, 2012). 본 발명의 문맥에서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 트랜스-글리코실화 반응을 수행할 수 있는 효소이다. 바람직하게는 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 EC 클래스 3.2.1.52 또는 EC 클래스 3.2.1.140 의 효소, 및 보다 바람직하게는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 또는 락토-N-비오시다아제, 더욱 바람직하게는 β-N-아세틸헥소사미니다아제이다.
이러한 패밀리의 효소에서의 촉매적 활성은 전형적으로 (β/α)8-배럴 토폴로지로 접히는 GH20 도메인 (PFAM 코드 PF00728) 에 할당된다. 단일 GH20 도메인 만을 제시하는 에이. 악티노마이세템코미탄스 (A. actinomycetemcomitans) 로부터의 디스퍼신 B 를 제외하고는, 구조의 나머지는 매우 다양한 기능을 갖는 하기의 여러 도메인을 수반하는 촉매적 도메인을 보여준다: 미지의 기능을 갖지만, 대부분의 GH20 효소에서 보존되는, 통상적으로 GH20b 로서 명명되는 비-촉매적 도메인, 여러 렉틴 도메인, 탄수화물 결합 도메인, 및 미지의 기능의 다른 도메인.34
본 발명의 다양한 양태의 바람직한 구현예에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 Pfam 데이터 베이스 (https://pfam.xfam.org, Pfam 32.0, September 2018) 에 따른 PFAM 코드 PF00728 을 갖는 도메인을 포함하는 효소이다.
당 옥사졸린은 기질-보조된 반응 메커니즘을 따르는 글리코시다아제를 보유함으로써 트랜스-글리코실화를 위한 매력적인 공여체 기질이다. 이들은 이들의 전이 상태를 모방하는 고도의 활성 기질 종을 나타낸다. Shoda 와 동료들은 탈수제로서 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-윰 클로라이드 (CDMBI) 및 염기로서 Na3PO4 를 사용함으로써, 수 중에서 비보호된 N-아세틸-2-아미노 당으로부터 양호한 수율 (>80 %) 로 이들의 실용적인 1-단계 합성을 입증하였다.8 핵심 효소로서 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) 으로부터의 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (LNBP) 와의 1-포트 4-효소 반응을 사용하는, 수크로오스 및 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 으로부터 대량의 락토-N-비오스 (LNB) 의 실용적인 제조는 Kitaoka 와 동료들에 의해 보고되었다.9, 10 그러나, 지금까지, 옥사졸린 공여체 기질은 GH20 효소에 의한 트랜스글리코실화에 성공적으로 사용되지 않았다. Slamova et al. 은 옥사졸린 고리가 pH 에 따라 매우 불안정하다고 설명하고 있으며, 옥사졸린 공여체 기질에 의한 β-N-아세틸헥소사미니다아제의 반응에서 트랜스글리코실화 생성물이 관찰되지 않았다고 기술하고 있다.11
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기에서 기술한 방법에서, 단계 (i) 은 50 g/L 이상의 락토오스, 바람직하게는 100 g/L 이상의 락토오스, 특히 바람직하게는 150 g/L 이상의 락토오스, 가장 바람직하게는 190 g/L 이상의 락토오스를 함유하는 수용액 중에서 수행된다.
놀랍게도, 본 발명의 문맥에서, 증가하는 점도에도 불구하고, 높은 락토오스 농도는 생성물 수율에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 동시에, 높은 농도는 처리해야 하는 부피가 작기 때문에, 더 용이하게 확장할 수 있다.
유기 용매를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는 조건하에서 수행되는, 상기에서 기술한 바와 같은 방법이 특히 바람직하다.
상기 문맥에서의 "본질적으로 함유하지 않는" 은, 바람직하게는 임의의 주어진 시점에서, 단계 (i) 의 반응 혼합물 및, 특히 상기에서 기술한 방법에 의해 수득된 정제된 및 정제되지 않은 생성물에, 10 g/L 이하, 보다 바람직하게는 1 g/L 이하의 유기 용매가 존재한다는 것을 의미한다. DMSO 또는 에탄올과 같은 유기 용매의 사용은, 본 발명에 대한 주요 적용을 나타내는 인간 소비를 위한 임의의 제품, 특히 유아 식품에서는 바람직하지 않다. 유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 유기 용매를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는 반응 조건하에서 HMO 코어 구조를 생성할 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기에서 기술한 방법에서, 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린은 각각 20 분 이상, 바람직하게는 60 분 이상의 기간에 걸쳐 락토오스 및 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 첨가된다.
글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린은 각각의 기간에 걸쳐 배치식으로 첨가될 수 있거나, 또는 바람직하게는 각각의 기간에 걸쳐 연속식으로 첨가된다.
본 발명에 따른 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법의 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 1 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 β-N-아세틸헥소사미니다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 와 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소이다.
본 발명에 따른 락토-N-테트라오스의 제조 방법의 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 락토-N-비오시다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 3 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 락토-N-비오시다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 와 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소이다.
본원에서 2 개의 아미노산 서열의 비교와 관련한 "상동성" 은, 동일한 잔기의 수를 이의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 서열을 나타내는 정렬 영역의 길이로 나눔으로써 계산된다. 이 값에 100 을 곱하면 "%-상동성" 이 된다. 2 개의 아미노산 서열 사이의 %-상동성 (즉, 쌍별 서열 정렬) 을 결정하기 위해서, 제 1 단계에서, 2 개의 서열은 이들의 전체 길이에 걸쳐 정렬되어야 한다 (즉, 전역 정렬). 2 개의 서열의 전역 정렬을 생성하기 위해, 프로그램 "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)), 프로그램 "MATGAT" (Campanella, J.J, Bitincka, L. and Smalley, J. (2003), BMC Bioinformatics, 4:29), 프로그램 "CLUSTAL" (Higgins, D:G: and Sharp, P.M. (1988), Gene, 73, 237-244), 프로그램 "MegAlign Pro" (DNASTAR) 또는 유사한 프로그램과 같은 임의의 적합한 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 임의의 프로그램이 없는 경우, 서열은 또한 수동으로 정렬할 수 있다. 2 개의 서열을 정렬한 후, 제 2 단계에서, 정렬로부터 상동성 값을 결정해야 한다. %-상동성 계산을 위한 적용된 방법에 따라, 주어진 정렬로부터 상이한 %-상동성 값을 계산할 수 있다. 결과적으로, 서열 정렬을 생성하고, 또한 정렬로부터 %-상동성 값을 계산하는 컴퓨터 프로그램은 또한 프로그램에서 사용되는 계산 방법에 따라, 주어진 정렬로부터 상이한 %-상동성 값을 보고할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 %-상동성의 하기의 계산이 적용된다: %-상동성 = (동일한 잔기 / 이의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 서열을 나타내는 정렬 영역의 길이) x 100. 본 발명에 따른 %-상동성의 계산은 다음과 같이 예시된다 (SEQ ID NO: 26 및 SEQ ID NO: 27 의 유일한 목적은 본 발명에 따른 계산을 입증하는 것이며; 이러한 목적 이외에, 상기 서열은 독창적이거나 기능적으로 의미가 없다):
Figure pct00002
그러므로, 더 짧은 서열은 서열 2 이다.
두 서열을 이들의 전체 길이에 걸쳐 모두 나타내는 쌍별 전역 정렬의 생성은 다음과 같은 결과를 유도한다:
Figure pct00003
따라서, 본 발명에 따른 이의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 서열을 나타내는 쌍별 정렬의 생성은 다음과 같은 결과를 유도한다:
Figure pct00004
동일한 잔기의 수는 32 이며, 이의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 서열을 나타내는 정렬 길이는 37 이다 (더 짧은 서열의 정렬 길이를 고려한 하나의 갭이 존재함). 그러므로, 본 발명에 따른 %-상동성은 다음과 같다: (32 / 37) x 100 = 86 %.
본 발명의 문맥에서 사용되는 효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 보존적인 아미노산 치환을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 문맥에서 사용되는 효소는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이들의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이들은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이들의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 서열, 특히 DNA 서열, 및 이러한 뉴클레오티드 서열을 사용하는 상기에서 기술한 바와 같은 방법을 제공하고, 여기에서 뉴클레오티드 서열은 상기에서 기술한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 GH20 의 효소, 특히 SEQ ID NO: 1 또는 3 에 따른 β-N-아세틸헥소사미니다아제 또는 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 2 또는 4 에 따른 각각의 효소의 단축형 기능적 버전을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화된다.
본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "혼성화" 는, 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링되는 과정이다. 혼성화 과정은 용액 중에서 완전히 발생할 수 있으며, 즉, 두 상보적인 핵산이 모두 용액 중에 있다. 혼성화 과정은 또한 자기 비이드, 세파로오스 비이드 또는 임의의 다른 수지와 같은 매트릭스에 고정된 상보적인 핵산 중 하나를 사용하여 발생할 수 있다. 혼성화 과정은 또한 니트로-셀룰로오스 또는 나일론 막과 같은 고체 지지체에 고정된, 또는 예를 들어 포토리소그래피에 의해, 예를 들어 규산질 유리 지지체에 고정된 (후자는 핵산 어레이 또는 마이크로어레이로서, 또는 핵산 칩으로서 알려짐) 상보적인 핵산 중 하나를 사용하여 발생할 수 있다. 혼성화를 발생시키기 위해서, 핵산 분자는 일반적으로 이중 가닥을 2 개의 단일 가닥으로 용융시키고, 및/또는 단일 가닥의 핵산으로부터 헤어핀 또는 다른 2차 구조물을 제거하도록 열적으로 또는 화학적으로 변성된다.
이러한 혼성의 형성 또는 용융은 다양한 매개변수, 예를 들어 온도에 따라 달라진다. 온도의 증가는 용융을 선호하는 반면, 온도의 감소는 혼성화를 선호한다. 그러나, 이러한 혼성 형성 과정은 선형 방식으로 적용된 온도 변화를 따르지 않는다: 혼성화 과정은 동적이며, 이미 형성된 뉴클레오티드 쌍은 또한 인접한 뉴클레오티드의 짝짓기를 지원한다. 따라서, 양호한 근사를 통해, 혼성화는 예-또는-아니오 과정이며, 기본적으로 혼성화와 혼성화 없음 사이의 경계를 정의하는 온도가 있다. 이러한 온도는 용융 온도 (Tm) 이다. Tm 은, 주어진 뉴클레오티드 서열의 모든 분자의 50 % 가 이중 가닥으로 혼성화되고 50 % 가 단일 가닥으로 존재하는 섭씨 온도이다.
용융 온도 (Tm) 은 분석된 핵산 서열의 물리적 특성에 따라 달라지며, 따라서 2 개의 별개의 서열 사이의 관계를 나타낼 수 있다. 그러나, 용융 온도 (Tm) 은 또한 서열과 직접적으로 관련이 없는 다양한 다른 매개변수에 의해 영향을 받으며, 혼성화 실험의 적용된 조건을 고려해야 한다. 예를 들어, 염 (예를 들어, 1가 양이온) 의 증가는 더 높은 Tm 을 유도한다.
주어진 혼성화 조건에 대한 Tm 은 물리적 혼성화 실험을 수행함으로써 결정될 수 있지만, Tm 은 또한 주어진 DNA 서열의 쌍에 대해 인 실리코 추정될 수 있다. 이러한 구현예에 있어서, Meinkoth 와 Wahl 의 방정식 (Anal. Biochem., 138:267-284, 1984) 은 50 개 이상의 염기 길이를 갖는 스트레치에 사용된다:
Tm = 81.5 ℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% 형태) - 500/L
M 은 1가 양이온의 몰 농도이고, % GC 는 DNA 스트레치에서의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이며, % 형태는 혼성화 용액에서의 포름아미드의 백분율이고, L 은 염기 쌍에서의 혼성의 길이이다. 상기 방정식은 0.01 내지 0.4 M 의 범위의 염 및 30 % 내지 75 % 의 범위의 % GC 에 대한 것이다.
상기 Tm 은 완벽하게 일치하는 프로브에 대한 온도이지만, Tm 은 1 % 의 불일치 마다 약 1 ℃ 씩 감소한다 (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81: 123-135, 1973):
Tm = [ 81.5 ℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% 포름아미드) - 500/L ] - %비-상동성
이 방정식은 35 개, 바람직하게는 50 개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 프로브에 유용하며, 과학적 방법 문헌 (예를 들어, "Recombinant DNA Principles and Methodologies", James Greene, Chapter "Biochemistry of Nucleic acids", Paul S. Miller, page 55; 1998, CRC Press), 많은 특허 출원 (예를 들어, US 7026149), 및 또한 상업 회사의 데이터 시트 (예를 들어, www.genomics.agilent.com 으로부터의 "Equations for Calculating Tm") 에서 널리 언급되고 있다.
이러한 구현예에 따른 Tm 의 인 실리코 추정을 위해, 먼저 2 개의 서열 사이의 생물정보학 서열 정렬 세트가 생성된다. 이러한 정렬은 당업자에게 공지된 다양한 도구, 예컨대 국소 정렬을 생산하는 프로그램 "Blast" (NCBI), "Water" (EMBOSS) 또는 "Matcher" (EMBOSS), 또는 전역 정렬을 생산하는 프로그램 "Needle" (EMBOSS) 에 의해 생성될 수 있다. 이들 도구는 기본 매개변수 설정과 함께 적용해야 하지만, 일부 매개변수 변형도 적용해야 한다. 예를 들어, 프로그램 "MATCHER" 는 가포펜/가펙스텐드에 대한 다양한 매개변수 (예컨대, 14/4; 14/2; 14/5; 14/8; 14/10; 20/2; 20/5; 20/8; 20/10; 30/2; 30/5; 30/8; 30/10; 40/2; 40/5; 40/8; 40/10; 10/2; 10/5; 10/8; 10/10; 8/2; 8/5; 8/8; 8/10; 6/2; 6/5; 6/8; 6/10) 와 함께 적용될 수 있고, 프로그램 "WATER" 는 가포펜/가펙스텐드에 대한 다양한 매개변수 (예컨대, 10/0,5; 10/1; 10/2; 10/3; 10/4; 10/6; 15/1; 15/2; 15/3; 15/4; 15/6; 20/1; 20/2; 20/3; 20/4; 20/6; 30/1; 30/2; 30/3; 30/4; 30/6; 45/1; 45/2; 45/3; 45/4; 45/6; 60/1; 60/2; 60/3; 60/4; 60/6) 와 함께 적용될 수 있으며, 또한 이들 프로그램은 주어진 바와 같은 두 뉴클레오티드 서열을 사용함으로써, 뿐만 아니라, 이의 역 상보 형태의 서열 중 하나에 의해 적용될 수 있다. 예를 들어, BlastN (NCBI) 은 또한 특히 작은 크기의 데이터 베이스에서 매우 짧은 정렬을 식별하기 위해서 증가된 e-값 컷-오프 (예를 들어, e+1 또는 심지어 e+10) 로 적용될 수 있다.
혼성화는 반드시 2 개의 서열의 전체 길이에 걸쳐 발생하는 것은 아니지만, 실제 용융 온도를 결정하는 별도의 영역에서 최상일 수 있기 때문에, 국소적인 정렬을 고려하는 것이 중요하다. 그러므로, 모든 생성된 정렬로부터, 정렬 길이, 정렬 %GC 함량 (보다 정확한 방식으로, 정렬 내에서 일치하는 염기의 %GC 함량), 및 정렬 상동성을 결정해야 한다. 이어서, 각각의 정렬에 대한 예측된 용융 온도 (Tm) 을 계산해야 한다. 가장 높은 계산된 Tm 은 실제 용융 온도를 예측하는데 사용된다.
본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "본 발명의 전체 서열에 걸친 혼성화" 는, 본 발명의 서열이 약 300 내지 500 개 염기 길이의 조각으로 단편화될 때, 모든 단편이 혼성화되어야 한다는 것을 의미한다. 예를 들어, DNA 는 제한 효소 중 하나 또는 이의 조합을 사용함으로써 조각으로 단편화될 수 있다. 이어서, Tm 의 생물정보학 인 실리코 계산은 모든 단편에 대해 실행된, 상기에서 기술한 것과 동일한 절차에 의해 수행된다. 개별 단편의 물리적 혼성화는 표준 서던 분석, 또는 당업자에게 공지된 유사한 방법에 의해 분석될 수 있다.
본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "엄격성" 은 2 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성 형성이 일어날 수 있는 용이성을 설명하는 것이다. "높은 엄격성" 의 조건은 하나의 서열의 더 많은 염기가 다른 서열과 쌍을 이루는데 필요하며 (용융 온도 Tm 은 "높은 엄격성" 의 조건에서 더 낮다), "낮은 엄격성" 의 조건은 일부 더 많은 염기가 쌍을 이루지 못하게 한다. 그러므로, 2 개의 서열 사이의 상동성의 정도는 이들이 여전히 혼성을 형성할 수 있는 실제 엄격성 조건에 의해 추정될 수 있다. 엄격성의 증가는 실험적 혼성화 온도를 일정하게 유지시키고 염 농도를 낮춤으로써, 또는 염을 일정하게 유지시키고 실험적 혼성화 온도를 증가시킴으로써, 또는 이들 매개변수의 조합에 의해 달성될 수 있다. 또한, 포름아미드의 증가는 엄격성을 증가시킬 것이다. 당업자는 혼성화 동안에 변경될 수 있으며, 엄격성 조건을 유지하거나 또는 변경할 추가의 매개변수를 알고 있다 (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 및 연간 업데이트)).
전형적인 혼성화 실험은 초기 혼성화 단계에 의해 수행되며, 하나 내지 여러 개의 세정 단계가 후속된다. 이들 단계에 사용되는 용액은, 분석된 서열의 분해를 방지하고 및/또는 프로브의 비특이적인 백그라운드 결합을 방지하는 추가의 성분, 예컨대 EDTA, SDS, 단편화된 정자 DNA 또는 유사한 시약을 함유할 수 있으며, 이들은 당업자에게 공지되어 있다 (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 및 연간 업데이트)).
혼성화 실험을 위한 전형적인 프로브는, 예를 들어 랜덤-프라임 라벨링 방법에 의해 생성되며, 이는 Feinberg and Vogelstein (Anal. Biochem., 132 (1), 6-13 (1983); Anal. Biochem., 137 (1), 266-7 (1984)) 에 의해 처음 개발되었고, 표지될 DNA 에 대한 모든 가능한 헥사뉴클레오티드의 혼합물의 혼성화를 기반으로 한다. 표지된 프로브 제품은 실제로 전형적으로 길이가 100-1000 뉴클레오티드의 크기 범위인 다양한 길이의 단편의 모음일 것이며, 가장 높은 단편 농도는 전형적으로 약 200 내지 400 bp 이다. 혼성화 실험을 위한 프로브로서 최종적으로 사용되는 프로브 단편의 실제 크기 범위는, 예를 들어 사용된 라벨링 방법 매개변수, 생성된 프로브 (예를 들어, 아가로오스 겔) 의 후속 정제, 및 라벨링에 사용되는 사용된 템플레이트 DNA 의 크기 (커다란 템플레이트는, 예를 들어 4 bp 커터를 사용하여 제한 분해될 수 있다, 예를 들어 HaeIII, 사전 라벨링) 에 의해 또한 영향을 받을 수 있다.
당업자는 엄격한 조건하에서의 혼성화가 서열의 %GC 에 의존할 것이며, 코돈 사용 및 GC 함량 최적화에 따라, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드가 서로에 대해 다양한 %GC 를 가질 수 있다는 것을 알고 있다. 그러므로, 관심있는 특정한 뉴클레오티드 서열의 경우, 이것은 혼성화에 의해 비교될 서열에 대한 지식 및 당업계에서의 혼성화에 대한 지식을 기반으로 하여, 엄격한 조건에 대해 어떠한 혼성화 및 세정 조건, 완충제 및 염을 사용해야 하는지에 대한 지식 및 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 랜덤-프라임 라벨링 후에 55 의 %GC 및 300 bp 의 올리고 프로브의 평균 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열의 경우, 1.82 x SSC 이하 및 0.1 % SDS 및 65 ℃ 이상의 SSC 완충제가 엄격한 조건에 대해 사용될 수 있다. 더욱 엄격한 조건을 사용해야 하는 경우, SSC 의 농도를 낮추고, 또한 최대 5 내지 10 % (v/v) 의 포름아미드를 첨가할 수 있다.
글리코시드 히드롤라아제 패밀리 GH20 의 효소는 유리된 또는 고정된 형태로 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어 적합한 캐리어 또는 비이드 또는 유사한 구조물에 부착될 수 있다.
비. 비피둠 (B. bifidum) JCM1254 로부터의 헥소사미니다아제 BbhI (β-N-아세틸헥소사미니다아제) 및 LnbB (락토-N-비오시다아제) 는 모유 올리고당 (HMO) 코어 구조의 효소적 합성을 위한 유망한 후보로서 확인되었다. β-N-아세틸헥소사미니다아제 BbhI 은 효소 클래스 EC 3.2.1.52 에 속하며, 락토-N-비오시다아제 LnbB 는 효소 클래스 EC 3.2.1.140 에 속한다. 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 로부터의 야생형 효소의 서열은 SEQ ID NO: 1 에 상응하는 수탁 번호 AB504521.1 (2010 년 3 월 31 일 발행됨), 및 SEQ ID NO: 3 에 상응하는 수탁 번호 EU281545.1 (2008 년 7 월 1 일 발행됨) 로서 젠뱅크 데이터 베이스에서 확인할 수 있다. 완전히 기능하는 효소의 예시적인 단축형 구축물은 SEQ ID NO: 2 (단축형 BbhI, aa 33-1599) 및 SEQ ID NO: 4 (단축형 LnbB, aa 35-1064) 로 표시된다.
BbhI 은 Chen, X., et al. 에 의해 "Efficient and regioselective synthesis of β-GalNAc/GlcNAc-lactose by a bifunctional transglycosylating β-N-acetylhexosaminidase from Bifidobacterium bifidum" Appl. Environ. Microbiol. 82, 5642-5652 (2016) 에서 이전에 설명되었다.5 효소는 비. 비피둠 (B. bifidum) JCM 1254 의 게놈 DNA 로부터 수득하였다. 또한, Miwa, M., et al. (Cooperation of β-galactosidase and β-N-acetylhexosaminidase from bifidobacteria in assimilation of human milk oligosaccharides with type 2 structure. Glycobiology 20, 1402-1409 (2010)) 은 비. 비피둠 (B. bifidum) JCM1254 로부터의 게놈 DNA 를 템플레이트로서 사용하여 PCR 에 의해 증폭된 Bbh1 을 사용하였다.12 비피도박테리아 균주는 Japan Collection of Microorganisms (JCM), RIKEN Bioresource Center, Japan 으로부터 수득하였다.
LnbB 는 Wada, J., et al. 에 의해 "Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase, a critical enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides with a type 1 structure", Appl. Environ. Microbiol. 74, 3996-4004 (2008) 에서 이전에 설명되었다.6 LnbB 는 비. 비피둠 (B. bifidum) JCM1254 로부터의 게놈 DNA 를 템플레이트로서 사용하여 PCR 에 의해 증폭되었다. 박테리아 균주는 Japan Collection of Microorganisms (JCM), RIKEN Bioresource Center, Japan 으로부터 수득하였다.
히드롤라아제 활성에 대한 트랜스-글리코실화 활성을 증가시키기 위해서, 상이한 돌연변이를 시험하였다. Asp746 의 SEQ ID NO: 1 에서 Ala, Glu 또는 Gln 에 의한 대체는 2 차 가수분해와 관련하여 매우 현저한 개선을 제공하였으며, 생산 활성의 손실이 거의 또는 전혀 없는 것으로 밝혀졌다. 야생형 및 변이 효소의 정제된 제제는, 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 C-말단 His6-tag 를 갖는 대장균 과발현 배양으로부터 수득하였다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기에서 기술한 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법에서, β-N-아세틸헥소사미니다아제는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 β-N-아세틸헥소사미니다아제는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 5 내지 8 은 상기에서 기술한 돌연변이를 갖는 BbhI 의 단축형 버전을 나타낸다. SEQ ID NO: 1 의 위치 746 및 827 에서의 돌연변이는 절대적인 것으로 이해해서는 안되지만, GH20 패밀리 또는 EC 클래스 EC 3.2.1.52 에 속하고 글리코시다아제 활성을 갖는 효소, 특히 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 예를 들어 다른 유기체로부터의 상동체 효소의 등가 위치에서의 상응하는 돌연변이는 또한 본 발명에 따른 기능성을 제공한다. 등가 위치는 도 16 에 도시한 바와 같은 전역 서열 정렬에 의해 확인할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 문맥에서 사용되는 BbhI 은 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 서열, 특히 DNA 서열, 및 이러한 뉴클레오티드 서열을 사용하는 상기에서 기술한 바와 같은 방법을 제공하고, 여기에서 뉴클레오티드 서열은 상기에서 기술한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 GH20 의 효소, 특히 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것에 따른 효소의 단축형 기능적 버전을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화된다.
락토오스 상에서 GlcNAc-옥사졸린 또는 GlcNAc-β-pNP 로부터의 LNT II 합성 반응에서 BbhI 효소의 트랜스-글리코실화 활성을 분석하였다. 제 1 단계에서, 10- 또는 20-배 과량의 수용체 기질을 사용하여 생성물 형성을 촉진시켰다. 도 1 (GlcNAc-옥사졸린) 및 도 2 (GlcNAc-β-pNP) 는 BbhI 변이체에 대한 반응 시간 과정을 야생형 효소에 대한 반응 시간 과정과 비교한다. 모든 생성물 농도는 195 nm 에서의 UV 검출을 갖는 HPLC 분석에 의해 분석적으로 관찰하였다 (도 3). N-아세틸-2-아미노 당 (LNT II, GlcNAc) 의 용출은 N-아세틸기의 흡광도를 측정함으로써 모니터링할 수 있었다. 표 1 은 BbhI 효소의 비활성 (트랜스-글리코실화, 2 차 가수분해) 및 선택성 매개변수 (RTH 값) 를 요약한다. 수용체 기질의 존재하에 "합성 조건하에서" 반응 선택성의 변화를 정량화하기 위해서, 매개변수 RTH (수용체 기질의 존재하에서 GlcNAc-에서-락토오스로의 전이의 특정한 트랜스-글리코실화 활성과 비-생산적인 공여체 기질 가수분해 (1 차 가수분해) 의 비활성의 비율) 를 사용하였다. 야생형 BbhI 및 GlcNAc-옥사졸린을 공여체로서 사용하여 (도 1a), LNT II 는 약 52 % (34 mM) 의 최대 수율로 수득하였다. D746E 돌연변이는 유의하게 향상된 트랜스-글리코실화 활성을 나타냈다. 최대 LNT II 수율은 87 % (53 mM) 였다 (도 1b). Y827F 돌연변이 (도 1c) 는 D746E 변이체와 유사한 거동을 나타냈으며, 80 % 의 최대 수율을 제공하였다. 잔기 746 에서의 Asp 에서 Ala 돌연변이는 BbhI 의 가수분해 활성을 완전히 제거하였지만 (도 1 d), 트랜스-글리코실화 활성이 또한 야생형에 비해서 감소하였다. Gln 에 의한 Asp746 의 대체는 2 차 가수분해 및 트랜스-글리코실화 활성 모두를 거의 완전히 제거하였다 (도 1 e). 효소의 고유한 히드롤라아제 활성은 또한 GlcNAc-옥사졸린 기질의 부분적으로 비-생산적인 이용을 유발함으로써, 사용된 조건하에서 LNT II 수율을 제한하였다. D746E 돌연변이는 50 의 RTH 값으로, 1 차 가수분해에 비해서 유의하게 향상된 트랜스-글리코실화 활성을 나타냈다 (도 1f, 표 1). 공여체 기질로서의 GlcNAc-β-pNP 에 의해, GlcNAc-옥사졸린으로부터의 LNT II 합성과 비슷한 결과가 수득되었다 (표 1, 도 2). 모든 경우에 있어서, LNT II 의 형성이 TLC 분석에 의해 확인되었다 (도 2f, 4). 일반적으로, GlcNAc-옥사졸린에 의해, 더 높은 트랜스-글리코실화 활성이 관찰되었다. 또한, pH 에 따라 GlcNAc-옥사졸린의 비-효소적 가수분해 (옥사졸린 부분의 개환) 가 발생할 수 있다는 점에 주목한다.4, 13 pH 값은 GlcNAc-β-pNP 를 사용하는 야생형 BbhI 에 의한 생성물 형성에 강하게 영향을 미친다는 것이 문헌으로부터 공지되어 있다.5 생성물 수율의 관점에서 최적의 pH 는 pH 5.8 이었으며, pH 9 에서 급격히 감소하였다. 당 옥사졸린은 비교적 높은 pH (>8, 데이터는 표시하지 않음) 에서 더 높은 안정성을 갖지만, pH 7.5 가 효소 활성과 공여체 기질 안정성 사이의 양호한 절충을 나타냈다. 최대 수율은 10 min - 120 min 내에서 수득하였다. 효소적 및 비-효소적 GlcNAc-옥사졸린 가수분해에 대응하기 위해서, 락토오스에 비해서 3.2-배 과량의 GlcNAc-옥사졸린을 사용하면, 불량한 LNT II 수율을 나타냈다는 점에 주목한다. 최대 수율은 야생형에서 단지 32 %, 및 D746E 변이체에서 54 % 였다 (도 5).
표 1: BbhI 의 야생형 및 부위 지향적 변이체의 활성 및 선택성 매개변수
Figure pct00005
n.d., 검출 불가.
a 60 mM GlcNAc-옥사졸린, 600 mM 락토오스, 37 ℃, pH 7.5.
b 20 mM GlcNAc-β-pNP, 400 mM 락토오스, 20 % DMSO, 55 ℃, pH 5.8.
c RTH 는 '합성 조건' 하에서 GlcNAc-에서-락토오스 전이의 특정한 트랜스-글리코실화 활성 대 비-생산적인 공여체 기질 가수분해 (GlcNAc-옥사졸린 또는 GlcNAc-β-pNP; 1 차 가수분해) 의 비활성의 비율이다.
d 제 1 데이터 포인트는 가장 가능하게는 선형 범위 밖에 있었다.
전반적으로, 표 1 및 도 1f 는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 BbhI 의 D746E 변이체가 LNT II 합성의 추가의 최적화를 위한 최상의 후보였음을 명확히 보여준다. GlcNAc-옥사졸린을 공여체 기질로서 사용하면, 이 돌연변이는 ≥ 3.7 U mg-1 의 특정한 트랜스-글리코실화 활성을 가졌으며, 1 차 및 2 차 가수분해와 비교하여 트랜스-글리코실화에 대한 강력한 선호도를 나타냈다. GlcNAc-β-pNP 와의 반응과 비교하여, 트랜스-글리코실화 활성은 ~10-배 증가하였으며, 독성 p-니트로페놀이 부산물로서 방출되지 않았다. 야생형 BbhI 에 의한 GlcNAc-β-pNP 로부터의 LNT II 합성은 재현될 수 있다.5 패밀리 GH18 로부터의 키티나아제의 돌연변이는 키토올리고머 합성에 대해 향상된 트랜스-글리코실화 활성을 갖는 것으로 이전에 나타났지만, 생성물에 대한 가수분해 활성은 감소하였다.14, 15 지금까지, 개선된 트랜스-글리코실화 활성을 갖는 단지 2 개의 조작된 GH20 헥소사미니다아제 만이 알려져 있다.11, 7 이들 중에서, Tyr470 이 Phe 로 대체된 진균 키티나아제는 트랜스-글리코실화 반응에서 공여체 기질로서 GlcNAc-옥사졸린을 수용하지 않았다.11 메타게놈 기원으로부터의 β-N-아세틸헥소사미니다아제 HEX1 의 루프 돌연변이에 의한 공여체 기질로서 N,N'-디아세틸키토비오스로부터의 LNT II 합성은 낮은 수율 (≤30 %) 을 나타냈다.7 또한, 4 개의 위치 이성질체가 형성되었으며, LNT II (4.7 % 수율) 는 주 생성물이 아니었다. 본 발명은 최초로 당 옥사졸린으로부터 소분자 합성을 위한 유용한 촉매인 GH20 글리코시다아제-유사 효소를 제공한다.
BbhI 의 D746E 돌연변이는 생성물 가수분해 활성이 미미하거나 또는 전혀 없는 현저한 트랜스-글리코실화 활성을 나타낸다. 이러한 글리코시다아제 돌연변이된 효소와 고도로 활성화된 공여체 기질인 당 옥사졸린의 조합된 사용은 야생형 BbhI 및 GlcNAc-β-pNP 와의 참조 반응과 비교할 때, 60-배 향상된 LNT II 농도를 유도하였다.5 수율은 2 배 (공여체와 수용체 기질을 기준으로 함) 였으며, TTNmass 값 (388 gLNT II gBbhI-1) 은 170-배 증가된 STY (562 g L-1 h-1) 에서 1.6-배 개선되었다. GlcNAc-옥사졸린으로부터 LNT II 합성의 추가의 강화는 배치에서 연속 공정 모드로 변경함으로써 실현될 수 있다. N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제를 사용한 최고의 LNT II 합성에 대해서, 생체외 또는 생체내에서 벤치마킹된, 515 mM 의 LNT II 농도는 1 내지 2 배 정도의 개선을 나타낸다.16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 TTNmass 는 단당류 활성화 및 전이 과정을 위한 원-포트 다중효소 시스템을 사용한, LNT II 의 생체외 합성과 비교하여 유의하게 향상되었다 (2- 내지 26-배).19, 21 지금까지, LNT II 의 대규모 생산은 글리코실트랜스퍼라아제-기반 생체내 시스템 (전체-세포 또는 발효-기반) 으로만 달성될 수 있다.17, 20, 24 그러나, 훨씬 더 큰 반응 부피 (20- 내지 100-배) 는 여기에 제시된 트랜스글리코실화 과정에 필적하는 양으로 제품을 수득하는데 필요하다.17, 20, 21
처음으로, 용이하게 확장 가능한 트랜스글리코실화 과정이 본 발명에 의해 제공되어, 당 옥사졸린으로부터 소분자, HMO 코어 구조 LNT II 를 대량으로 생산할 수 있다. 지금까지, 당 옥사졸린으로부터 소분자의 합성을 위한 글리코시다아제의 가능성을 보여주는 GH18 키티나아제에 대한 보고는 단 한건 뿐이다.25 그러나, 바실루스 에스피. (Bacillus sp.) 로부터 키티나아제에 의한 GlcNAc (3-배 과량) 및 GlcNAc-옥사졸린으로부터 이당류 N,N'-디아세틸키토비오스 (172 mM) 의 합성은 낮은 수율을 나타냈다 (43 %). 이당류 옥사졸린으로부터 삼- 및 사당류의 합성도 설명되었다.26 그러나, 여기에 제시된 트랜스글리코실라아제 과정과 비교하여, 유의하게 낮은 수율 (50 - 70 %, 공여체 기준) 및 생성물 농도 (~10-배) 가 수득되었다.26 전형적으로, 당 옥사졸린 유도체의 중부가 또는 올리고당-함유 거대 단량체의 단계적 합성이 키티나아제에 대해 보고되었다.26, 46
바람직한 구현예에 있어서, 상기에서 기술한 락토-N-테트라오스의 제조 방법에서, 락토-N-비오시다아제는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 락토-N-비오시다아제는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 9 내지 11 은 상기에서 기술한 돌연변이를 갖는 LnbB 의 단축형 버전을 나타낸다. SEQ ID NO: 3 의 위치 320 및 419 에서의 돌연변이는 절대적인 것으로 이해해서는 안되지만, GH20 패밀리 또는 EC 클래스 EC 3.2.1.140 에 속하고 글리코시다아제 활성을 갖는 효소, 특히 락토-N-비오시다아제, 예를 들어 다른 유기체로부터의 상동체 효소의 등가 위치에서의 상응하는 돌연변이는 또한 본 발명에 따른 기능성을 제공한다. 등가 위치는 도 16 에 도시한 바와 같은 전역 서열 정렬에 의해 확인할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 문맥에서 사용되는 LnbB 는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 서열, 특히 DNA 서열, 및 이러한 뉴클레오티드 서열을 사용하는 상기에서 기술한 바와 같은 방법을 제공하고, 여기에서 뉴클레오티드 서열은 상기에서 기술한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 GH20 의 효소, 특히 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것에 따른 효소의 단축형 기능적 버전을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화된다.
야생형 LnbB 및 이의 변이체의 트랜스-글리코실화 활성은 BbhI 에 대해 상기에서 기술한 것과 동일한 반응 조건하에서 분석하였다. 락토오스 (30 - 50-배 과량) 상에서 LNB-옥사졸린 또는 LNB-β-pNP 로부터 LNT 합성의 전체 반응 시간 과정은 도 6 (LNB-옥사졸린) 및 도 7 (LNB-β-pNP) 에 도시되어 있다. HPLC 분석이 정량화를 위해 사용되었다 (도 8). 생성물 상동성의 추가의 확인이 TLC 분석에 의해 수득되었다 (도 9). 표 2 는 두 공여체 기질에 대한 LnbB 변이체의 비활성과 야생형 효소의 비활성을 비교한다. 유사한 결과가 LNB-옥사졸린 및 LNB-β-pNP 에 의해 수득되었지만, LNB-옥사졸린이 바람직한 기질이었다. BbhI 에 대해 관찰된 바와 같이, LnbB 에서의 Glu 에 의한 상응하는 Asp320 의 SEQ ID NO: 3 에서의 대체는 가장 유익한 돌연변이였다. 강력한 생성물 가수분해를 나타낸 야생형 LnbB 와 달리, 2 차 가수분해는 이러한 돌연변이에 의해 완전히 제거되었다. LNT 는 LNB-옥사졸린으로부터 30 % (3.5 mM) 의 수율로 수득되었으며, 생성물 가수분해는 22 h 내에 검출되었다. 5-배 증가된 양의 D320E 에 의한 배양은 동일한 생성물 수율을 상응하게 더 빠르게 제공하였다 (도 10).
표 2: LnbB 의 야생형 및 부위 지향적 변이체의 활성 및 선택성 매개변수
Figure pct00006
n.d., 검출 불가.
a 12 mM LNB-옥사졸린, 600 mM 락토오스, 37 ℃, pH 7.5.
b 20 mM LNB-β-pNP, 600 mM 락토오스, 15 % DMSO, 37 ℃, pH 5.8.
지금까지, LnbB 는 이들의 비-환원 말단으로부터 LNB 를 방출하는 HMO 의 분해에 대한 중요한 효소로서 확인되었다.6, 28, 29 그러나, 야생형 효소는 역 반응인 트랜스-글리코실화에 대한 유용한 촉매가 아니었다.6 LNT 의 효율적이고 실용적인 효소적 합성은 달성되지 않았다. 바실루스 시르쿨란스 (Bacillus circulans) β-갈락토시다아제는 원하지 않는 LNT 위치 이성질체와 함께, LNT 를 19 % 수율로 제공하였다.16 아우레오박테리움 에스피. (Aureobacterium sp.) L-101 로부터 락토-N-비오시다아제에 의한 락토오스에서 LNT 로의 전환은 매우 비효율적이었다 (수율 < 4 %).16 LNT 벤질 글리코시드는 GST-태그된 이. 콜리 (E. coli) β1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 융합 단백질을 사용하여, LNT II 벤질 글리코시드 (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제에 의해 락토오스 벤질 글리코시드 및 UDP-GlcNAc 로부터 합성됨) 및 UDP-Gal 로부터 74 % 수율 (~10 mM) 로 생성되었다.30 그러나, 값비싼 뉴클레오티드-활성화된 당이 필요하였다. LNT (173 g, 12.7 g L-1) 의 대규모 생산은 맞춤형 글리코실트랜스퍼라아제를 과발현하는 대사적으로 조작된 이. 콜리 (E. coli) 의 유가식 배양에 의해서만 달성되었다.17 그러나, LNT 및 LNT II 의 1:1 혼합물이 수득되었다.17
본 발명의 문맥에서, 트랜스글리코실라아제 돌연변이 D320E 가 생성되었다. 생성물의 임의의 검출 가능한 가수분해없이, LNB-옥사졸린으로부터 LNT 의 합성이 입증되었다.
하나의 바람직한 구현예에 있어서, 상기에서 기술한 방법은 하기의 단계를 추가로 포함한다:
(ii) 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소를 탈활성화시키는 단계.
글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 탈활성화는 원하지 않는 부반응의 위험없이, 본 발명에 따른 방법에서 수득된 반응 생성물의 추가의 처리를 허용한다. 예를 들어, 락토-N-트리오스 II 를 락토-N-테트라오스 또는 락토-N-네오테트라오스에 추가로 반응시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 락토-N-네오테트라오스 (LNnT) 또는 락토-N-테트라오스 (LNT) 를 제공하는 β-갈락토시다아제16, 31 또는 Leloir 글리코실트랜스퍼라아제19, 20, 21 가 사용될 수 있다.
또다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기에서 기술한 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법은 하기의 단계를 추가로 포함한다:
(iii) β-갈락토시다아제 또는 갈락토실 트랜스퍼라아제 및 UDP-갈락토오스를 단계 (i) 의 혼합물 또는, 바람직하게는 단계 (ii) 의 혼합물에 첨가하고, 임의로 추가의 락토오스를 첨가하여, 락토-N-테트라오스 또는 락토-N-네오테트라오스를 수득하는 단계.
락토-N-트리오스 II 와 β-갈락토시다아제의 추가의 반응은 위치 선택적 갈락토실-전이에 의해 LNT 또는 LNnT 를 제공한다.16, 31 마찬가지로, 락토-N-트리오스 II 와 갈락토실 트랜스퍼라아제 및 공여체 기질로서 UDP-갈락토오스의 반응은 LNT 또는 LNnT 를 제공한다.19, 20, 21 대안적으로, UDP-글루코오스는 에피머라아제와 조합하여, 동일계에서 UDP-갈락토오스 공여체 기질을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 락토오스로부터 락토-N-트리오스 II 또는 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한, 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도에 관한 것이다.
상기에서 기술한 바와 같은 락토-N-트리오스 II 를 생성하기 위한, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도가 바람직하며, 여기에서 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 1 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 β-N-아세틸헥소사미니다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 와 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소이다.
상기에서 기술한 바와 같은 락토-N-트리오스 II 를 생성하기 위한, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도가 특히 바람직하며, 여기에서 β-N-아세틸헥소사미니다아제는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 β-N-아세틸헥소사미니다아제는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 문맥에서 사용되는 BbhI 은 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같은 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도가 더욱 바람직하며, 여기에서 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 락토-N-비오시다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 3 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 락토-N-비오시다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 와 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소이다.
상기에서 기술한 바와 같은 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도가 특히 바람직하며, 여기에서 락토-N-비오시다아제는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 락토-N-비오시다아제는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 문맥에서 사용되는 LnbB 는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같은 용도의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 상기에서 기술한 구현예 중 임의의 것에 따른 방법에서 사용된다.
본 발명은 실증 규모에서의 생산을 가능하게 하는 공정 확장에 적합한, 고도로 생산적인 트랜스글리코실화 공정을 설명한다. 현재의 LNT II 합성은 효소적 글리코실화에 의한 HMO 코어-구조의 제조에서 전례가 없는 성능 면에서 이루어진다. 각각 β-N-아세틸헥소사미니다아제- 및 글리코실트랜스퍼라아제-촉매작용된 반응과 비교하여, 생체 촉매 반응의 유의한 강화는 상기에서 기술한 효소를 사용하여 달성되었다.5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 불순물로서 주로 락토오스를 갖는 약 80 % 의 순도로 LNT II 의 간단한 회수는 확립된 공정의 확장성에 분명히 유리하다. 대량의 실제 생산을 가능하게 하는 트랜스글리코실화 공정은 신규이며, 이 분야에서 광범위하게 관련이 있다. LNT II 는 HMO 의 주요 빌딩 블록 중 하나이다.32 여기에 설명된 간단하고 정교한 LNT II 합성은 HMO 구조에 대한 진입을 제공한다. 또한, LNT 및 LNnT 는 상기에서 기술한 효소를 사용하여 수득될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, BbhI 및 LnbB 의 특정한 돌연변이가 확인되었으며, 이는 HMO 코어 구조의 생성에 매우 유용하다.
그러므로, 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 BbhI 은 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
추가로, 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 LnbB 는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 서열, 특히 DNA 서열을 제공하고, 여기에서 뉴클레오티드 서열은 상기에서 기술한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 GH20 의 효소, 특히 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 11 중 임의의 것에 따른 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제를 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화된다.
본 발명은 또한 상기에서 정의한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소, 락토오스, 바람직하게는 50 g/L 이상의 락토오스, 보다 바람직하게는 100 g/L 이상의 락토오스, 특히 바람직하게는 150 g/L 이상의 락토오스, 가장 바람직하게는 190 g/L 이상의 락토오스 및
a) 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린; 및/또는
b) 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스
를 포함하는 수용액을 제공한다.
바람직하게는, 수용액은 유기 용매를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는다.
이 문맥에서의 "본질적으로 함유하지 않는" 은, 바람직하게는 용액 중에 존재하는 유기 용매가 10 g/L 이하, 보다 바람직하게는 1 g/L 이하인 것을 의미한다.
바람직한 구현예에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 1 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 β-N-아세틸헥소사미니다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 와 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소이다.
또다른 바람직한 구현예에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소는 락토-N-비오시다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 3 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 락토-N-비오시다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 와 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소이다.
바람직하게는, 수용액에 존재하는 효소는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지며, 이의 자연적인 생물학적 문맥에서 도출되고 본원에서 기술한 바와 같은 목적을 위해 특별히 고안된 인공적인 구성물을 나타낸다. 그러므로, 이것은 천연적으로 발생하는 단백질의 단축형, 그러나 기능적 버전일 수 있으며, 특정한 변형, 예를 들어 His-tag 와 같은 이의 생명 공학적 생산 또는 정제를 단순화하는 변형을 가질 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같은 수용액이 특히 바람직하고, 여기에서 β-N-아세틸헥소사미니다아제는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 β-N-아세틸헥소사미니다아제는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
상기에서 기술한 바와 같은 수용액이 더욱 특히 바람직하고, 여기에서 락토-N-비오시다아제는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖거나, 또는 락토-N-비오시다아제는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것과 70 % 이상, 71 % 이상, 72 % 이상, 73 % 이상, 74 % 이상, 75 % 이상, 76 % 이상, 77 % 이상, 78 % 이상, 79 % 이상, 80 % 이상, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상, 85 % 이상, 86 % 이상, 87 % 이상, 88 % 이상, 89 % 이상, 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
구현예
1. 하기의 단계를 포함하는 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스의 제조 방법:
(i) 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린을 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 의해 촉매작용되는 락토오스와 반응시켜 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스를 수득하는 단계.
2. 구현예 1 에 있어서, 단계 (i) 이 50 g/L 이상의 락토오스, 바람직하게는 100 g/L 이상의 락토오스, 특히 바람직하게는 150 g/L 이상의 락토오스, 가장 바람직하게는 190 g/L 이상의 락토오스를 함유하는 수용액 중에서 수행되는 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2 에 있어서, 방법이 유기 용매를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는 조건하에서 수행되는 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린이 각각 20 분 이상, 바람직하게는 60 분 이상의 기간에 걸쳐 락토오스 및 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 첨가되는 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소가 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 1 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 β-N-아세틸헥소사미니다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 와 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소인 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법.
6. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소가 락토-N-비오시다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 3 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 락토-N-비오시다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 와 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소인 락토-N-테트라오스의 제조 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 방법이 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
(ii) 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소를 탈활성화시키는 단계.
8. 구현예 1 내지 5 또는 7 중 어느 하나에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법:
(iii) β-갈락토시다아제 또는 갈락토실 트랜스퍼라아제 및 UDP-갈락토오스를 단계 (i) 의 혼합물 또는, 바람직하게는 단계 (ii) 의 혼합물에 첨가하고, 임의로 추가의 락토오스를 첨가하여, 락토-N-테트라오스 또는 락토-N-네오테트라오스를 수득하는 단계.
9. 락토오스로부터 락토-N-트리오스 II 또는 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도, 바람직하게는 락토-N-트리오스 II 를 생성하기 위한 구현예 5 에서 정의한 바와 같은 효소의 용도, 또는 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한 구현예 6 에서 정의한 바와 같은 효소의 용도.
10. 구현예 9 에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소가 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용되는 용도.
11. SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제.
12. SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에서 정의한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소, 락토오스, 바람직하게는 50 g/L 이상의 락토오스, 보다 바람직하게는 100 g/L 이상의 락토오스, 특히 바람직하게는 150 g/L 이상의 락토오스, 가장 바람직하게는 190 g/L 이상의 락토오스 및
a) 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린; 및/또는
b) 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스
를 포함하는 수용액.
도 1: 야생형 BbhI 및 이의 돌연변이에 의한 LNT II 합성. 시간 과정은 10-배 과량의 락토오스를 사용하여 60 mM GlcNAc-옥사졸린으로부터의 합성을 보여준다. (a) 야생형, 0.23 μM; (b) D746E, 8.4 μM; (c) Y827F, 4 μM; (d) D746A, 18 μM; (e) D746Q, 9 μM. LNT II, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미. (f) 트랜스-글리코실화 대 1 차 가수분해. RTH 는 '합성 조건' 하에서 GlcNAc-에서-락토오스 전이의 특정한 트랜스-글리코실화 활성 대 비-생산적인 GlcNAc-옥사졸린 가수분해 (1 차 가수분해) 의 비활성의 비율이다. 야생형 및 각 돌연변이의 경우 3 개의 막대가 표시되며, 왼쪽 막대는 특정한 트랜스-글리코실화 활성을 나타내고; 중간 막대는 최대 LNT II 수율을 나타내며; 오른쪽 막대는 RTH 값을 나타낸다.
도 2: 야생형 BbhI 및 이의 돌연변이에 의한 GlcNAc-β-pNP 로부터의 LNT II 합성. 시간 과정은 20 % DMSO 의 존재하에서 20-배 과량의 락토오스를 사용하여 20 mM GlcNAc-β-pNP 로부터의 합성을 보여준다. (a) 야생형, 0.12 μM; (b) D746E, 8.4 μM; (c) D746A, 24 μM; (d) D746Q, 8.6 μM; (e) Y827F, 8 μM. LNT II, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미; pNP 방출, 하얀 삼각형. (f) BbhI 효소를 사용하는 LNT II 합성의 TLC-분석. 반응 혼합물을 2-배 희석시켰다. 탄수화물을 티몰-황산 시약에 의해 시각화하였다. pNP 를 UV (254 nm) 에 의해 검출하였다. 레인 1, pNP; 레인 2, 락토오스; 레인 3, LNT II; 레인 4, 1.5 h 후의 야생형 반응; 레인 5, 20 min 후의 D746E 반응; 레인 6, 1.5 h 후의 Y975F 반응; 레인 7, 8 h 후의 D746A 반응; 레인 8, 6 h 후의 D746Q 반응.
도 3: 야생형 BbhI 및 이의 돌연변이에 의한 GlcNAc-옥사졸린으로부터의 LNT II 합성의 HPLC 분석. BbhI 의 다양한 효소 변이체에 의해 수득된 최대 LNT II 형성을 보여주는 HPLC-크로마토그램의 오버레이. 반응 혼합물은 60 mM GlcNAc-옥사졸린, 10-배 과량의 락토오스 및 0.23 - 18 μM 의 효소를 함유하였다. 샘플을 각각 10-배 (D746Q) 및 25-배 (모든 다른 효소) 희석시켰다. 195 nm 에서의 UV-검출을 사용하였다.
도 4: 야생형 BbhI 및 이의 돌연변이에 의한 GlcNAc-옥사졸린으로부터의 LNT II 합성의 TLC 분석. 130 mM (D746E) 또는 60 mM (모든 다른 효소) GlcNAc-옥사졸린, 600 mM 락토오스 및 0.23 - 18 μM 의 효소를 사용하였다. 탄수화물을 티몰-황산 시약에 의해 시각화하였다. GlcNAc 를 또한 UV (254 nm) 에 의해 검출하였다. (a) 레인 1, GlcNAc; 레인 2, 락토오스; 레인 3, LNT II; 레인 4, 1 h 후의 야생형 반응, 1:10; 레인 5, 50 min 후의 D746E 반응, 1:50; 레인 6, 5 h 후의 D746A 반응, 1:25; 레인 7, 갈락토오스; 레인 8, 글루코오스. (b) 레인 1, GlcNAc; 레인 2, 락토오스; 레인 3, LNT II; 레인 4, 50 min 후의 Y827F 반응, 1:9.
도 5: 야생형 BbhI 및 D746E 돌연변이에 의한 GlcNAc-옥사졸린으로부터의 LNT II 합성. 시간 과정은 64 mM GlcNAc-옥사졸린 및 20 mM 락토오스로부터의 합성을 보여준다. (a) 야생형, 0.23 μM; (b) D746E, 8.4 μM. LNT II, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미.
도 6: 야생형 LnbB 및 이의 돌연변이에 의한 LNT 합성. 시간 과정은 50-배 과량의 락토오스를 사용하여 12 mM LNB-옥사졸린으로부터의 합성을 보여준다. (a) 야생형, 0.5 μM; (b) D320E, 4 μM; (c) D320A, 20 μM; (d) Y419F, 4 μM. LNT, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미; LNT II, 검은 삼각형.
도 7: 야생형 LnbB 및 이의 돌연변이에 의한 LNB-β-pNP 로부터의 LNT 합성. 시간 과정은 15 % DMSO 의 존재하에서 30-배 과량의 락토오스를 사용하는 20 mM LNB-β-pNP 로부터의 합성을 보여준다. (a) 야생형, 0.5 μM; (b) D320E, 10 μM; (c) D320A, 20 μM; (d) Y419F, 4 μM. LNT, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미; pNP 방출, 하얀 삼각형. (e) LnbB 효소를 사용하는 LNT 합성의 TLC-분석. 반응 혼합물을 5-배 희석시켰다. 탄수화물을 티몰-황산 시약에 의해 시각화하였다. 레인 1, LNB; 레인 2, 락토오스; 레인 3, LNT; 레인 4, 10 min 후의 야생형 반응; 레인 5, 20 min 후의 D320E 반응; 레인 6, 2.5 h 후의 Y419F 반응; 레인 7, 21 h 후의 D320A 반응.
도 8: 야생형 LnbB 및 이의 돌연변이에 의한 LNB-옥사졸린으로부터의 LNT 합성의 HPLC 분석. LnbB 의 다양한 효소 변이체에 의해 수득된 최대 LNT 형성을 보여주는 HPLC-크로마토그램의 오버레이. 반응 혼합물은 12 mM LNB-옥사졸린, 50-배 과량의 락토오스 및 0.5 - 20 μM 의 효소를 함유하였다. 샘플을 5-배 희석시켰다. 195 nm 에서의 UV-검출을 사용하였다.
도 9: 야생형 LnbB 및 이의 돌연변이에 의한 LNB-옥사졸린으로부터의 LNT 합성의 TLC 분석. 12 mM LNB-옥사졸린, 50-배 과량의 락토오스 및 0.5 - 20 μM 의 효소를 사용하였다. 반응 혼합물을 5-배 희석시켰다. 탄수화물을 티몰-황산 시약에 의해 시각화하였다. (a) 레인 1, GlcNAc; 레인 2, LNB; 레인 3, 락토오스; 레인 4, LNT II; 레인 5, LNT; 레인 6, 10 min 후의 야생형 반응; 레인 7, 20 min 후의 D320E 반응; 레인 8, 2.5 h 후의 Y419F 반응; 레인 9, 21 h 후의 D320A 반응. (b) 레인 1, GlcNAc; 레인 2, LNB; 레인 3, LNT II; 레인 4, LNT; 레인 5, 0 min 후의 야생형 반응; 레인 6, 10 min 후의 야생형 반응; 레인 7, 0 h 후의 D320E 반응; 레인 8, 1 h 후의 D320E 반응; 레인 9, 락토오스.
도 10: LnbB D320E 돌연변이에 의한 LNT 의 합성. 반응 혼합물은 12 mM LNB-옥사졸린, 50-배 과량의 락토오스 및 20 μM D320E 를 함유하였다. LNT, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미; LNT II, 검은 삼각형.
도 11: BbhI D746E 돌연변이에 의한 LNT II 의 대량 합성. (a) 동몰량의 GlcNAc-옥사졸린 및 락토오스 (600 mM) 를 사용하는 D746E 변이체 (4 μM) 에 의한 LNT II 합성의 시간 과정. (b) GlcNAc-옥사졸린 (255 mM) 및 0.4 μM 의 효소에 비해서 2.4 배 과량의 락토오스를 사용하는, LNT2 합성을 위한 야생형 BbhI (삼각형) 및 D746E 돌연변이 (동그라미) 의 비교. LNT II, 검은 기호; 수율, 하얀 기호. 그램 규모로 생성된 LNT II 의 순도를 평가하는데 사용되는 HPLC-UV 트레이스 (c) 및 HPLC-RI 트레이스 (d) 의 오버레이. HPLC-RI 트레이스에서의 제 1 피크는 주입 피크인 것에 주목한다.
도 12: BbhI 의 D746E 돌연변이에 의한 GlcNAc-옥사졸린 농도 증가에 따른 LNT II 합성. 시간 과정은 다양한 농도의 GlcNAc-옥사졸린, 600 mM 락토오스 및 4.2 μM D746E 를 사용하는 합성을 보여준다. GlcNAc-옥사졸린 농도는 다음과 같았다: (a) 130 mM, (b) 260 mM, (c) 500 mM. LNT II, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미. (d) 500 mM 의 GlcNAc-옥사졸린을 사용하는 LNT II 의 TLC-분석. 반응 혼합물을 50-배 희석시켰다. 레인 1, GlcNAc; 레인 2, 락토오스; 레인 3, LNT II; 레인 4, 0 h; 레인 5, 2.5 min; 레인 6, 30 min; 레인 7, 5 h; 레인 8, 23.5 h. (e) 600 mM 의 GlcNAc-옥사졸린을 사용하는 LNT II 의 TLC-분석. 반응 혼합물을 200-배 희석시켰다. 레인 1, GlcNAc; 레인 2, 락토오스; 레인 3, LNT II; 레인 4, 0 h; 레인 5, 2.5 min; 레인 6, 5 min; 레인 7, 30 min; 레인 8, 7 h; 레인 9, 23.5 h. 탄수화물을 티몰-황산 시약에 의해 시각화하였다. GlcNAc 를 또한 UV (254 nm) 에 의해 검출하였다.
도 13: 야생형 BbhI 및 D746E 돌연변이에 의한 GlcNAc-β-pNP 로부터의 LNT II 합성. 시간 과정은 20 % DMSO 의 존재하에서 100 mM GlcNAc-β-pNP 및 600 mM 락토오스로부터의 합성을 보여준다. (a) D746E, 8.4 μM; (b) 야생형, 0.12 μM. LNT II, 검은 동그라미; 수율, 하얀 동그라미; pNP 방출, 하얀 삼각형.
도 14: 단리된 LNT II 의 1 H NMR 스펙트럼. LNT II 를 D2O 에 용해시켰다. 스펙트럼은 이전에 공개된 데이터를 따른다.4
도 15: 단리된 LNT II 의 13 C NMR 스펙트럼. LNT II 를 D2O 에 용해시켰다. LNT II (GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc) 가 형성된 유일한 위치 이성질체 (82 ppm) 임을 보여주는 전체 스펙트럼 및 부분 스펙트럼 (삽입). 다른 위치 이성질체는 검출할 수 없었다. 스펙트럼은 이전에 공개된 데이터를 따른다.4
도 16: BbhI 및 LnbB 의 야생형 및 돌연변이 구성물 (SEQ ID NO: 12-20) 의 전역 서열 정렬 및 다른 유기체 (SEQ ID NO 21-24) 로부터의 상응하는 서열. 정렬은 프로그램 "MegAlign Pro" Version: 12.2.0 (82) Copyrightⓒ 2012-2015, DNASTAR, Inc. 를 사용하여 수행하였다. 사용된 알고리즘은 "MUSCLE" (로그별 다중 시퀀스 비교) 이었다. 정렬된 서열은 다음과 같다: BbhI, 야생형 (wt), His-tag (SEQ ID NO: 12) 를 포함하는 단축형 구성물, BbhI, D746E 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 13) 를 포함하는 단축형 구성물, BbhI, D746A 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 14) 를 포함하는 단축형 구성물, BbhI, D746Q 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 15) 를 포함하는 단축형 구성물, BbhI, Y827F 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 16) 를 포함하는 단축형 구성물, LnbB, 야생형 (wt), His-tag (SEQ ID NO: 17) 를 포함하는 단축형 구성물, LnbB, D320E 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 18) 를 포함하는 단축형 구성물, LnbB, D320A 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 19) 를 포함하는 단축형 구성물, LnbB, Y419F 돌연변이, His-tag (SEQ ID NO: 20) 를 포함하는 단축형 구성물; 악티노마이세탈레스 박테리움 (Actinomycetales bacterium), 젠뱅크 AKC34128.1 (SEQ ID NO: 21) 로부터의 Hex 1, 박테로이데테스 박테리움 (Bacteroidetes bacterium), 젠뱅크 AKC34129.1 (SEQ ID NO: 22) 로부터의 Hex 2, 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 젠뱅크 AAB03808.1 (SEQ ID NO: 23) 로부터의 Chb, 스트렙토마이세스 플리카투스 (Streptomyces plicatus), 젠뱅크 AAC38798.3 (SEQ ID NO: 24) 으로부터의 SpHex. 정렬의 공통 서열도 표시된다 (SEQ ID NO: 25).
실시예:
물질
배지 성분 및 화학 물질은 Sigma Aldrich/Fluka (Austria/Germany), Roth (Karlsruhe, Germany) 또는 Merck (Vienna, Austria) 로부터의 시약 등급이었다. HisTrap FF 5 mL 컬럼은 GE Healthcare (Vienna, Austria) 의 제품이었다. Minisart® NML 시린지 막 필터 (0.45 ㎛) 및 Vivaspin® Turbo 15 원심 농축기 (30 kDa, 50 kDa) 는 Sartorius (Goettingen, Germany) 의 제품이었다. GlcNAc, 2-히드록시벤즈이미다졸 (순도 97 %), 디메틸 술폰 (순도 99.96 %) 및 숙시노니트릴은 Sigma Aldrich (Austria/Germany) 의 제품이었다. 4-니트로페닐 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (GlcNAc-β-pNP), 4-니트로페닐 2-아세트아미도-2-데옥시-3-O-(β-D-갈락토피라노실)-β-D-글루코피라노시드 (LNB-β-pNP), 락토-N-트리오스 II (LNT II), 락토-N-테트라오스 (LNT, 순도 ≥ 90 %), 락토-N-비오스 (LNB) 및 α-D-갈락토오스-1-포스페이트 이칼륨염 수화물 (Gal 1-P) 은 Carbosynth (Compton, Berkshire, UK) 의 제품이었다. Chromabond Flash FM 70/10C C18 ac 흡착제는 Macherey Nagel (Schoonebeek, Netherlands) 의 제품이었다. 아세토니트릴 (HPLC 구배 등급) 은 Chem-Lab NV (Zedelgem, Belgium) 의 제품이었다.
실시예 1: 효소 제조
효소의 생산 (신호 펩티드 및 막관통 영역/막 앵커 없음) 및 이들의 정제는 문헌으로부터의 프로토콜에 따라서 수행하였다.5, 6, 29 간략히, 이. 콜리 (E. coli) 발현에 대해 코돈-최적화된 합성 BbhI 유전자 (비. 비피둠 (B. bifidum) JCM1254 (젠뱅크: AB504521.1, aa 33-1599)5 및 D746E, D746A, D746Q, Y827F 변이체로부터의 야생형 N-아세틸헥소사미니다아제) 및 합성 LnbB 유전자 (비. 비피둠 (B. bifidum) JCM1254 (젠뱅크: EU281545.1, aa 35-1064)6 및 D320E, D320A, Y419F 변이체로부터의 야생형 락토-N-비오시다아제) 를 각각 NdeI-XhoI-cut pET21b(+) 및 pET24b(+) 플라스미드에 결찰시켰다 (BioCat GmbH, Heidelberg, Germany). 전체 길이 효소의 잔기 번호 부여가 사용된다. 모든 삽입은 DNA 서열화에 의해서 확인하였다. BbhI 효소는 115 mg L-1 암피실린이 보충된 LB-배지를 사용하여, 0.5 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 로 유도함으로써, 25 ℃ 에서 20 h 동안 이. 콜리 (E. coli) BL21(DE3) 에서 발현시켰다. LnbB 효소는 50 ㎍ mL-1 카나마이신, 25 mM Na2HPO4, 25 mM K2HPO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 0.5 % 글리세롤, 0.05 % 글루코오스 및 0.2 % 락토오스를 갖는 LB 배지에서 110 rpm 및 30 ℃ 에서 20 h 동안 자가-유도 프로토콜33 에 따라 이. 콜리 (E. coli) BL21(DE3) 에서 발현시켰다.34 각 효소는 C-말단 His6-tag 융합 단백질 (SEQ ID NO: 12 내지 20) 로서 생산하였다. 효소 정제는 단일-단계 His6-tag 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 사용된 효소 제제는 SDS PAGE 에서 단일 단백질 밴드로서의 이동 기준에 의해 (거의) 순수하였다.
실시예 2: His 6 -tag 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제
단백질 정제를 위해, 1 L 세포 배양으로부터의 세포 펠렛을 25 - 30 mL 결합 완충액 (20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 15 mM 이미다졸, pH 7.4) 에 재현탁시키고, -20 ℃ 에서 밤새 동결시켰다. 세포 파괴를 위해 1.27 cm 프로브가 장착된 Sonic Dismembrator (Ultrasonic Processor FB-505; Fisher Scientific, Austria) 를 사용하여, 35 mL 분취량의 해동된 세포 현탁액을 60 % 진폭으로 6 min 동안 얼음 중탕에서 초음파 처리하였다 (2 s 펄스 온 및 4 s 펄스 오프). 세포 용해물을 4 ℃ 및 21,130 g 에서 1 h 동안 원심 분리하고 (Eppendorf centrifuge 5424R), 0.45 ㎛ 셀룰로오스-아세테이트 시린지 필터를 통해 여과하였다. 표적 단백질을 4 ℃ 에서 AktaPrime plus system (GE Healthcare, Germany) 을 사용하여, 이들의 C-말단 His6-tag 를 통해 세포 비함유 추출물로부터 정제하였다. 정제된 세포 용해물을 2 mL min-1 의 유속으로 HisTrap FF 5 mL 컬럼 (GE Healthcare, Austria) 상에 공급하였다. 컬럼은 결합 완충액으로 평형화시켰다. 15 컬럼 부피 (CV) 의 세정 단계 후, 효소를 4 mL min-1 의 유속으로 6 CV 내에서 300 mM 이미다졸로 용출시켰다. 표적 단백질 함유 분획을 수집하였다. 용출된 효소를 농축시키고, 완충액을 Vivaspin® Turbo 15 원심 농축기 (30 kDa 또는 50 kDa, 3645 g, 4 ℃) 를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.4 로 교환하였다. SDS PAGE 를 사용하여 효소 제제의 순도를 확인하였다. 단백질 농도는 DeNovix SA-11+ 분광 광도계 (DeNovix Inc, US) 로 280 nm 에서 측정하였다. 전형적으로 배양 배지 1 리터 당 ~40 mg 의 BbhI 및 ~120 mg 의 LnbB 효소를 수득하였다. 정제된 효소를 분취하고, -70 ℃ 에서 저장하였다.
실시예 3: 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-윰 클로라이드 (CDMBI) 의 제조
CDMBI 는 하기의 수정을 사용하여 상기에서 기술한 바와 같이 제조하였다8. CDMBI 는 2 단계의 화학적 합성에 의해 제조하였다. 1,3-디메틸벤즈이미다졸론 (DMBI) 의 제조를 위해, KOH 의 존재하에서 MeI 의 작용에 의해 2-히드록시벤즈이미다졸의 N-원자를 메틸화시켰다. DMBI 수율은 이전에 문헌에 기재된 NaOH 대신 KOH 를 사용하여, 70 % 에서 92 % 로 증가할 수 있다.8 염기로서 NaOH 를 사용한 참고 실험은 75 % 의 DMBI 를 생성하였다.
단계 1: 1,3-디메틸벤즈이미다졸론 (DMBI) 의 제조. 50 g 2-히드록시벤즈이미다졸 (1 equiv., 97 % 순도) 과 216.55 g 톨루엔 (6.5 equiv.) 의 혼합물에, 5.83 g Bu4NBr (0.05 equiv.) 및 202.86 g KOH (40 % w/w, 4 equiv.) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60 ℃ 로 가열하고, 118.04 g MeI (2.3 equiv.) 를 고속 교반하면서 60 min 내에 적하하였다. 혼합물을 60 ℃ 에서 4 일 동안 교반하였다. 반응 시간은 임의의 수율 변화없이, 21 h 로 감소될 수 있음에 주목한다. 혼합물을 45 ℃ 로 냉각시킨 후, 상을 분리하였다. 유기 층을 45 ℃ 에서 75 mL 1 N HCl 로 3 회, 75 mL 포화 NaHCO3 로 1 회 세정하고, Na2SO4 로 건조시켰다. 상 분리 후, 용매를 50 ℃ 및 150 - 5 mbar 에서 제거하였다. 58.5 g 의 미정제 DMBI 를 수득하였다. 잔류물을 다음과 같이 재결정화시켰다: 미정제 DMBI 를 65 ℃ 에서 90 g 아세톤/n-헵탄 (3:1 v/v) 에 용해시켰다. 혼합물을 16 h 동안 실온으로 냉각시키고, 이어서 5 ℃ 로 냉각시키고, 추가로 3 h 동안 교반하였다. 여과 후, 결정질 DMBI 를 40 mL 빙냉 n-헵탄/아세톤 (3:1 v/v) 으로 1 회 세정하고, 질소하에서 건조시켜, 53.7 g 의 DMBI 를 백색 고체 (92 %) 로서 수득하였다. 1H-NMR (700 MHz, CDCl3): δ = 7.10 (m, 2H), 6.97 (m, 2H), 3.42 (s, 6H). 13C-NMR (175 MHz, CDCl3): δ = 27.14, 107.29, 121.17, 129.99, 154.63.
옥살릴 클로라이드를 사용하여 54 % 의 수율로 DMBI 를 CDMBI 로 전환시켰다. 문헌과 비교할 때, 추가의 1.1 equiv. 의 총 옥살릴 클로라이드를 사용하고, 반응 온도를 80 ℃ 에서 70 ℃ 로 낮추고, 반응 시간을 연장하였다.
단계 2: 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-윰 클로라이드 (CDMBI) 의 제조. 271 g 톨루엔 (13.9 equiv.) 중의 34.4 g DMBI (1 equiv.) 의 용액에, 80 g 옥살릴 클로라이드 (3 equiv.) 를 40 ℃ 에서 첨가하였다. 혼합물을 70 ℃ 로 가열하였다. 70 ℃ 에서 5 일 후, 침전물이 형성되지 않았다. 이어서, 40 g 의 옥살릴 클로라이드 (1.5 equiv.) 를 첨가하고, 혼합물을 70 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 3 h 내에 0 - 5 ℃ 로 냉각시키고, 이 온도에서 추가로 3 h 동안 교반하였다. 여과 후, 필터 케이크를 70 mL 의 빙냉 톨루엔으로 세정하고, 진공하에서 건조시켜, 24.8 g 의 CDMBI (54 %) 를 수득하였다. 1H-NMR (500 MHz, D2O): δ = 7.85 (m, 2H), 7.72 (m, 2H), 4.08 (s, 3H). 13C-NMR (125 MHz, D2O): δ = 35.28, 115.51, 130.08, 134.22, 143.45. 문헌에 보고된 프로토콜과 비교하여 (49 % 수율),8 추가로 1.1 equiv. 의 총 옥살릴 클로라이드를 사용하고, 반응 온도를 80 ℃ 에서 70 ℃ 로 낮추고, 반응 시간을 연장하였다.
이어서, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 또는 락토-N-비오스 (LNB) 로부터 옥사졸린 형성을 위해, CDMBI 및 Na3PO4 를 사용하였다.8
전반적으로, CDMBI 합성이 유의하게 개선되었다. 2 단계에 걸친 CDMBI 수율은 상기에서 기술한 수정에 의해 34 % 에서 50 % 로 증가할 수 있다.8
실시예 4: 락토-N-비오스 (LNB) 의 제조
LNB 는 이전에 Kitaoka 와 동료들에 의해 기술된 비피도박테리움 론굼 (Bifidobacterium longum) JCM 1217 로부터의 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (LNBP) 에 의해 Gal 1-P 및 GlcNAc 로부터 합성하였다.9, 10 LNBP 생산. LNBP 의 생산 및 정제는 문헌으로부터의 프로토콜에 따라서 수행하였다.9 간략히, 이. 콜리 (E. coli) 발현에 대해 코돈-최적화되지 않은 합성 LNBP 유전자 (젠뱅크: AB181926.1, aa 20-2275) 를 NdeI-XhoI-cut pET30a(+) 플라스미드에 결찰시켰다 (GenScript, Piscataway, USA). 삽입은 DNA 서열화에 의해서 확인하였다. LNBP 는 50 mg L-1 카나마이신이 보충된 LB-배지를 사용하여, 0.5 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 로 유도함으로써, 30 ℃ 에서 20 h 동안 이. 콜리 (E. coli) BL21(DE3) 에서 발현시켰다. LNBP 는 C-말단 His6-tag 융합 단백질로서 생산하였다. 효소 정제는 단일-단계 His6-tag 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다 (상기 참조). 하기의 완충액을 사용하였다: 결합 완충액 (20 mM MOPS, 500 mM NaCl, 15 mM 이미다졸, pH 7.4), 용출 완충액 (20 mM MOPS, 500 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, pH 7.4), 저장 완충액 (20 mM MOPS, 150 mM NaCl, pH 7.5). 전형적으로 배양 배지 1 리터 당 ~50 mg 의 LNBP 를 수득하였다. 사용된 효소 제제는 SDS PAGE 에서 단일 단백질 밴드로서의 이동 기준에 의해 (거의) 순수하였다.
LNB 의 효소적 합성. 물에 용해된 5.4 mmol Gal 1-P (1.82 g) 및 1.8 mmol GlcNAc (0.40 g) 를 사용하여 40 mL 의 총 부피로 반응을 수행하였다. 4 M HCl 을 사용하여 pH 를 6.8 로 조정하고, 0.05 mg mL-1 (0.6 μM) LNBP 를 첨가하여 반응을 시작하였다. 37 ℃ 에서 자기 교반 (교반 막대: 18 x 5 mm; 500 rpm) 하에 50 mL Sarstedt 튜브 (직경 2.8 cm, 높이 11.5 cm) 에서 전환을 수행하였다. 온도 조절을 위해, Sarstedt 튜브를 물 중탕에 넣었다. pH 를 지속적으로 모니터링하고, 4 M HCl 을 첨가하여 수동으로 제어하였다 (최초 1.5 h 이내). 배양은 3.5 h 동안이었다. 특정한 시간에 샘플을 채취하고, HPLC 로 분석하였다. 반응 수율은 92 % (42 mM, 16 g L-1) 였다.
다운스트림 처리 (DSP). DSP 의 주요 임무는 LNB (42 mM) 로부터 Gal 1-P (93 mM) 의 제거였다. 소량의 GlcNAc (3 mM) 만이 존재하였다. Gal 1-P 는 한외-여과 (비바스핀 농축기 30 kDa, 4000 rpm, 20 ℃) 에 의한 효소-제거 후에, 음이온-교환 크로마토그래피 (AEC) 에 의해 혼합물로부터 제거하였다. AEC 는 pH 7.5 에서 수행하였다. 음이온-교환 컬럼에 결합함으로써 Gal 1-P 를 효율적으로 제거할 수 있도록 하기 위해서, 여과액을 초순수에 의해 ~3.6 mS cm-1 의 이온 강도로 8-배 희석시켰다. LNB 및 나머지 GlcNAc 는 pH 7.5 에서 이온화되지 않으며, 플로우-스루에서 용출된다. AEC 는 AktaPrime plus system (GE Healthcare, Germany) 상에서 실온에서 수행하였다. 약 15 mL 의 Toyopearl SuperQ-650M 을 함유하는 자가-충전된 Proteus 20 mL FliQ 컬럼 (100 x 16.0 mm, Generon, UK) 을 적용하였다. 초순수 (이동상 A) 및 초순수 중의 1 M 염화 칼륨 (이동 상 B) 을 각각 결합 및 용출을 위해 사용하였다. 컬럼을 4 mL min-1 (5 CV) 에서 이동상 A 로 평형화시켰다. 40 mL 샘플을 이동상 A 를 사용하여 2 mL min-1 의 유속으로 공급하였다. LNB 는 5 CV 내에서 GlcNAc 와 함께 용출시켰다. Gal 1-P 는 4 mL min-1 (5 CV) 에서 이동상 B 로 용출시켰다. 검출은 전도도에 의해 이루어졌다. LNB 로부터 Gal 1-P 의 완전한 제거는 TLC 분석에 의해 확인하였다. LNB 함유 분획을 수집하였다. 샘플을 40 ℃ 에서 감압하에 농축시키고, 회전 운동하에 액체 질소 중에서 동결시킨 후, 밤새 동결 건조시켰다 (Christ Alpha 1-4, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany). 최종 생성물 (80 % 단리된 수율) 을 HPLC 로 분석하고, 이의 화학적 상동성을 1H NMR 에 의해 확인하였다. 최종 생성물에서 5 % (w/w) 의 GlcNAc 가 검출되었다.
실시예 5: 당 옥사졸린의 제조
GlcNAc- 및 LNB-옥사졸린은 상기에서 기술한 바와 같이 제조하였다.8 간략히, CDMBI (3 equiv.) 는 탈수 축합제로서, 그리고 Na3PO4 (7.5 equiv.) 는 GlcNAc (1 equiv.) 또는 LNB (1 equiv.) 로부터 옥사졸린 형성을 위한 베이스로서 사용하였다. N-아세틸-2-아미노 당을 첨가하고, 생성된 용액을 0 - 3 ℃ 로 냉각시켰다. CDMBI (3 equiv.) 를 15 min 이내에 소량씩 용액에 첨가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 1 h 동안 교반하였다.
GlcNAc 는 저렴한 비용으로 용이하게 입수 가능하다. 핵심 효소로서 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) 으로부터의 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (LNBP) 와의 1-포트 4-효소 반응을 사용하는, 수크로오스 및 GlcNAc 로부터 대량의 LNB 의 실용적인 제조는 Kitaoka 와 동료들에 의해 보고되었다.9, 10 유사하게, LNB 는 LNBP 에 의해 Gal1P 및 GlcNAc 로부터 합성하였다. 음이온-교환 크로마토그래피 (AEC) 및 동결 건조는 예비 다운스트림 처리 (DSP) 에 사용하였다 (80 % 단리된 수율, 순도 ≥ 90 %). 당 옥사졸린의 초기 다운스트림 처리 (DSP) 는 여과 (Chromabond Flash FM 70/10C C18 ac 흡착제 (사용된 N-아세틸-2-아미노 당 1 g 당 10 g)) 및 동결-건조 (동결 건조된 미정제 생성물) 를 포함하였다. 생성물 실체는 1H NMR 분광법에 의해 명확하게 확인되었다. NMR 스펙트럼은 공개된 데이터와 일치하였다.8 당 옥사졸린의 함량은 디메틸 술폰 또는 숙시노니트릴을 내부 표준으로 하는 정량적 1H NMR 분광법에 의해 결정하였다. DMBI 는 검출되지 않았지만, 과량의 염이 동결 건조된 미정제 생성물에 잔류하였다. GlcNAc-옥사졸린은 ~60 % 의 수율로 30 mmol 규모로 수득하였다. LNB-옥사졸린을 0.5 mmol 규모로 79 % 의 수율로 수득하였다.
다음 단계에서 당 옥사졸린으로부터 효율적인 트랜스-글리코실화를 보장하기 위해서, 동결 건조된 미정제 생성물을 탈염화시켰다. 탈염화는 확장 가능한 아세토니트릴로의 추출에 의해 확립되었다 (동결 건조된 미정제 생성물 1 g 당 9.5 g, 실온에서 1h 교반). 여과, 세정 (아세토니트릴 (동결 건조된 미정제 생성물1 g 당 3 g) 로 2 회), 농축 및 진공하에서의 건조 후, GlcNAc-옥사졸린을 ~60 % 의 수율로 3.5 mmol 규모로 수득하였다. LNB-옥사졸린은 < 10 % 의 수율로 0.082 mmol 규모로 수득하였다. 수율은 옥사졸린 고리의 완전한 가수분해 후에, 분리된 N-아세틸-2-아미노 당 (GlcNAc, LNB) 의 HPLC 분석에 의해 결정하였다.
실시예 6: BbhI 및 LnbB 활성 분석
BbhI 및 LnbB 활성은 50 mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.5 (옥사졸린 공여체 기질 사용) 또는 pH 5.8 (pNP-표지된 공여체 기질 사용) 을 사용하여, 각각 600 μL 및 400 μL 의 총 부피에서 분석하였다. 당 옥사졸린 공여체 기질과의 반응 혼합물은 60 mM GlcNAc-옥사졸린 또는 12 mM LNB-옥사졸린, 600 mM 락토오스 및 0.23 - 18 μM 효소를 함유하였다. pNP-표지된 공여체 기질과의 반응 혼합물은 20 mM GlcNAc-β-pNP 또는 LNB-β-pNP, 15 - 20 % DMSO, 400 - 600 mM 락토오스 및 0.12 - 24 μM 효소를 함유하였다. 효소적 전환은 Thermomixer comfort (Eppendorf, Germany) 를 사용하여, 37 ℃ 또는 55 ℃ (본문에 나타낸 바와 같음; 표 1 참조) 및 650 rpm 의 교반 속도에서 수행하였다.
99 ℃ 에서 10 min 동안 가열함으로써 특정한 시간에 반응을 중단시켰다. 침전된 단백질을 13,200 rpm 에서 10 min 동안 원심 분리에 의해 제거하였다. 샘플을 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피 (HILIC-HPLC) 및 박층 크로마토그래피 (TLC) 에 의해 분석하였다.
비활성은 각각 400 - 600 mM 의 락토오스 ('합성 조건') 에서 수득한 생성물 형성 (트랜스-글리코실화) 및 생성물 가수분해 (2 차 가수분해) 의 초기 속도로부터 계산하였다. 트랜스-글리코실화 활성의 1 단위 (1 U) 는 상기에서 기술한 조건하에서 분 당 1 μmol 의 N-아세틸-2-아미노 당 (BbhI: GlcNAc; LnbB: LNB) 을 락토오스로 전달할 수 있는 효소의 양으로서 정의하였다. 2 차 가수분해 활성의 1 단위 (1 U) 는 상기에서 기술한 조건하에서 형성된 생성물로부터 분 당 1 μmol 의 N-아세틸-2-아미노 당 (BbhI: GlcNAc; LnbB: LNB) 을 방출할 수 있는 효소의 양으로서 정의하였다. RTH 분석을 위해, 총 (생산적인 및 비-생산적인) GlcNAc-β-pNP 또는 LNB-β-pNP 가수분해 (방출된 pNP 기준) 및 트랜스-글리코실화에 대한 비활성은 400 - 600 의 락토오스에서 수득한 초기 속도 데이터로부터 계산하였다. 차이는 비-생산적인 공여체 기질 가수분해 (1 차 가수분해) 에 대한 비활성을 제공하였다. 옥사졸린 기질의 경우, 총 공여체 가수분해는 Glu 로 대체된 이들의 촉매적 Asp 를 갖는 BbhI 및 LnbB 의 변이체에 대한 N-아세틸-2-아미노 당 (BbhI: GlcNAc; LnbB: LNB) 의 방출의 초기 속도 데이터를 기준으로 해서만 계산될 수 있다. 모든 다른 경우에 있어서, RTH 값은 최대 LNT II 또는 LNT 수율에서의 엔드포인트 측정을 기준으로 하여 추정하였다.
실시예 7: LNT II 의 제조-규모 합성
LNT II 의 대량 합성을 가능하게 하기 위해서, BbhI 의 D746E 글리코시다아제 돌연변이에 의한 GlcNAc-옥사졸린으로부터의 이의 합성은 적용된 공여체-대-수용체 비율과 관련해서 최적화되어야 했다. 증가하는 농도의 GlcNac-옥사졸린 (130 - 600 mM) 을 600 mM 의 일정한 락토오스 농도로 적용하였으며, 37 ℃ 에서 전환을 비교하였다 (도 11a, 도 12). 공여체-대-수용체 비율의 1 로의 조정은 최종 수율 (85 - 90 %) 에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 도 11a 는 최적화된 조건하에서 단지 3.6 mL 의 배치 부피에서 ∼1 g 의 LNT II 의 합성을 보여준다. 초기 LNT II 생산 속도는 2190 g L-1 h-1 였다. LNT II 는 30 min 의 반응 내에 우수한 수율 (85 %) 및 농도 (281 g L-1, 515 mM) 로 수득하였다. 생체내 변화 전체의 STY 는 562 g L-1 h-1 였다. 질량-기준 턴오버 수 (첨가된 효소 g 당 생성물 g; TTNmass) 는 388 의 값에 도달하였다. 적용된 반응 조건하에서 한계 생성물 가수분해 만이 관찰되었다. 2 차 가수분해에 대한 트랜스-글리코실화의 비율은 ~1800 의 값에 도달하였다. 정확히 동일한 조건하에서 D746E 변이체 및 야생형 효소를 분석했을 때 (상기에서 기술한 대량 합성과 비교하여 효소 농도의 1/10 을 사용), 새로운 글리코시다아제의 이점, 즉, 2 차 가수분해 없음과 LNT II 수율의 2 배 증가가 분명히 관찰된다 (도 11b). 2 가지 효소의 초기 LNT II 생산 속도는 비슷했지만, 야생형에 의한 전환은 5 분 후에 이미 급격히 느려졌으며, 이것은 돌연변이에 의해 ~0.5 h 에 걸쳐 일정하게 유지되었다. 각 기질의 600 mM 은 반응에서 사용된 농도 상한선이었으며, 이는 이들의 완전한 용해를 가능하게 하였다는 것에 주목한다. LNT II 는 생성물의 임의의 검출 가능한 가수분해없이, 80 % 수율로 수득되었다 (도 13a). 이들 조건하에서, 야생형은 ~50 % 의 LNT II 를 생성하였으며, 또한 ~40 의 개선된 트랜스-글리코실화 대 2 차 가수분해 비율을 보어주었다 (도 13b).
LNT II 의 DSP 의 경우, 생성물 농도의 추가의 증가가 검출되지 않을 때, 가열에 의해 반응을 중단하였다. 샘플은 단지 85 mM 의 GlcNAc 및 락토오스, 이어서 515 mM 의 LNT II 를 함유하였다. 그러므로, 효소 제거를 위한 원심 분리 및 물 제거를 위한 동결-건조를 포함하는 간단한 DSP 는 LNT II 를 ~80 % 의 순도로 단리하는데 충분하였다 (최종 생성물의 LNT II 함량 기준, 도 11c,d). 주요 잔류 불순물은 5 % (w/w) GlcNAc 및 10 % (w/w) 락토오스였다. 더 높은 생성물 순도가 요구되는 경우, LNT II 로부터 GlcNAc 및 락토오스의 제거를 위해 나노여과가 사용될 수 있다.35, 36 약 1 g 의 LNT II 가 ≥ 85 % 수율로 백색 분말로서 수득되었다. 따라서, LNT II 는 GlcNAc-옥사졸린으로부터 73 % 의 총 수율로 제조되었다. 생성물 상동성은 1H 및 13C NMR 분광법에 의해 명확하게 확인되었다 (도 14 및 15). NMR 스펙트럼은 공개된 데이터와 일치하였다.5 LNT II 는 검출된 유일한 위치 이성질체였다 (도 15). 단리된 LNT II (도 15) 및 상용 표준의 NMR 스펙트럼 (13C, HSQC) 의 오버레이는 82 ppm 에서 신호의 정확한 일치를 보여주었으며, 이는 락토오스의 β-갈락토실 잔기의 C-3 위치에 연결된 β-GlcNAc 에 대한 특징이었다.
효소적 전환은 동몰량의 GlcNAc-옥사졸린 및 락토오스 (600 mM) 를 사용하여, 3.6 mL 의 총 부피로 pH 7.5 및 37 ℃ 에서 수행하였다. 0.73 mg mL-1 (4 μM) 의 BbhI D746E 변이체를 첨가하여 반응을 시작하였다. 자기 교반 (교반 막대: 18 x 5 mm; 250 rpm) 하에 50 mL Sarstedt 튜브 (직경 2.8 cm, 높이 11.5 cm) 에서 전환을 수행하였다. 온도 조절을 위해, Sarstedt 튜브를 물 중탕에 넣었다. 특정한 시간에 샘플을 채취하고, HPLC 로 분석하였다.
LNT II 의 다운스트림 처리 (DSP) 의 경우, 99 ℃ 에서 15 min 동안 가열함으로써 45 min 반응 시간 후에 효소를 침전시켰다. 침전된 단백질을 13,200 rpm 에서 15 min 동안 원심 분리에 의해 제거하였다. 샘플을 -70 ℃ 에서 동결시키고, 밤새 동결-건조시켰다 (Christ Alpha 1-4, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany). 최종 생성물을 HPLC 로 분석하고, 이의 화학적 상동성을 NMR 에 의해 확인하였다.
실시예 8: GlcNAc-옥사졸린의 유가식 첨가에 의한 LNT II 의 합성
1.8 mmol GlcNAc-옥사졸린을 1.3 mL 빙냉수에 용해시키고, 2.3 mL 의 포스페이트 완충액 pH 7.5 중의 2.1 mmol 의 락토오스 및 0.3 mg (0.4 μM) 의 BbhI D746E 를 함유하는 반응 용액에 65 min 의 기간에 걸쳐 연속적으로 첨가하였다. 자기 교반하에 37 ℃ 에서 효소적 전환을 수행하였다. 온도 조절을 위해, 반응 튜브를 물 중탕에 넣었다. 특정한 시간에 샘플을 채취하고, HPLC 로 분석하였다. 생성물의 형성이 입증되었다. 효소의 열 탈활성화에 의해 4 h 후에 반응을 종료하였다.
분석
Luna® NH2 컬럼 (3 ㎛, 100 Å, 250 x 4.6 mm; Phenomenex, Germany) 을 사용하는 HILIC-HPLC 에 의해 LNT II, LNT, GlcNAc, LNB, pNP 및 락토오스를 분석하였다. HPLC 분석은 30 ℃ 에서 75 % 아세토니트릴 및 25 % 물의 이동상을 사용하여, 1 mL min-1 의 등용매 유속으로 수행하였다. 195 nm 에서의 UV-검출은 LNT II, LNT, GlcNAc, LNB 및 pNP 의 정량화에 사용하였다. LNT II 의 제조 합성을 위해, 락토오스를 굴절률 (RI) 검출로 모니터링하였다.
TLC 는 실리카 겔 60 F254 알루미늄 시이트 (Merck, Germany) 상에서 수행하였다. 플레이트를 1-부탄올 - 아세트산 - 물 (2/1/1 부피) 의 용매계에서 현상시켰다. TLC 플레이트를 UV 광 (254 nm) 하에서 분석하였다. 이어서, 티몰-황산 시약을 분무한 후에, 플레이트를 가열함으로써 탄수화물을 시각화하였다.
LNT II, LNT, GlcNAc, LNB, pNP 및 락토오스는 정품 표준으로서 사용하였다.
Varian (Agilent) INOVA 500-MHz NMR 분광계 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) 및 VNMRJ 2.2D 소프트웨어는 모든 NMR 측정에 사용하였다. 디메틸 술폰 및 숙시노니트릴은 정량적 1H NMR 측정을 위한 내부 표준으로서 사용하였다. 19.08 mg 의 GlcNAc-옥사졸린 (동결 건조된 미정제 생성물) 및 11.28 mg 의 디메틸 술폰을 D2O 에 용해시켰다. 11.41 mg 의 LNB-옥사졸린 (동결 건조된 미정제 생성물) 및 12.85 mg 의 숙시노니트릴을 D2O 에 용해시켰다. ~200 mg 의 단리된 LNT II 를 600 μL D2O 에 용해시켰다. 상업용 LNT II 표준 (Carbosynth; 65 mM) 을 D2O - H2O (11.5:1 v/v) 에 용해시켰다. 1H NMR 스펙트럼 (499.98 MHz) 은 5 mm 간접 검출 PFG-프로브 상에서 측정하였으며, z-구배를 갖는 5 mm 이중 직접 검출 프로브는 13C NMR 스펙트럼 (125.71 MHz) 에 사용하였다. 표준 사전-포화 서열을 사용하였다: 완화 지연 2 s; 90° 프로톤 펄스; 2.048 s 획득 시간; 스펙트럼 폭 8 kHz; 포인트 수 32 k. 13C NMR 스펙트럼은 하기의 펄스 서열로 기록하였다: 45° 탄소 펄스, 완화 지연 2 s, 획득 동안의 Waltz 탈커플링, 2 s 획득 시간을 갖는 표준 13C 펄스 서열. HSQC 스펙트럼은 증분 당 128 스캔 및 단열 탄소 180° 펄스로 측정하였다. Mnova 9.0 은 스펙트럼의 평가에 사용하였다.
참고문헌:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Enzymatic hexosaminidation of lactose <130> 181557 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1627 <212> PRT <213> Bifidobacterium bifidum <400> 1 Met Arg Leu Arg Arg Val Lys Ala Ala Ile Gly Ser Val Leu Ala Ala 1 5 10 15 Val Thr Leu Leu Ser Met Ser Leu Thr Gly Val Thr Ala Ala Gln Ala 20 25 30 Ser Asp Asp Asn Leu Ala Leu Asn Gln Thr Val Thr Ala Ser Ser Tyr 35 40 45 Glu Val Ala Thr Thr Ala Pro Glu Lys Ala Val Asp Gly Asp Leu Gly 50 55 60 Thr Arg Trp Gly Thr Ala Gln Asn Lys Ala Ala Asn Glu Trp Ile Glu 65 70 75 80 Val Gly Leu Gly Gly Thr Lys Thr Val Lys Gln Ile Asn Ile Asp Phe 85 90 95 Glu Arg Lys Asp Ala Asp Gln Asn Ile Thr Ser Phe Lys Val Glu Leu 100 105 110 Lys Gln Gly Asp Thr Tyr Thr Lys Val Tyr Gln Lys Asp Thr Arg Ala 115 120 125 Lys Gln Gln Glu Ile Ile Leu Leu Asp Gln Ala Gln Gln Ala Ser Ala 130 135 140 Val Lys Val Thr Val Leu Ser Ala Asp Gly Gly Thr Met Asn Trp Val 145 150 155 160 Asn Val Gly Ile Asn Glu Ile Ser Val Tyr Ser Ala Pro Lys Glu Thr 165 170 175 Val Leu Asp Thr Ala Asp Thr Asn His Met Leu Gly Ala Thr Met Thr 180 185 190 Ala Ser Ser Asn Glu Thr Ala Thr Leu Thr Pro Asp Lys Ala Ile Asp 195 200 205 Gln Asn Arg Thr Gly Arg Asn Asn Arg Trp Ala Ser Gly Tyr Glu Thr 210 215 220 Pro Ser Asn Ile Trp Leu Lys Ala Glu Phe Pro Arg Leu Thr Ala Val 225 230 235 240 Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Phe Phe Glu Arg Asp Val Asn Pro Lys Pro 245 250 255 Thr Asn Val Gln Ser Phe Asp Leu Ser Tyr Thr Asp Ser Glu Gly Thr 260 265 270 Glu His Thr Leu Lys Ser Gly Tyr Ala Met Thr Ala Ser Gly Ala Gly 275 280 285 Tyr Val Ala Asp Val Val Ile Gln Leu Asp Gln Ala Val Asn Ala Arg 290 295 300 Ser Leu Lys Leu Ser Asn Phe Ala Ile Lys Ser Ser Glu Tyr Asn Asn 305 310 315 320 Val Ser Val Ala Glu Trp Glu Ala Tyr Ser Asn Asp Gln Ala Glu Pro 325 330 335 Gly Ala Thr Leu Asp Ser Val Val Ser Asp Leu Glu Ser Asn His Leu 340 345 350 Thr Ile Glu Thr Asp Thr Asp Thr Leu Ala Leu Pro Thr Val Pro Asp 355 360 365 Gly Tyr Thr Val Lys Phe Asn Gly Ala Asp Tyr Glu Gln Leu Ile Ala 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1000 1005 Leu Thr Phe Asp Val Thr Leu Gln Gln Ala Ala Lys Pro Gly Asp 1010 1015 1020 Ile Leu Phe Glu Ala Asp Ala Pro Tyr Gly Thr His Asp Ile Arg 1025 1030 1035 Val Met Glu Asn Gly Lys Leu Gly Phe Thr Arg Glu Leu Tyr Asn 1040 1045 1050 Tyr Tyr Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Val Gly Lys Thr Val Thr Val 1055 1060 1065 Thr Ile Lys Val Asp Gln Gln Thr Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly 1070 1075 1080 Glu Phe Val Ser Asp Ala Thr Gly Lys Tyr Ile Asp Lys Gly Ile 1085 1090 1095 Glu Lys Lys Thr Gly Ile Thr Ala Ala Thr Phe Ala Leu Pro Leu 1100 1105 1110 Gln Arg Ile Gly Ser Lys Thr Ser Ala Ile Asn Gly Val Ile Asp 1115 1120 1125 Asn Val Ile Val Lys Lys Ser Glu Ala Glu Thr Asp Gln Tyr Asn 1130 1135 1140 Lys Ser Cys Trp Thr Gly Thr Thr Asn Ser Glu Thr Gln Tyr Asn 1145 1150 1155 Asp Thr Glu Gly Leu Leu Arg Tyr Ala Phe Asp Asn Asn Pro Ser 1160 1165 1170 Thr Ile Trp His Ser Asn Trp Lys Gly Ala Thr Asp Lys Leu Thr 1175 1180 1185 Gly Ser Asn Ser Phe Tyr Ala Glu Ile Asp Met Cys Gln Lys Tyr 1190 1195 1200 Thr Ile Asn Gln Phe Ser Phe Thr Pro Arg Thr Ser Gln Asp Ser 1205 1210 1215 Gly Gln Val Thr Lys Ala Asp Leu Tyr Val Lys Ala Asn Ala Asn 1220 1225 1230 Asp Glu Trp Lys Gln Val Ala Thr Asp Gln Val Phe Glu Ala Ser 1235 1240 1245 Arg Ala Lys Lys Thr Phe Met Phe Asp Glu Gln Glu Val Arg Tyr 1250 1255 1260 Val Lys Phe Val Ala Lys Ser Ser Asn Asp Gly Trp Val Ala Val 1265 1270 1275 Ser Glu Phe Gly Val Ala Asn Lys Pro Ser Ser Thr Val Arg Val 1280 1285 1290 Phe Val Ala Ala Asp Pro Ala Glu Gly Gly Thr Val Ser Val Ala 1295 1300 1305 Ala Glu Gly Glu Thr Gly Thr Asp Thr Ala Val Asp Val Ala Ser 1310 1315 1320 Gly Ala Ser Val Thr Ala Lys Ala Val Ala Ala Asp Gly Tyr Arg 1325 1330 1335 Phe Ser Gly Trp Phe Thr Thr Ala Ser Glu Thr Ala Val Ser Thr 1340 1345 1350 Asp Ala Thr Tyr Thr Phe Ala Ala Asp Gly Asn Thr Ala Leu Thr 1355 1360 1365 Ala Lys Phe Thr Lys Asp Ser Thr Pro Asp Pro Gly Pro Lys Pro 1370 1375 1380 Thr Ile Ser Ser Ile Ala Val Thr Lys Pro Thr Val Thr Asp Tyr 1385 1390 1395 Lys Val Gly Asp Thr Phe Asp Ala Thr Gly Leu Ala Val Thr Ala 1400 1405 1410 Thr Met Ser Asp Gly Ser Thr Lys Thr Leu Thr Ala Gly Glu Tyr 1415 1420 1425 Thr Leu Ser Ala Thr Gln Asp Gly Ala Ala Val Ala Leu Asp Lys 1430 1435 1440 Ala Phe Ala Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Thr Val Thr Ala Asn 1445 1450 1455 Gly Lys Thr Ala Thr Phe Asp Val Thr Val Thr Ala Lys Asp Pro 1460 1465 1470 Asp Pro Glu Pro Ala Thr Leu Lys Ser Ile Lys Val Thr Ser Lys 1475 1480 1485 Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Thr Val Asp Glu Thr Phe Ala Lys Thr 1490 1495 1500 Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gly Lys Thr Ala Leu 1505 1510 1515 Leu Lys Asp Gly Glu Tyr Lys Leu Ser Ala Val Asp Ala Asp Gly 1520 1525 1530 Lys Thr Val Asp Leu Thr Lys Pro Phe Thr Ala Ala Gly Asp Val 1535 1540 1545 Thr Val Thr Val Thr Ser Gly Lys Leu Thr Asp Ser Phe Thr Ile 1550 1555 1560 Thr Val Lys Ala Lys Thr Val Thr Pro Ala Pro Gly Asp Asn Lys 1565 1570 1575 Pro Gly Glu Asn Lys Pro Gly Ala Asp Lys Pro Lys Pro Asn Thr 1580 1585 1590 Pro Asp Glu Val Ala Lys Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Val Val 1595 1600 1605 Phe Ser Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Val Arg 1610 1615 1620 Lys Arg Arg Ile 1625 <210> 2 <211> 1567 <212> PRT <213> Bifidobacterium bifidum <400> 2 Ser Asp Asp Asn Leu Ala Leu Asn Gln Thr Val Thr Ala Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Glu Val Ala Thr Thr Ala Pro Glu Lys Ala Val Asp Gly Asp Leu Gly 20 25 30 Thr Arg Trp Gly Thr Ala Gln Asn Lys Ala Ala Asn Glu Trp Ile Glu 35 40 45 Val Gly Leu Gly Gly Thr Lys Thr Val Lys Gln Ile Asn Ile Asp Phe 50 55 60 Glu Arg Lys Asp Ala Asp Gln Asn Ile Thr Ser Phe Lys Val Glu Leu 65 70 75 80 Lys Gln Gly Asp Thr Tyr Thr Lys Val Tyr Gln Lys Asp Thr Arg Ala 85 90 95 Lys Gln Gln Glu Ile Ile Leu Leu Asp Gln Ala Gln Gln Ala Ser Ala 100 105 110 Val Lys Val Thr Val Leu Ser Ala Asp Gly Gly Thr Met Asn Trp Val 115 120 125 Asn Val Gly Ile Asn Glu Ile Ser Val Tyr Ser Ala Pro Lys Glu Thr 130 135 140 Val Leu Asp Thr Ala Asp Thr Asn His Met Leu Gly Ala Thr Met Thr 145 150 155 160 Ala Ser Ser Asn Glu Thr Ala Thr Leu Thr Pro Asp Lys Ala Ile Asp 165 170 175 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Ala Tyr Asp Ala Phe Arg Leu Glu Ser Ser Leu Thr Asn Asp Lys 595 600 605 Gly Glu Ser Pro Thr Ala Glu Asp Tyr Ser Ile Ser Lys Lys Thr Phe 610 615 620 Lys Gln Phe Ile Gln Asp Glu Arg Ala Leu Gly Met Asn Val Val Pro 625 630 635 640 Glu Ile Asp Val Pro Ala His Ala Asn Ser Phe Thr Lys Ile Trp Pro 645 650 655 Glu Leu Met Val Lys Gly Arg Val Ser Pro Ile Asn Ser Asn Arg Pro 660 665 670 Leu Ile Asp His Leu Asp Val Ser Lys Pro Glu Thr Ile Ala Lys Ile 675 680 685 Lys Glu Ile Phe Asp Asp Tyr Thr Lys Gly Asp Asp Pro Thr Phe Asp 690 695 700 Ser Asp Thr Thr Val His Ile Gly Ala Asp Glu Phe Leu Tyr Asn Tyr 705 710 715 720 Thr Ala Tyr Arg Lys Phe Ile Asn Glu Ile Val Pro Tyr Ile Lys Asp 725 730 735 Thr Asn Thr Val Arg Met Trp Gly Gly Leu Thr Trp Ile Asn Asp His 740 745 750 Lys Thr Glu Ile Thr Lys Asp Ala Ile Glu Asn Val Glu Met Asn Leu 755 760 765 Trp Ser Lys Asp Trp Ala Asp Gly Leu Gln Met Tyr Asn Met Gly Tyr 770 775 780 Lys Leu Ile Asn Thr Ile Asp Asp Tyr Gly Tyr Met Val Pro Asn Gly 785 790 795 800 Ser 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(215)..(216) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (233)..(233) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (247)..(247) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (287)..(287) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (299)..(299) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (317)..(318) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (337)..(337) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (346)..(346) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (350)..(350) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (368)..(368) <223> Xaa can be any 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Gln Leu Gly 85 90 95 Asp Glu Gly Tyr Thr Leu Asp Ile Gly Ala Xaa Gly Val Val Xaa Xaa 100 105 110 Gly Ser Ser Val Thr Gly Val Phe Tyr Gly Xaa Gln Thr Ile Leu Gln 115 120 125 Met Leu Lys Gln Asp Ala Asn Gly Xaa Pro Xaa Gly Thr Met Arg Asp 130 135 140 Tyr Pro Arg Phe Thr Thr Arg Gly Ala Leu Leu Asp Val Ala Arg Lys 145 150 155 160 Pro Val Ser Glu Xaa Met Arg Xaa Ile Thr Arg Met Ala Tyr Tyr Lys 165 170 175 Leu Asn Asp Phe Gln Ala His Leu Ser Asp Asn Glu Trp Leu Glu Asn 180 185 190 Tyr Gly Lys Gly Asp Asn Glu Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Tyr Thr Lys 195 200 205 Lys Xaa Phe Lys Gln Phe Xaa Xaa Asp Ala Arg Ala Leu Gly Ile Asn 210 215 220 Val Val Pro Glu Ile Asp Val Pro Xaa His Ala Asn Ser Phe Leu Lys 225 230 235 240 Ile Tyr Pro Glu Leu Met Xaa Asp Gly Arg Val Xaa Pro Pro Leu Ile 245 250 255 Asp His Leu Asp Val Ser Lys Pro Glu Thr Ile Ala Phe Ile Lys Glu 260 265 270 Ile Ile Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Phe Thr Ser Asp Lys Tyr Xaa His 275 280 285 Ile Gly Ala Asp Glu Phe Leu Tyr Asn Tyr Xaa Ala Thr Pro Asp Tyr 290 295 300 Arg Lys Phe Ile Asn Glu Ile Val Pro Tyr Val Lys Xaa Xaa Gly Val 305 310 315 320 Arg Met Val Ile Trp Gly Gly Leu Thr Trp Ile Asn Asp Glu Ile Thr 325 330 335 Xaa Asp Gly Ile Glu Asn Val Glu Met Xaa Leu Trp Ser Xaa Asp Trp 340 345 350 Ala Asp Gln Met Tyr Asn Met Gly Tyr Lys Leu Ile Asn Thr Ile Xaa 355 360 365 Asp Tyr Gly Tyr Met Val Pro Asp Gly Ser Tyr Gly Arg Ala Asn Pro 370 375 380 Xaa Gly Trp Asp Leu Leu Asn Ile Ser Arg Val Phe Asp Xaa Trp Glu 385 390 395 400 Pro Gly Gly Tyr Gln Ala Val Pro Gly Asp Asp Gln Val Leu Gly Ala 405 410 415 Ala Phe Ala Leu Trp Ser Asp Asn Ile Xaa Thr Asp Xaa Asp Leu Tyr 420 425 430 Tyr Arg Xaa Phe Pro Ala Leu Pro Phe Val Ala Glu Lys Gly Trp Ala 435 440 445 Ala Lys Pro Gly Asp Ile Leu Phe Glu Ala Ala Pro Ala Gly Thr His 450 455 460 Asp Ile Arg Tyr Phe Asp Val Ser Asp Ala Thr Gly Thr Gly Ile Thr 465 470 475 480 Ala Ala Thr Phe Ala Leu Pro Leu Gln Arg Ile Gly Ser Lys Thr Ser 485 490 495 Ala Ile Asn Gly Val Ile Asp Asn Val Ile Val Lys Lys Ser Glu Ala 500 505 510 Thr Gly Thr Thr Asn Ser Glu Thr Gln Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Leu 515 520 525 Leu Arg Tyr Ala Phe Asp Asn Asn Pro Ser Thr Ile Trp His Ser Asn 530 535 540 Tyr Lys Gly Ala Xaa Asp Lys Leu Thr Gly Ser Asn Xaa His Tyr Tyr 545 550 555 560 Thr Ile Asn Gln Phe Ser Phe Thr Pro Arg Thr Ser Gln Asp Ser Gly 565 570 575 Gln Val Thr Lys Ala Asp Leu Tyr Val Lys Ala Asn Ala Asn Asp Glu 580 585 590 Trp Lys Gln Val Ala Thr Ser Ser Asn Asp Gly Trp Val Ala Val Xaa 595 600 605 Glu Xaa Xaa Val Ala Asn Lys Pro Ser Ser Ala Lys Phe Thr Lys Asp 610 615 620 Ser Thr Pro Asp Pro Gly Pro Lys Ala Val Thr Lys Pro Glu Xaa Thr 625 630 635 640 Gly Xaa Thr Phe Xaa Ala Xaa Gly Leu Ala Val Thr Ala Thr Met Ser 645 650 655 Asp Gly Ser Thr Lys Thr Leu Thr Ala Gly Glu Ala Pro Gln Asp Pro 660 665 670 Asp Lys Thr Thr Thr Trp Ser Asp Gly Lys Thr Ala Leu Leu Lys Asp 675 680 685 Gly Glu Tyr Lys Xaa Ser Ala Val Asp Ala Asp Gly Lys Thr Val Asp 690 695 700 Leu Thr Lys Pro Phe Thr Xaa Ala Gly Asp Val Pro Gly Asp Asn Lys 705 710 715 720 Pro Gly Glu Asn Lys Pro Gly Thr Xaa Leu Glu His His His His His 725 730 735 His <210> 26 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 26 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys 1 5 10 15 Cys Cys His His His Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Arg Val His His 20 25 30 His His His Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 35 40 <210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 27 Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys His His 1 5 10 15 Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Leu Ser Ser His His His His His 20 25 30 Thr Thr Thr Thr 35

Claims (15)

  1. 하기의 단계를 포함하는 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스의 제조 방법:
    (i) 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린을 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 의해 촉매작용되는 락토오스와 반응시켜 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스를 수득하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (i) 이 50 g/L 이상의 락토오스, 바람직하게는 100 g/L 이상의 락토오스, 특히 바람직하게는 150 g/L 이상의 락토오스, 가장 바람직하게는 190 g/L 이상의 락토오스를 함유하는 수용액 중에서 수행되는 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 방법이 유기 용매를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는 조건하에서 수행되는 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린이 각각 20 분 이상, 바람직하게는 60 분 이상의 기간에 걸쳐 락토오스 및 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소에 첨가되는 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소가 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 1 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 β-N-아세틸헥소사미니다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 2 와 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 효소인 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소가 락토-N-비오시다아제, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 의 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) JCM1254 의 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 3 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 락토-N-비오시다아제 활성을 갖는 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소, 또는 SEQ ID NO: 4 와 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제 효소인 락토-N-테트라오스의 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 하기의 단계를 추가로 포함하는 제조 방법:
    (ii) 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소를 탈활성화시키는 단계.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 락토-N-트리오스 II 의 제조 방법:
    (iii) β-갈락토시다아제 또는 갈락토실 트랜스퍼라아제 및 UDP-갈락토오스를 단계 (i) 의 혼합물 또는, 바람직하게는 단계 (ii) 의 혼합물에 첨가하고, 임의로 추가의 락토오스를 첨가하여, 락토-N-테트라오스 또는 락토-N-네오테트라오스를 수득하는 단계.
  9. 락토오스로부터 락토-N-트리오스 II 또는 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한 탄수화물-활성-효소 (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org, 2018 년 11 월 20 일 업데이트됨) 의 분류에 따른 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소의 용도, 바람직하게는 락토-N-트리오스 II 를 생성하기 위한 제 5 항에서 정의한 바와 같은 효소의 용도, 또는 락토-N-테트라오스를 생성하기 위한 제 6 항에서 정의한 바와 같은 효소의 용도.
  10. 제 9 항에 있어서, 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린이 기질로서 사용되는 용도.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소가 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용되는 용도.
  12. SEQ ID NO: 1 (BbhI, 젠뱅크 수탁 번호: AB504521.1) 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 위치 746 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌 또는 글루타민을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 1 의 위치 827 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 β-N-아세틸헥소사미니다아제, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 8 중 임의의 것과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β-N-아세틸헥소사미니다아제.
  13. SEQ ID NO: 3 (LnbB, 젠뱅크 수탁 번호: EU281545.1) 과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 위치 320 으로서 카운트되는 위치에서 글루탐산 또는 알라닌을 가지며, 및/또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 419 로서 카운트되는 위치에서 페닐알라닌을 갖는 락토-N-비오시다아제, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 9 내지 11 중 임의의 것과 70 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 락토-N-비오시다아제.
  14. 제 12 항에 따른 β-N-아세틸헥소사미니다아제 및/또는 제 13 항에 따른 락토-N-비오시다아제가 사용되는, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 20 (GH20) 의 효소, 락토오스, 바람직하게는 50 g/L 이상의 락토오스, 보다 바람직하게는 100 g/L 이상의 락토오스, 특히 바람직하게는 150 g/L 이상의 락토오스, 가장 바람직하게는 190 g/L 이상의 락토오스 및
    a) 글루코사민-옥사졸린 및/또는 락토-N-비오스-옥사졸린; 및/또는
    b) 락토-N-트리오스 II 및/또는 락토-N-테트라오스
    를 포함하는 수용액.
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