CN116949004B - 一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。所述的转肽酶能够识别C端含有保守氨基酸序列LPXTG、N端含有多聚甘氨酸的蛋白质，其中X为除半胱氨酸、色氨酸以外的任意氨基酸。所述的转肽酶中位于184位的半胱氨酸攻击底物识别序列LPXTG中的苏氨酸/甘氨酸之间的肽键，使肽键发生断裂，在酶与底物之间形成酰基酶中间体，多聚甘氨酸攻击酰基酶中间体，在底物与多聚甘氨酸之间形成新的肽键。本发明的转肽酶Sortase A纯度达到95％以上，转肽酶Sortase A的浓度较高并且具有较好的转肽效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用。
背景技术
转肽酶是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的酶，是由206个氨基酸组成的多肽。转肽酶在细菌中有两种不同的功能，包括将表面蛋白锚定在细胞壁上和组装从微生物表面伸出来的长蛋白纤维。
根据大多数转肽酶同源物的原始序列，可将转肽酶分为A-F类6个不同的亚类。A类，B类和D类酶普遍存在于厚壁菌中。转肽酶A(Sortase A，SrtA)是一种膜结合的半胱氨酸转肽酶，含有His-Cys-Arg催化三联体，主要序列含有一个高度保守的TLXTC基序，该基序含有催化必需的半胱氨酸残基。
转肽酶Sortase A负责表面蛋白与革兰氏阳性菌细胞壁的共价锚定，能够催化含有Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG，X是任意氨基酸)基序的表面蛋白毒性因子共附着在革兰氏阳性菌的细胞壁上。在表面蛋白的锚定过程中，转肽酶利用两种底物，底物包括分泌蛋白。分泌蛋白的N端包含有一个分泌信号肽，C端包含有一个LPXTG结构域，N端的信号肽会指引分泌蛋白通过分泌运至细胞外。结合在细胞膜上的Sortase A会切割LPXTG基序中T和G之间的共价键，形成硫酯酶中间体，中间体将表面蛋白共价结合到肽聚糖上，表面蛋白通过转糖苷作用和转肽作用整合到细胞壁上，Sortase A通过上述的作用方式，将蛋白锚定到细菌细胞壁上。
中国专利CN201610465810.3中公开了一种应用转肽酶Sortase A修饰蛋白的方法，该发明利用可以特异性吸附转肽酶Sortase A的磁珠，将Sortase A固定到磁珠上，将其用于催化蛋白或短链连接、修饰反应。该专利利用制备的Sortase A结合磁珠的方法相比于游离酶，Sortase A结合磁珠后至少可循环利用5次，且提高了催化产率。
中国专利CN201510440032.8中公开了一种高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，该发明通过对目的蛋白载体以及发酵体系中添加剂和添加策略的优化，表明pET-22b载体是适合Sortase A胞外生产的载体，采取两个阶段添加甘氨酸可以极大的提高大肠杆菌胞外生产Sortase A的水平。
目前，现有技术中并未公开本发明中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶A的应用，本发明中为首次公开该蛋白作为转肽酶A的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶的应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶的应用。
优选地，所述的转肽酶在SEQ ID NO:1的基础上添加His标签并进行点位突变。
进一步优选地，所述的转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
具体地，所述的转肽酶为转肽酶Sortase A。
具体地，所述的标签用于纯化上述的重组蛋白。
进一步具体地，所述的纯化为组氨酸特异性的结合镍离子，带有His标签的重组蛋白可以被镍柱吸附，从而纯化重组蛋白。
具体地，所述的转肽酶Sortase A能够识别C端含有保守氨基酸序列LPXTG、N端含有多聚甘氨酸的蛋白质。
进一步具体地，所述的LPXTG中X为除半胱氨酸、色氨酸以外的任意氨基酸。
具体地，所述的转肽酶Sortase A中位于184位的半胱氨酸攻击底物识别序列LPXTG中的苏氨酸/甘氨酸之间的肽键，使肽键发生断裂，在酶与底物之间形成酰基酶中间体，多聚甘氨酸攻击酰基酶中间体，在底物与多聚甘氨酸之间形成新的肽键，完成转肽反应如图1所示。
具体地，所述的转肽酶Sortase A的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成全基因序列，将序列连接表达载体，再将其转化表达工程菌，获表达菌株；
(2)将步骤(1)中获得表达菌株接种到培养基中，加入诱导剂，离心，收集菌体；
(3)将步骤(2)中菌体经过破菌，粗酶处理后获得所述的转肽酶Sortase A。
优选地，步骤(1)中所述的全基因序列如SEQ ID NO:3所示。
具体地，步骤(1)中所述的表达载体为pET-32a。
优选地，步骤(1)中所述的工程菌为BL21(DE3)。
进一步具体地，所述的步骤(1)中所述的转化包括以下步骤：
(A)将表达质粒置于BL21感受态细胞中，混匀，冰浴。
(B)水浴42℃热激45s后，冰浴2-3min。
(C)加入培养基，在37℃，150rpm条件下，培养1h。
(D)取培养物涂布至平板中，37℃，过夜培养。
再进一步具体地，步骤(A)中所述的感受态细胞选自BL21感受态细胞、DH5α感受态细胞、JM109感受态细胞中的一种或多种。
更进一步具体地，步骤(A)中所述的感受态细胞为BL21感受态细胞。
再进一步具体地，所述的培养基选自LB培养基、TB培养基、SOB培养基中的一种或多种。
更进一步具体地，所述的培养基为LB培养基。
具体地，步骤(2)中所述的表达菌株与培养基的比例为1：30-50；
进一步具体地，步骤(2)中所述的表达菌株与培养基的比例为1：50。
具体地，步骤(2)中所述的培养的温度为35-37℃，所述的培养为振荡培养，所述的振荡培养的振荡频率为250rpm，培养至OD600＝0.8-1.0。
具体地，步骤(2)中所述的诱导剂选自异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖中的一种或多种。
进一步具体地，步骤(2)中所述的诱导剂为IPTG。
进一步具体地，所述的诱导剂IPTG的浓度为0.5-2mM；
再进一步具体地，所述的诱导剂IPTG的浓度为1mM。
具体地，步骤(2)中所述的加入诱导剂后培养的温度为20-25℃。
具体地，步骤(2)中所述的加入诱导剂后培养的时间为15-20h；
进一步具体地，步骤(2)中所述的加入诱导剂后培养的时间为16h。
具体地，步骤(2)中所述的离心的温度为4℃。
进一步具体地，步骤(2)中所述的离心的转速为5000-9000rpm，离心的时间为8-15min；
再进一步具体地，步骤(2)中所述的离心的转速为8000rpm，离心的时间为10min。
具体地，步骤(3)中破菌处理为将菌体中加入破菌缓冲液，离心，收集上清。
进一步具体地，步骤(3)中所述的菌体与破菌缓冲液的比例为1：5-20；
再进一步具体地，步骤(3)中所述的菌体与破菌缓冲液的比例为1：10。
具体地，步骤(3)中所述的破菌缓冲液包括Tris-HCl、NaCl、KCl和甘油。
进一步具体地，所述的Tris-HCl的浓度为20-50mM；
再进一步具体地，所述的Tris-HCl的浓度为50mM。
进一步具体地，所述的Tris-HCl的pH为8.0-8.5；
再进一步具体地，所述的Tris-HCl的pH为8。
进一步具体地，所述的NaCl的浓度为20-200mM；
再进一步具体地，所述的NaCl的浓度为100mM。
进一步具体地，所述的KCl的浓度为1-5mM；
再进一步具体地，所述的KCl的浓度为2.5mM。
进一步具体地，所述的甘油的体积百分浓度为5-20％(v/v)；
再进一步具体地，所述的甘油的体积百分浓度为10％(v/v)。
具体地，步骤(3)所述的离心的转速为8000-14000rpm；所述的离心的时间为20-60min；所述的离心的温度为4℃；
进一步具体地，步骤(3)所述的离心的转速为12000rpm；所述的离心的时间为40min。
进一步具体地，所述的粗酶处理包括将处理后的上清进行纯化。
再进一步具体地，所述的纯化包括但不限于过镍柱纯化。
又一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码上述的第一方面所述的蛋白的核苷酸序列。
又一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
又一方面，本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体包括上述的核酸分子。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括上述的表达载体。
优选地，本发明提供了上述的转肽酶在蛋白质修饰、蛋白质链接、蛋白质改造、蛋白质固化或蛋白质无痕纯化中的应用。
具体地，用于转肽酶A的反应缓冲液包括HEPES和CaCl2。
进一步具体地，所述的HEPES的浓度为10-50mM；
再进一步具体地，所述的HEPES的浓度为20mM。
进一步具体地，所述的CaCl2的浓度为1-10mM；
再进一步具体地，所述的CaCl2的浓度为5mM。
进一步具体地，所述的反应缓冲液的pH为7-8；
再进一步具体地，所述的反应缓冲液的pH为7.5。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次公开了SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶A的应用，所述的转肽酶能够识别C端含有保守氨基酸序列LPXTG、N端含有多聚甘氨酸的蛋白质，其中X为除半胱氨酸、色氨酸以外的任意氨基酸。所述的转肽酶中位于184位的半胱氨酸攻击底物识别序列LPXTG中的苏氨酸/甘氨酸之间的肽键，使肽键发生断裂，在酶与底物之间形成酰基酶中间体，多聚甘氨酸攻击酰基酶中间体，在底物与多聚甘氨酸之间形成新的肽键。
(2)本发明的转肽酶的Sortase A纯度达到95％以上，可应用于蛋白质修饰、蛋白质链接、蛋白质改造、蛋白质固化、蛋白质的无痕纯化等。
(3)突变后转肽酶Sortase A的浓度较高。
(4)同等条件下突变后，Sortase A转肽效果相对较好。
附图说明
图1为转肽酶A完成转肽反应的示意图。
图2为实施例1的SDS-PAGE电泳检测结果图。
图3为实施例3的SDS-PAGE电泳检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1转肽酶Sortase A的制备
转肽酶Sortase A的制备包括以下步骤：
(1)转肽酶Sortase A表达菌株及质粒的获得：以合成SEQ ID NO:3所述全基因序列，将序列连接到表达载体，然后将其转化到表达工程菌BL21(DE3)，获表达菌株；
(2)将步骤(1)中获得表达质粒进行转化，转化步骤如下；
(A)取100ng转肽酶Sortase A质粒于50μL BL21感受态细胞中，充分混匀，冰浴30min；
(B)水浴42℃热激45s后，冰浴2-3min；
(C)在超净工作台中加入500μL LB培养基，于37℃，150rpm条件下培养1h；
(D)取100μL培养物涂布至LB/Amp平板中，37℃，过夜培养。
(3)将步骤(2)的(D)中过夜培养平板中挑选单菌落接种到LB培养基中(Amp)，37℃250rpm过夜培养。
(4)将步骤(3)中获得过夜培养物按1：50的比例接种到LB培养基中(Amp)，37℃250rpm震荡培养至OD600＝1.0时，加入终浓度1mM IPTG，为提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20-25℃，低温诱导表达过夜(16h)，8000rpm 10min 4℃离心收集菌体。
(5)将步骤(4)中收集菌体按1：10的比例加入破菌缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、10％(v/v)甘油)，即每1g菌体加入10mL该破菌缓冲液，高压破碎后，12000rpm 40min 4℃离心收集上清。
(6)将步骤(5)中获得的上清进行过Ni柱纯化，如下：
①平衡：用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、10％(v/v)甘油)平衡柱子，直到pH达到8.0，电导、紫外检测读数稳定，一般为4-8个柱体积，检测调零后上样；
②上样：上柱样品应保持澄清，可用0.22um滤膜过滤样品后上样。收集流出；
③平衡：上样结束，用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mMKCl、10％(v/v)甘油)平衡层析柱，直到紫外读数回到上样前读数或基线相对平稳；
④洗脱：用不同咪唑浓度梯度洗脱蛋白，具体洗脱梯度如下；
洗脱液A：50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、25mM咪唑；
洗脱液B：50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、50mM咪唑；
洗脱液C：50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、250mM咪唑；
洗脱液D：50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、500mM咪唑；
分步收集各梯度洗脱组分；
⑤洗柱：用洗柱缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、1000mM咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分；
⑥电泳检测：进行SDS-PAGE电泳检测，筛选收集纯度较高样品，进行透析处理，透析缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2.5mM KCl、0.04％Tween-20、20％甘油)约为样品体积10倍，期间更换2此透析液确保透析完全后收集样品。
本发明还制备了突变前的转肽酶，与上述转肽酶的制备过程中区别仅在于步骤(1)不同，步骤(1)为以合成SEQ ID NO:1所述全基因序列，将序列连接到表达载体，然后将其转化到表达工程菌BL21(DE3)，获表达菌株，其余步骤均相同，突变前转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实验结果：
SDS-PAGE电泳检测结果如图2(泳道1：Marker、泳道2：突变后Sortase A100％纯度、泳道3：突变后Sortase A 95％纯度、泳道4：突变后Sortase A 98％纯度；泳道5：Marker、泳道6：突变前Sortase A100％纯度、泳道7：突变前Sortase A95％纯度、泳道8：突变前Sortase A 98％纯度)。
结果分析；对比突变前后Sortase A，采用同等方法所获得的高浓度的Sortase A蛋白样品，在同等浓度下的电泳图结果显示突变后Sortase A无明显杂带，纯度更高，约98％，而突变前Sortase A存在明显杂带，纯度低于突变后Sortase A约90％-95％。
实施例2转肽酶Sortase A的浓度测定
测试方法：紫外分光光度法
浓度换算公式：
OD280/OD260＜1.5＝1.45*OD280-0.74*OD260
OD280/OD260＞1.5＝(OD280/6.3*1)*10
准备工作：
准备酶测试稀释液：50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM NaCl、2.5mM KCl
比色皿清洗：先用大量纯化水清洗比色皿，再用酶测试稀释液清洗比色皿。
实验过程：
用酶测试稀释液梯度稀释待测试转肽酶Sortase A，梯度稀释后的转肽酶SortaseA的浓度。用酶测试稀释液为空白对照校准紫外分光光度计。再依次对梯度稀释的酶进行OD260和OD280测试，并依据换算公式计算待测转肽酶Sortase A浓度。
测试数据如下表1：
表1突变前后Sortase A浓度检测数值
注意事项；
(A)测试前紫外分光光度计仪器提前开机预热20分钟。
(B)确保比色皿清洗干净，使用过程中比色皿外壁无水渍，内部待测液体无气泡。
(C)测试过程中选取OD260和OD280读数在0.1-0.4范围内数据进行浓度换算。
实验结果：由上表1可知，同等条件下突变后转肽酶Sortase A浓度为5.45mg/mL，突变前转肽酶Sortase A浓度为3.46mg/mL，浓度相对突变后较低。
实施例3
1、依据实施例2中测试转肽酶Sortase A浓度，用转肽酶Sortase A存储液将转肽酶Sortase A稀释到0.5μg/μL为工作液。
2、合成多肽用于性能反应，多肽序列如下：
SrtA-1：MWYLWDRWFYWFWRLRWMYWYLKWRKSYLPETG(SEQ ID NO:5)；
SrtA-2：GGGGYWEYWQKIEWHEMRSKWLWYELRWDYLQFV(SEQ ID NO:6)。
3、配制反应体系：依据下表2进行反应液体系配制，混匀后进行反应(30℃2h)。
表2.
4、12％SDS-PAGE电泳检测反应结果(配制分离胶以60％甘油代替纯水)。
依据下表3配制12％SDS-PAGE分离胶和浓缩胶。
表3.
5、配制电泳缓冲液、5×SDS-PAGE Loading Buffer、染色液和脱色液。
依据下表4-7进行各缓冲液配制。
表4电泳缓冲液配制
表5 5×SDS-PAGE Loading Buffer配制
表6染色液配制
表7脱色液配制
依据(3)中配制的反应排序加入终浓度1×SDS-PAGE Loading Buffer进行依次上样电泳，电压80V/120V跑至溴酚蓝至胶最下面。考马斯亮蓝染色、脱色，观察电泳结果，是否完成转肽反应，电泳结果如图3所示，图3中，泳道1：Marker，泳道2：blank control，泳道3：0.5μL Sortase A(突变前)，泳道4：0.5μLSortase A(突变后)，泳道5：5μL Sortase A(突变前)，泳道6：5μL Sortase A(突变后)。
实验结果：对比图3SDS-PAGE电泳结果，同等条件下突变后，Sortase A与突变前Sortase A转肽反应效果差异较明显，突变后，Sortase A转肽效果相对较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1. 一种SEQ ID NO:4所示的蛋白作为转肽酶在非诊断治疗目的中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转肽酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成编码权利要求1中所示蛋白的核苷酸序列，将序列连接表达载体，再将其转化表达工程菌，获表达菌株；
（2）将步骤（1）中获得表达菌株接种到培养基中，加入诱导剂，离心，收集菌体；
（3）将步骤（2）中菌体经过破菌，纯化处理后获得所述的转肽酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的表达载体为pET-32a。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的工程菌为BL21（DE3）。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述的诱导剂为IPTG。
6. 一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1所述的转肽酶的核苷酸序列，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括权利要求7所述的表达载体。
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