CN114395595B - 一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用 - Google Patents

一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用。所述重组人源胶原蛋白的制备方法包括培养菌体、诱导表达重组人源胶原蛋白、离心收集菌体、破碎菌体、离心收集上清液、过镍琼脂糖凝胶柱层析、过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱等步骤，工艺简单，制备得到的重组人源胶原蛋白纯度高、稳定性好，活性保持时间长，能够显著地促进细胞增殖及迁移，在护肤类产品领域具有重要的应用价值。

Description

一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用
技术领域
本发明属于蛋白提取技术领域，涉及一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％-30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。但是胶原蛋白在临床应用中还存在许多问题，主要障碍是所用胶原的来源，来源于动物或者人体的胶原蛋白主要缺点是可能会传播疾病，过敏反应，病原体污染等。因此，制备一种能等效且安全替代胶原蛋白的重组人源胶原蛋白是目前亟待完成的任务。
重组人源胶原蛋白结构跟人体来源的胶原蛋白一模一样，同时在此基础上进行优化，提高胶原蛋白的亲水性以及活性。并且其含有丰富的亲水基团，具有良好的成膜性，保持皮肤角质层水分。另一方面可以增加成纤维细胞的粘附和增殖，补充伤口创面的胶原蛋白并促进其沉积，降低瘢痕的发生几率。它的趋向性引导作用可引导上皮细胞快速进入受损部位，有效提高皮肤再生速度，缩短创伤愈合时间，从而恢复皮肤屏障功能。是一种对伤口愈合非常有治疗潜力的蛋白，有上皮组织损伤处均可使用之，可应用于烧烫伤、外伤、手术作口、慢性溃疡、溃疡性肠炎等疾病的辅助治疗中。基于重组人源胶原蛋白的重要作用，研究人员为此开发了多种制备、纯化方法。
例如CN113621053A公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用，该制备方法包括如下步骤：获得重组载体：选取人类三型胶原保守区域肽段，将该序列重复8次进行人工全基因合成RHIIIC8，将其构建到pET22b的表达载体中获得重组载体；构建重组基因工程菌：提取质粒、将其转化到BL21-DE3-PLySs感受态细胞中，挑取单克隆并对其扩大培养，获得重组基因工程菌；制备重组人源胶原蛋白：经过诱导表达目的蛋白，然后对表达产物进行分离纯化，得到高纯度的可溶于水的重组人源胶原蛋白。该发明制得的重组人源胶原蛋白具有活性高的特点，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。
例如CN108070032A公开了一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，先采用固液分离技术、过滤技术以及超滤技术对大批量的重组人源胶原蛋白进行粗纯，然后用离子交换层析技术进行精纯，所得目标蛋白纯度高，收率高，可满足重组人源胶原蛋白工业化生产要求。
CN106008702A公开了一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，通过将线性重组蛋白进行初折叠和重折叠，精确控制蛋白分子的空间半径，既有利于微滤和超滤膜孔径的精确选型，又可提高蛋白的回收率，联合应用微滤和超滤，分别去除大分子和小分子杂质，同时超滤实现蛋白浓缩，减轻了后期凝胶柱层析分离的负荷，再通过加入尿素，实现重组蛋白折叠后的解旋，避免了有害物的残留。所得目标蛋白纯度高，收率高，可满足重组人源胶原蛋白工业化生产要求。
然而，现有技术常用的人重组人源胶原蛋白的制备方法，尤其是纯化方法比较复杂，步骤繁琐，而且制备得到的重组人源胶原蛋白溶液的稳定性差，容易析出，重组人源胶原蛋白生物学活性难以长期保持。
因此如何开发一种工艺简单，能够提高重组人源胶原蛋白的纯度，且利于其活性保持的重组人源胶原蛋白的制备方法，并提供一种合适的保存条件以促进其稳定性的提高成为了本领域目前迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，所述重组人源胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)培养菌体，诱导表达重组人源胶原蛋白，得发酵液；
(2)离心收集菌体、破碎菌体、离心收集上清液；
(3)步骤(2)所得上清液过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗脱，得洗脱液；
(4)步骤(3)所得洗脱液过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱，得所述重组人源胶原蛋白。
本发明创造性地利用镍琼脂糖凝胶柱结合葡聚糖凝胶柱对重组人源胶原蛋白进行分离纯化，纯化工艺相对简单，目的蛋白纯度较高。
优选地，步骤(1)所述菌体为大肠杆菌工程菌。
优选地，所述培养菌体中使用的培养基包括蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、消泡剂和无机盐。
优选地，所述蛋白胨包括胰蛋白胨和/或酪蛋白胨。
优选地，所述酵母提取物包括酵母粉、酵母浸出物、酵母裂解物或酵母裂解提取物中的任意一种。
优选地，所述消泡剂包括椰油和/或柠檬酸。
优选地，所述无机盐包括氯化钠、硫酸镁、硫酸铵、氯化钙或磷酸盐中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如氯化钠和硫酸镁的组合、硫酸铵和氯化钙的组合、氯化钙和磷酸盐的组合等，其他任意的组合方式均可选择。
优选地，所述磷酸盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的组合、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的组合、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾的组合等，其他任意的组合方式均可选择。
优选地，步骤(1)所述培养菌体中使用的培养基包括浓度为20-30g/L的蛋白胨、浓度为20-30g/L的酵母提取物、浓度为1-3g/L的葡萄糖、浓度为0.8-1.2g/L的消泡剂、浓度为4-6g/L的氯化钠、浓度为0.8-1.2g/L的硫酸镁、浓度为0.4-0.6g/L的硫酸铵、浓度为0.015-0.025g/L的氯化钙、浓度为8-12mmol/L的磷酸盐和水。
上述20-30g/L中的具体数值可选择20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L等。
上述1-3g/L中的具体数值可选择1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.7g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.7g/L、3g/L等。
上述0.8-1.2g/L中的具体数值可选择0.8g/L、0.85g/L、0.9g/L、0.95g/L、1g/L、1.05g/L、1.15g/L、1.2g/L等。
上述4-6g/L中的具体数值可选择4g/L、4.2g/L、4.5g/L、4.7g/L、5g/L、5.2g/L、5.5g/L、5.7g/L、6g/L等。
上述0.4-0.6g/L中的具体数值可选择0.4g/L、0.42g/L、0.45g/L、0.47g/L、0.5g/L、0.52g/L、0.55g/L、0.57g/L、0.6g/L等。
上述0.015-0.025g/L中的具体数值可选择0.015g/L、0.016g/L、0.017g/L、0.018g/L、0.019g/L、0.02g/L、0.021g/L、0.022g/L、0.023g/L、0.024g/L、0.025g/L等。
上述8-12mmol/L中的具体数值可选择8mmol/L、8.2mmol/L、8.5mmol/L、8.7mmol/L、9mmol/L、9.2mmol/L、9.5mmol/L、9.7mmol/L、10mmol/L、10.2mmol/L、10.5mmol/L、10.7mmol/L、11mmol/L、11.2mmol/L、11.5mmol/L、11.7mmol/L、12mmol/L等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
当培养基配方中各组分及浓度在上述范围内时，发酵的生物量较高，得到的重组人源胶原蛋白的蛋白表达量较高。
优选地，步骤(1)所述培养的温度为36-38℃，例如36℃、36.2℃、36.4℃、36.6℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.4℃、37.6℃、37.8℃、38℃等，该数值范围内的其他具体数值均可任意选择。
优选地，步骤(1)所述诱导是指当菌体长至对数生长中期时进行，使用的诱导剂包括IPTG，IPTG在培养基中的终浓度为0.3-0.5mmol/L，例如0.3mmol/L、0.32mmol/L、0.34mmol/L、0.36mmol/L、0.38mmol/L、0.4mmol/L、0.42mmol/L、0.44mmol/L、0.46mmol/L、0.48mmol/L、0.5mmol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，所述诱导的温度为33-35℃，所述诱导的时间为3-5h。
上述33-35℃中的具体数值可以选择33℃、33.2℃、33.4℃、33.6℃、33.8℃、34℃、34.2℃、34.4℃、34.6℃、34.8℃、35℃等。
上述3-5h中的具体数值可以选择3h、3.2h、3.4h、3.6h、3.8h、4h、4.2h、4.4h、4.6h、4.8h、5h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
当诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度在上述范围内时，诱导效果较好，促进了重组人源胶原蛋白蛋白的高表达，提高了蛋白产量。
优选地，步骤(2)所述离心收集菌体的速度为20-50L/h，转速为12000-18000rpm。
上述20-50L/h中的具体数值可以选择20L/h、22L/h、25L/h、27L/h、30L/h、32L/h、35L/h、37L/h、40L/h、42L/h、45L/h、47L/h、50L/h等。
上述12000-18000rpm中的具体数值可以选择12000rpm、12500rpm、13000rpm、13500rpm、14000rpm、14500rpm、15000rpm、15500rpm、16000rpm、16500rpm、17000rpm、17500rpm、18000rpm等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(2)所述破碎菌体采用高压破碎，压力为800-1200bar。
上述800-1200bar中的具体数值可选择800bar、850bar、900bar、950bar、1000bar、1050bar、1100bar、1150bar、1200bar等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(2)所述的离心收集上清液中离心的转速为12000-16000rpm，离心的时间为30-50min。
上述12000-16000rpm中的具体数值可以选择12000rpm、12500rpm、13000rpm、13500rpm、14000rpm、14500rpm、15000rpm、15500rpm、16000rpm等。
上述30-50min中的具体数值可以选择30min、32min、35min、37min、40min、42min、45min、47min、50min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(2)所述离心收集上清液后还包括过膜。
优选地，所述膜的尺寸为0.45μm。
优选地，步骤(3)所述过镍琼脂糖凝胶柱层析前还包括用A液平衡镍琼脂糖凝胶柱，所述A液包括磷酸缓冲液、氯化钠和吐温80。
优选地，所述A液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07％的吐温80，所述A液的pH范围为6-7.5。
上述15-25mM中的具体数值可以选择15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM等。
上述0.15-0.25M中的具体数值可以选择0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.2M、0.21M、0.22M、0.23M、0.24M、0.25M等。
上述0.03-0.07％中的具体数值可以选择0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等。
上述6.0-7.5中的具体数值可以选择6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，所述平衡镍琼脂糖凝胶柱是指平衡5-10个柱体积。
上述5-10中的具体数值可以选择5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(3)所述洗脱前还包括用B液洗杂蛋白，所述B液包括磷酸缓冲液、氯化钠、吐温80和咪唑。
优选地，所述B液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07％的吐温80和浓度为40-100mM的咪唑，所述B液的pH范围为6.0-7.5。
上述15-25mM中的具体数值可以选择15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM等。
上述0.15-0.25M中的具体数值可以选择0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.2M、0.21M、0.22M、0.23M、0.24M、0.25M等。
上述0.03-0.07％中的具体数值可以选择0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等。
上述40-100mM中的具体数值可以选择40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM等。
上述6-7.5中的具体数值可以选择6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，所述洗杂蛋白是指洗5-10个柱体积。
上述5-10中的具体数值可以选择5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(3)所述洗脱是指用C液洗脱，所述C液包括磷酸缓冲液、氯化钠、吐温80和咪唑。
优选地，所述C液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07％的吐温80和浓度为300-480mM的咪唑，所述C液的pH范围为6.0-7.5。
上述15-25mM中的具体数值可以选择15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM等。
上述0.15-0.25M中的具体数值可以选择0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.2M、0.21M、0.22M、0.23M、0.24M、0.25M等。
上述0.03-0.07％中的具体数值可以选择0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等。
上述300-480mM中的具体数值可以选择300mM、320mM、340mM、360mM、400mM、420mM、440mM、460mM、480mM等。
上述6.0-7.5中的具体数值可以选择6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(3)所述洗脱是指洗5-7个柱体积。
上述5-7中的具体数值可以选择5、5.2、5.4、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8、7等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(4)所述过葡聚糖凝胶柱层析前还包括用A’液平衡葡聚糖凝胶柱。
优选地，所述A’液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07％的吐温80，所述A’液的pH范围为6.0-7.5。
上述15-25mM中的具体数值可以选择15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM等。
上述0.15-0.25M中的具体数值可以选择0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.2M、0.21M、0.22M、0.23M、0.24M、0.25M等。
上述0.03-0.07％中的具体数值可以选择0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等。
上述6.0-7.5中的具体数值可以选择6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
当A液、B液、C液及A’液中各组分的浓度及溶液pH在上述范围内时，过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗杂蛋白、洗脱目的蛋白、过葡聚糖凝胶柱层析的效果更好，促进了蛋白纯度的提高。特别地，当A’液中各组分的浓度及溶液pH在上述范围内时，还能够提高重组人源胶原蛋白在溶液中的稳定性，利于重组人源胶原蛋白活性的长期保持。
优选地，所述平衡葡聚糖凝胶柱是指平衡5-7个柱体积。
上述5-7中的具体数值可以选择5、5.2、5.4、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8、7等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(4)所述过葡聚糖凝胶柱是指将步骤(3)所得洗脱液上样葡聚糖凝胶柱，上样体积为葡聚糖凝胶柱体积的15-25％，例如15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
优选地，步骤(4)所述洗脱是指用A’液洗脱一个柱体积。
第二方面，本发明提供一种重组人源胶原蛋白，所述重组人源胶原蛋白采用如第一方面所述的重组人源胶原蛋白的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种重组人源胶原蛋白保存液，所述重组人源胶原蛋白保存液包括牛血清白蛋白、EDTA-2Na和如第二方面所述的重组人源胶原蛋白。
牛血清白蛋白和EDTA-2Na具有稳定重组人源胶原蛋白的效果、利于其活性的长期保持。
优选地，所述牛血清白蛋白在重组人源胶原蛋白保存液中的质量百分含量为0.03-0.07％，0.03-0.07％，例如0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。
当牛血清白蛋白的浓度在上述范围内时，其稳定重组人源胶原蛋白的效果更好、更利于重组人源胶原蛋白活性的长期保持。
优选地，所述EDTA-2Na在重组人源胶原蛋白保存液中的浓度为1-5mM，例如1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择，优选为1.5-2.5mM。
当EDTA-2Na的浓度在1-5mM范围内时，其稳定重组人源胶原蛋白的效果更好、更利于重组人源胶原蛋白活性的长期保持，浓度为1.5-2.5mM时效果更佳。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组人源胶原蛋白的制备方法、如第二方面所述的重组人源胶原蛋白或如第三方面所述的重组人源胶原蛋白保存液在制备护肤类产品中的应用。
优选地，所述护肤类产品包括精华液、精华霜、面膜、面霜、眼霜中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
首先，本发明创造性的利用镍琼脂糖凝胶柱结合葡聚糖凝胶柱对重组人源胶原蛋白进行分离纯化，纯化工艺相对简单，目的蛋白纯度较高。其次，本发明对纯化过程中使用的各种溶液的组分、浓度及pH进行优化，并且在得到的目的蛋白洗脱液中添加合适浓度的牛血清白蛋白和EDTA-2Na，得到重组人源胶原蛋白保存液，显著提高了重组人源胶原蛋白的稳定性，有利于重组人源胶原蛋白活性的长期保持，本发明提供的重组人源胶原蛋白保存液可以保藏30天同时保持其良好的生物学活性，能够显著促进细胞增殖与迁移。此外，本发明对大肠杆菌的培养基成分(包括各种无机盐的浓度配比)以及诱导条件(包括诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等)进行优化，实现了重组人源胶原蛋白的高表达，提高了重组人源胶原蛋白的蛋白产量。值得一提是，本发明提供的大肠杆菌的培养基中无需添加现有技术中常用的维生素B1，简化了培养基配方，降低了成本，也能达到重组人源胶原蛋白高表达的效果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明下列实施例所用的仪器型号、试剂及其来源如下：
原料 厂家 型号/CAS号
Ni-NTA柱 常州天地人和生物科技有限公司 Ni NTA Beads 6FF
Ni-IDA柱 常州天地人和生物科技有限公司 Ni IDABeads 6FF
G25柱 常州天地人和生物科技有限公司 Smartdex G-25
G50柱 常州天地人和生物科技有限公司 Smartdex G-50
实施例1
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)在发酵罐中配制培养基并灭菌，培养基配方包括胰蛋白胨25g/L、酵母粉25g/L、葡萄糖2g/L、椰油1g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钙0.02g/L和10mmol/L PB。
将保藏在甘油管中的大肠杆菌工程菌体BL21(DE3)/pET28a(+)/Recombinanthuman collagen(实验室构建保存)在含有卡那霉素的平板划线，挑取单菌落摇瓶培养，以5％接种量接种到种子罐扩大培养制备种子液，以5％接种量将种子液在上述培养基中发酵，培养条件为pH 6.8、通氧量40％、温度37℃，当长至对数生长中期时，调pH至7.2、通氧量降至30％、温度降至35℃，使用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导4h，得发酵液。
(2)收集步骤(1)所得发酵液，以40L/h的速度、15000rpm的转速、在4℃下离心，收集沉淀，900bar高压破碎菌体3次，以14000rpm的转速在4℃下离心40min，收集上清液，过0.45μm膜，得目的蛋白溶液。
(3)用A液平衡Ni-NTA柱，平衡6个柱体积，将步骤(2)所得目的蛋白溶液上样Ni-NTA柱，用B液洗杂蛋白，洗6个柱体积，用C液洗脱目的蛋白，洗6个柱体积。
A液配方包括20mM PB、0.2M NaCl和0.05％w/v吐温-80，pH 6.0。
B液配方包括20mM PB、0.2M NaCl、0.05％w/v吐温-80和80mM咪唑，pH 6.0。
C液配方包括20mM PB、0.2M NaCl、0.05％w/v吐温-80和400mM咪唑，pH 6.0。
(4)用A’液平衡G25柱，平衡6个柱体积，将步骤(3)所得洗脱液上样G25柱，上样体积为G25柱体积的20％，用A液洗脱一个柱体积，收集洗脱液，即得重组人源胶原蛋白收集液。
A’液配方包括20mM PB、0.2M NaCl和0.05％w/v吐温-80，pH 6.0。
本实施例还提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其包括由上述方法制备得到的重组人源胶原蛋白收集液、0.05％w/w牛血清白蛋白、2mM EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。其制备方法仅需将各组分进行物理混合均匀即可。
实施例2
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)在发酵罐中配制培养基并灭菌，培养基配方包括酪蛋白胨20g/L、酵母粉20g/L、葡萄糖1g/L、柠檬酸0.8g/L、氯化钠4g/L、硫酸镁0.8g/L、硫酸铵0.4g/L、氯化钙0.015g/L和8mmol/L PB。
将保藏在甘油管中的大肠杆菌工程菌体BL21(DE3)/pET28a(+)/Recombinanthuman collagen(实验室构建保存)在含有卡那霉素的平板划线，挑取单菌落摇瓶培养，以5％接种量接种到种子罐扩大培养制备种子液，以5％接种量将种子液在上述培养基中发酵，培养条件为pH 6.8、通氧量40％、温度37℃，当长至对数生长中期时，调pH至7.2、通氧量降至30％、温度降至33℃，使用终浓度为0.3mmol/L的IPTG诱导5h，得发酵液。
(2)收集步骤(1)所得发酵液，以30L/h的速度、13000rpm的转速、在4℃下离心，收集沉淀，800bar高压破碎菌体3次，以12000rpm的转速在4℃下离心50min，收集上清液，过0.45μm膜，得目的蛋白溶液。
(3)用A液平衡Ni-IDA柱，平衡5个柱体积，将步骤(2)所得目的蛋白溶液上样Ni-IDA柱，用B液洗杂蛋白，洗5个柱体积，用C液洗脱目的蛋白，洗5个柱体积。
A液配方包括15mM PB、0.15M NaCl和0.04％w/v吐温-80，pH 6.5。
B液配方包括15mM PB、0.15M NaCl、0.04％w/v吐温-80和50mM咪唑，pH 6.5。
C液配方包括15mM PB、0.15M NaCl、0.04％w/v吐温-80和300mM咪唑，pH 6.5。
(4)用A’液平衡G25柱，平衡5个柱体积，将步骤(3)所得洗脱液上样G25柱，上样体积为G25柱体积的15％，用A’液洗脱一个柱体积，收集洗脱液，即得重组人源胶原蛋白收集液。
A’液配方包括15mM PB、0.15M NaCl和0.04％w/v吐温-80，pH 6.5。
本实施例还提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其包括由上述方法制备得到的重组人源胶原蛋白收集液、0.03％w/w牛血清白蛋白、4mM EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。其制备方法仅需将各组分进行物理混合均匀即可。
实施例3
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)在发酵罐中配制培养基并灭菌，培养基配方包括胰蛋白胨30g/L、酵母浸出物30g/L、葡萄糖3g/L、椰油1.2g/L、氯化钠6g/L、硫酸镁1.2g/L、硫酸铵0.6g/L、氯化钙0.025g/L、12mmol/L PB。
将保藏在甘油管中的大肠杆菌工程菌体BL21(DE3)/pET28a(+)/Recombinanthuman collagen(实验室构建保存)在含有卡那霉素的平板划线，挑取单菌落摇瓶培养，以5％接种量接种到种子罐扩大培养制备种子液，以5％接种量将种子液在上述培养基中发酵，培养条件为pH 6.8、通氧量40％、温度37℃，当长至对数生长中期时，调pH至7.2、通氧量降至30％、温度降至35℃，使用终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导3h，得发酵液。
(2)收集步骤(1)所得发酵液，以50L/h的速度、18000rpm的转速、在4℃下离心，收集沉淀，1200bar高压破碎菌体2次，以15000rpm的转速在4℃下离心30min，收集上清液，过0.45μm膜，得目的蛋白溶液。
(3)用A液平衡Ni-NTA柱，平衡8个柱体积，将步骤(2)所得目的蛋白溶液上样Ni-NTA柱，用B液洗杂蛋白，洗8个柱体积，用C液洗脱目的蛋白，洗8个柱体积。
A液配方包括25mM PB、0.25M NaCl和0.06％w/v吐温-80，pH 6.1。
B液配方包括25mM PB、0.25M NaCl、0.06％w/v吐温-80和90mM咪唑，pH 6.1。
C液配方包括25mM PB、0.25M NaCl、0.06％w/v吐温-80和450mM咪唑，pH 6.1。
(4)用A’液平衡G50柱，平衡8个柱体积，将步骤(3)所得洗脱液上样G50柱，上样体积为G50柱体积的25％，用A’液洗脱一个柱体积，收集洗脱液，即得重组人源胶原蛋白收集液。
A’液配方包括25mM PB、0.25M NaCl和0.06％w/v吐温-80，pH 6.1。
本实施例还提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其包括由上述方法制备得到的重组人源胶原蛋白收集液、0.07％w/w牛血清白蛋白、1mM EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。其制备方法仅需将各组分进行物理混合均匀即可。
实施例4
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(1)中的无机盐“氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钙0.02g/L和10mmol/LPB”替换为“氯化钠6.2g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸铵0.3g/L、氯化钙0.01g/L和7mmol/L PB”，培养基中其他组分及含量保持不变，其他条件参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(1)中的无机盐“氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钙0.02g/L和10mmol/LPB”替换为“氯化钠3.5g/L、硫酸镁1.5g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙0.03g/L和13mmol/L PB”，培养基中其他组分及含量保持不变，其他条件参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(1)中的“温度降至35℃，使用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导4h”替换为“温度降至36℃，使用终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导2h”，其他条件参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(1)中的“温度降至35℃，使用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导4h”替换为“温度降至31℃，使用终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导7h”，其他条件参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(1)中的“当长至对数生长中期时”替换为“当长至对数生长前期”，其他条件参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(1)中的“当长至对数生长中期时”替换为“当长至对数生长后期”，其他条件参照实施例1。
实施例10
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于改变步骤(3)中的A液、B液和C液配方，并改变步骤(4)中的A’液配方。改变后的A液配方包括12mM PB、0.28M NaCl和0.02％w/v吐温-80，pH5.5。改变后的B液配方包括12mM PB、0.28MNaCl、0.02％w/v吐温-80和30mM咪唑，pH 5.5。改变后的C液配方包括12mM PB、0.28M NaCl、0.02％w/v吐温-80和280mM咪唑，pH 5.5。改变后的A’液配方包括12mM PB、0.28M NaCl和0.02％w/v吐温-80，pH 5.5。其他条件参照实施例1。
本实施例还提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其包括由上述方法制备得到的重组人源胶原蛋白收集液、0.05％w/w牛血清白蛋白、2mM EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。其制备方法仅需将各组分进行物理混合均匀即可。
实施例11
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其与实施例1的区别仅在于改变步骤(3)中的A液、B液和C液配方，并改变步骤(4)中的A’液配方。改变后的A液配方包括30mM PB、0.12M NaCl和0.08％w/v吐温-80，pH6.5。改变后的B液配方包括30mM PB、0.12MNaCl、0.08％w/v吐温-80和120mM咪唑，pH 8.0。改变后的C液配方包括30mM PB、0.12MNaCl、0.08％w/v吐温-80和500mM咪唑，pH 8.0。改变后的A’液配方包括30mM PB、0.12MNaCl和0.08％w/v吐温-80，pH 8.0。其他条件参照实施例1。
本实施例还提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其包括由上述方法制备得到的重组人源胶原蛋白收集液、0.05％w/w牛血清白蛋白、2mM EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。其制备方法仅需将各组分进行物理混合均匀即可。
实施例12
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其与实施例1的区别仅在于将“0.05％w/w牛血清白蛋白、2mM EDTA-2Na”替换为“0.02％w/w牛血清白蛋白、6mM EDTA-2Na”，其他条件不变，其制备方法参照实施例1。
实施例13
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其与实施例1的区别仅在于将“0.05％w/w牛血清白蛋白、2mM EDTA-2Na”替换为“0.08％w/w牛血清白蛋白、0.5mM EDTA-2Na”，其他条件不变，其制备方法参照实施例1。
对比例1
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其与实施例1的区别仅在于保存液中不含有牛血清白蛋白，缺少的量用EDTA-2Na补足，其他条件不变，其制备方法参照实施例1。
对比例2
本实施例提供一种重组人源胶原蛋白保存液，其与实施例1的区别仅在于保存液中不含有EDTA-2Na，缺少的量用牛血清白蛋白补足，其他条件不变，其制备方法参照实施例1。
测试例1
蛋白表达量测试
对实施例1-9的步骤(2)得到的目的蛋白溶液中重组人源胶原蛋白的蛋白表达量进行测试，所述蛋白表达量是指100g菌体中目的蛋白重组人源胶原蛋白的含量。测试方法如下：
利用SDS-PAGE电泳法，将制备的样品进行跑胶，采用垂直板不连续系统电泳，分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为5％，电泳过程中浓缩胶电压80v，分离胶电压150v。电泳后，考马斯亮兰R-250染色过夜，用醋酸-甲醇脱色液脱色。使用灰度扫描软件对胶图进行条带灰度扫描，使用Image J对胶图中的条带进行半定量分析，得出蛋白的表达量。采用BCA法测定蛋白浓度。测试结果见表1。
表1
组别 蛋白表达量(mg/100g菌体)
实施例1 1441.3
实施例2 1392.4
实施例3 1403.2
实施例4 1208.9
实施例5 1210.7
实施例6 1146.7
实施例7 1278.5
实施例8 1007.3
实施例9 1054.1
结果显示：实施例1-3的步骤(2)制得的目的蛋白溶液中重组人源胶原蛋白的蛋白表达量较高，实施例4-9制得的重组人源胶原蛋白的蛋白表达量相较于实施例1较低，表明培养基中的各种无机盐的浓度以及诱导条件(包括诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等)对重组人源胶原蛋白的蛋白表达量影响较大。
测试例2
蛋白纯度测试：
利用HPLC对实施例1-3、10和11的步骤(4)得到的重组人源胶原蛋白收集液中重组人源胶原蛋白的蛋白纯度进行分析：
色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18 4μm 4.6×150mm；柱温25℃；进样体积10μL；流动相为A＝99.9％水+0.1％TFA，B＝无水乙腈；流速1.0mL/min；检测波长210nm；流动相比例如下：
表2
时间(min) A B
0 90 10
2 90 10
10 60 40
20 10 90
22 10 90
32 90 10
37 90 10
40 90 10
根据色谱峰面积计算蛋白纯度。结果如表3所示：
表3
组别 蛋白纯度(％)
实施例1 96.2
实施例2 96.7
实施例3 95.9
实施例10 90.4
实施例11 88.9
结果显示：实施例1-3、10和11得到的重组人源胶原蛋白收集液中重组人源胶原蛋白的蛋白纯度较高，其中，实施例10和11的重组人源胶原蛋白的蛋白纯度相较于实施例1较低，表明蛋白纯化过程中用到的A、B、C、A’液中各组分的浓度和pH对重组人源胶原蛋白的蛋白纯度的影响较大。
测试例3
评估实施例1-3、10-13、对比例1-2提供的重组人源胶原蛋白保存液在4℃放置0天和放置30天后对细胞增殖和迁移的影响，从而反映重组人源胶原蛋白的生物活性及活性保持能力，测试方法如下：
分别将实施例1-3、10-13、对比例1-2提供的重组人源胶原蛋白保存液放置0天和放置30天后进行测试。
(1)对细胞增殖的影响：
取生长状态良好的HaCaT/3T3细胞铺96孔板培养17h后，更换无血清的基础培养基培养7h后，弃去旧培养基，加入含有重组人源胶原蛋白保存液的培养基(重组人源胶原蛋白在培养基中的浓度为2μg/mL)，空白组的培养基中不含重组人源胶原蛋白，但含有等量的实施例1的重组人源胶原蛋白保存液中的其他组分。培养48h后用CCK8法检测细胞活力(以630nm为参比波长，于波长450nm处测定吸光度值)。
细胞活力(指细胞增殖的活力)的计算方法为：
A1：具有细胞、CCK8溶液和重组人源胶原蛋白的孔的吸光度；
A2：具有细胞和CCK8溶液，而没有重组人源胶原蛋白的孔吸光度；
A0：具有培养基和CCK8溶液，而没有细胞和重组人源胶原蛋白的孔的吸光度。
结果见表4：
表4
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结果显示：实施例1-3、10-13提供的重组人源胶原蛋白保存液在放置0天和30天后均能促进HaCaT和3T3细胞增殖，说明本发明制得的重组人源胶原蛋白活性高且在保存液中的活性保持时间长。对比例1和2提供的重组人源胶原蛋白保存液在放置30天后的活性降低程度相较于实施例1较明显，说明其在活性保持方面相较于实施例1较差，进而说明将牛血清白蛋白与EDTA-2Na进行组合，二者协同增效，能够增强重组人源胶原蛋白的稳定性，促进其在溶液中的活性保持。此外，实施例10-13提供的重组人源胶原蛋白保存液在活性保持方面相较于实施例1较差，说明蛋白纯化过程中用到的A、B、C、A’液中吐温和氯化钠等组分的浓度、牛血清白蛋白与EDTA-2Na的浓度对重组人源胶原蛋白的稳定性影响较大。
(2)对细胞迁移的影响：
取生长状态良好的HaCaT/3T3细胞铺24孔板培养17h后，更换无血清的基础培养基培养7h后，弃去旧培养基，使用10μL枪头划线，之后加入含有重组人源胶原蛋白保存液的培养基(重组人源胶原蛋白在培养基中的浓度为2μg/mL)，空白组的培养基中不含重组人源胶原蛋白保存液，但含有等量的实施例1的重组人源胶原蛋白保存液中的其他组分。分别于开始培养时和培养48h后进行拍照计数，得出受检样品对HaCaT/3T3细胞迁移的影响。
测定细胞迁移距离：采用Image J软件测量各定点划痕面积。
结果见表5。
表5
结果显示：实施例1-3、10-13提供的重组人源胶原蛋白保存液在放置0天和30天后均能促进HaCaT和3T3细胞迁移，说明本发明制得的重组人源胶原蛋白活性高且在保存液中的活性保持时间长。对比例1和2提供的重组人源胶原蛋白保存液在放置30天后的活性降低程度相较于实施例1较明显，说明其在活性保持方面相较于实施例1较差，进而说明将牛血清白蛋白与EDTA-2Na进行组合，二者协同增效，能够增强重组人源胶原蛋白的稳定性，促进其在溶液中的活性保持。此外，实施例10-13提供的重组人源胶原蛋白保存液在活性保持方面相较于实施例1较差，说明蛋白纯化过程中用到的A、B、C、A’液中吐温和氯化钠等组分的浓度、牛血清白蛋白与EDTA-2Na的浓度对重组人源胶原蛋白的稳定性影响较大。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (18)

1.一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：
（1）培养菌体，诱导表达重组人源胶原蛋白，得发酵液；
（2）离心收集菌体、破碎菌体、离心收集上清液；
（3）步骤（2）所得上清液过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗脱，得洗脱液；
（4）步骤（3）所得洗脱液过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱，得所述重组人源胶原蛋白；
步骤（1）所述培养菌体中使用的培养基包括浓度为20-30 g/L的蛋白胨、浓度为20-30g/L的酵母提取物、浓度为1-3 g/L的葡萄糖、浓度为0.8-1.2 g/L的消泡剂、浓度为4-6 g/L的氯化钠、浓度为0.8-1.2 g/L的硫酸镁、浓度为0.4-0.6 g/L的硫酸铵、浓度为0.015-0.025 g/L的氯化钙、浓度为8-12 mmol/L的磷酸盐和水；
步骤（1）所述诱导是指当菌体长至对数生长中期时进行，使用的诱导剂包括IPTG，IPTG在培养基中的终浓度为0.3-0.5 mmol/L；
所述诱导的温度为33-35℃，所述诱导的时间为3-5 h；
步骤（1）所述菌体为大肠杆菌工程菌；
步骤（1）所述培养的温度为36-38℃；
步骤（3）所述过镍琼脂糖凝胶柱层析前还包括用A液平衡镍琼脂糖凝胶柱，所述A液包括浓度为15-25 mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25 M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07%的吐温80，所述A液的pH范围为6.0-7.5；所述平衡镍琼脂糖凝胶柱是指平衡5-10个柱体积；
步骤（3）所述洗脱前还包括用B液洗杂蛋白，所述B液包括浓度为15-25 mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25 M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07%的吐温80和浓度为40-100 mM的咪唑，所述B液的pH范围为6.0-7.5；所述洗杂蛋白是指洗5-10个柱体积；
步骤（3）所述洗脱是指用C液洗脱，所述C液包括浓度为15-25 mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25 M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07%的吐温80和浓度为300-480 mM的咪唑，所述C液的pH范围为6.0-7.5；所述洗脱是指洗5-7个柱体积；
步骤（4）所述过葡聚糖凝胶柱层析前还包括用A’液平衡葡聚糖凝胶柱；所述A’液包括浓度为15-25 mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25 M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07%的吐温80，所述A’液的pH范围为6.0-7.5；
步骤（4）所述洗脱是指用A’液洗脱一个柱体积；
所述重组人源胶原蛋白可用于制备重组人源胶原蛋白保存液，所述重组人源胶原蛋白保存液由牛血清白蛋白、EDTA-2Na和所述的重组人源胶原蛋白的制备方法制备的重组人源胶原蛋白组成；
所述牛血清白蛋白在重组人源胶原蛋白保存液中的质量百分含量为0.03-0.07%；
所述EDTA-2Na在重组人源胶原蛋白保存液中的浓度为1.5-2.5 mM。
2.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述蛋白胨包括胰蛋白胨和/或酪蛋白胨。
3.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述酵母提取物包括酵母粉和酵母浸出物中的任意一种。
4.如权利要求3所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述酵母提取物还包括酵母裂解物。
5.如权利要求4所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述酵母裂解物包括酵母裂解提取物。
6.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述消泡剂包括椰油和/或柠檬酸。
7.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合。
8.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心收集菌体的速度为20-50 L/h，转速为12000-18000 rpm。
9.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述破碎菌体采用高压破碎，压力为800-1200 bar。
10.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心收集上清液中离心的转速为12000-16000 rpm，离心的时间为30-50 min。
11.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心收集上清液后还包括过膜。
12.如权利要求11所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述膜的尺寸为0.45 μm。
13.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述平衡葡聚糖凝胶柱是指平衡5-7个柱体积。
14.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述过葡聚糖凝胶柱层析是指将步骤（3）所得洗脱液上样葡聚糖凝胶柱，上样体积为葡聚糖凝胶柱体积的15-25%。
15.一种重组人源胶原蛋白保存液，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白保存液由牛血清白蛋白、EDTA-2Na和如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法制备的重组人源胶原蛋白组成；
所述牛血清白蛋白在重组人源胶原蛋白保存液中的质量百分含量为0.03-0.07%；
所述EDTA-2Na在重组人源胶原蛋白保存液中的浓度为1.5-2.5 mM。
16.如权利要求15所述的重组人源胶原蛋白保存液在制备护肤类产品中的应用。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述护肤类产品包括精华液、面膜、面霜、眼霜中的任意一种。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述面霜包括精华霜。
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