CN101434651B - 一种重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

重组胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法，通过合成人胸腺素β4全长cDNA结合PCR技术，构建了人胸腺素β4二串体基因表达载体pET-22b(+)-Tβ4②，使无法在大肠杆菌中直接表达的人胸腺素β4以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，并且纯化的人胸腺素β4二串体蛋白具有生物学活性，可以促进小鼠淋巴细胞增殖，并且免疫原性低，为人胸腺素β4的进一步研究和广泛应用奠定基础。

Description

一种重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及目的蛋白质的重组质粒的构建、原核表达、纯化及鉴定，特别涉及胸腺素β4(Tβ4)二串体蛋白及其制备方法。 

背景技术

1、胸腺素β4的生物化学特性 

1.1胸腺素β家族 

胸腺素主要是由胸腺产生，最初由Goldstein自胎牛胸腺蛋白提取液中制备得到，含40多种多肽成分，根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，划分为α、β、γ三个区：α区pI＜5，β区pI在5～7之间，γ区pI＞7，其中位于β区的多肽被称为β族胸腺素，其结构高度保守，由40～44个氨基酸组成，相对分子质量约为5000Da。至今，已发现的β族胸腺素有15种，人体内存在3种，即胸腺素β4、胸腺素β9和胸腺素β15，其氨基酸序列具有高度同源性，在维持肌动蛋白的动态平衡以及肿瘤发生与转移、细胞凋亡、炎症、血管生成和创伤愈合等很多生理、病理过程中发挥重要作用。 

1.2胸腺素β4的化学结构 

胸腺素β4是由43个氨基酸残基组成的多肽，分子量4963Da，等电点PI为5.1，在哺乳动物中高度保守。与胸腺素α原或类胸腺素不同，胸腺素β4是胞浆蛋白而非核蛋白，并且它只含有较少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys结构区域。其氨基酸序列如下：AcSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES。 

化学构象研究表明，胸腺素β4是以单链形式存在及发挥作用，其第18～ 30残基和第31～43残基间是一内部重复区域，有6个氨基酸相同。虽然存在第5～6残基和第31～40残基两个α螺旋，但是胸腺素β4没有β转角形成。 

1.3胸腺素β4的生物学分布 

因为胸腺素β4首先是从胸腺中分离纯化得到的，因此最早人们认为它是一种胸腺激素作用于T细胞成熟早期，但是胸腺素β4又广泛存在于其他组织、器官和细胞中，其中含量最高的分别是脾脏、胸腺、肺和腹膜巨噬细胞，其次是脑、肝、肾脏、睾丸、心脏，甚至非网状内皮系统的细胞如成肌细胞、成纤维细胞等也能合成Tβ4。胸腺细胞中胸腺素β4 mRNA含量高于胸腺基质细胞7倍，并且各型血细胞中均有胸腺素β4表达。 

2、胸腺素β4的生理功能研究进展 

2.1胸腺素β4与免疫学功能 

胸腺素β4不但在胸腺依赖性淋巴细胞的调节与分化方面具有重要功能，可显著增强胸腺细胞、骨髓细胞末端核苷酰转移酶活性，还可刺激下丘脑促黄体激素释放激素以及黄体激素的分泌，诱导T细胞系分型转变，在CD4细胞增殖抑制时激活CD8细胞；胸腺素β4与祖B细胞共培养降低Fcα受体的表达，具有抗体依赖细胞的细胞毒活性；HIV-1感染的T细胞、巨噬细胞中胸腺素β4翻译量降低2～3倍，AIDS病人淋巴细胞中胸腺素β4 mRNA量减少5倍。这些研究结果表明，胸腺素β4在宿主防御过程中发挥基础作用。 

2.2胸腺素β4与神经系统发育 

研究发现胸腺素β4在脑发育中显示复杂的表达模式，尽管在体内未成熟的粒细胞表达较高，当粒细胞分化后便减弱至消失，但在星形神经胶质细胞及小神经胶质细胞中一直高水平表达；原位杂交表明，胸腺素β4在中枢神经系统及外周神经节中与神经分化同步高效表达；研究斑纹鱼胚胎发育过程发现，胸腺素β4 mRNA在神经和脑分化时丰度增加，注射反义RNA到斑纹 鱼胚胎，导致脑发育缺陷和视神经系统发育障碍。 

2.3胸腺素β4与造血干细胞 

使用乙酰胆碱酯酶竞争酶联免疫跟踪胸腺素β4及其N端AcSDKP序列表明，二者是造血干细胞增殖的负调控因子，抑制人骨髓干/祖细胞生长，降低S期细胞百分率，在细胞因子存在时降低CD34⁺细胞的增殖率，可保护造血干细胞免于过度分化。AcSDKP序列是胸腺素β4和TNFα的共享序列，促进5-FU处理后小鼠HPP-CFC、BFU-E、CFU-GM的恢复，可能具有保护造血细胞抵抗化疗药物杀伤的作用。 

2.4胸腺素β4与肌动蛋白 

1991年Safer等从人血小板分离到G-肌动蛋白结合蛋白胸腺素β4，能调节肌动蛋白聚合的动力学变化，抑制肌动蛋白的聚合。研究胸腺素β4与肌动蛋白的相互关系发现，胸腺素β4与肌动蛋白结合比例为1∶1，其α螺旋是相互结合的必需结构。胸腺素β4对肌动蛋白聚合的调控作用影响了细胞的粘附、运动、分裂、增殖等活动，还可能参与了肿瘤的转移。 

2.5胸腺素β4与炎症反应 

胸腺素β4第六位的Met氧化形成胸腺素β4亚砜后具有抗炎症作用，胸腺素β4亚砜失去了对肌动蛋白聚合的调控作用，能有效地防止人体发炎而形成的肿胀。此外，胸腺素β4和胸腺素β4亚砜还可能作为化学诱导剂来调节炎性应答。 

体外试验表明，外伤性角膜的损伤部位，胸腺素β4能够降低多核白细胞的侵润及炎症细胞因子和趋化因子mRNA的表达水平。另外，在体外和动物炎症模型中的胸腺素β4亚砜还能够抑制中性粒细胞趋化和组织炎症反应，同时在体外能够抑制巨噬细胞迁移。 

2.6胸腺素β4与血管生成及创伤愈合 

有研究发现在内皮细胞分化形成管状时，胸腺素β4 mRNA增加5倍，转染胸腺素β4的内皮细胞克隆显示管状形成加速。同样Philp等报道显示，胸腺素β4能够刺激脐静脉内皮细胞定向移动到损伤区域，促进体内外血管生成。动物试验表明，胸腺素β4也能够促进正常和衰老的啮齿类动物血管生成。 

胸腺素β4的创伤愈合作用是通过促进损伤部位的内皮细胞增生移行、胶原沉着以及血管生成综合作用。有实验表明胸腺素β4基因表达上调，有利于增强细胞抗缺氧的能力；人血小板释放的胸腺素β4能通过XIIIa因子介导，与纤维蛋白和胶原相连；胸腺素β4有促进正常大鼠皮肤和角膜修复的功能，在糖尿病和老年小鼠的全层皮肤损伤实验中也表现加速创伤修复的能力。 

2.7胸腺素β4与毛囊生长 

毛发生长过程中牵涉到许多细胞及分子机制，如细胞迁移、分化和细胞外基质的重塑等。研究表明，胸腺素β4可促进正常大鼠及小鼠的毛发生长，其可能的作用机制如下：(1)胸腺素β4可促进毛囊干细胞及其子代细胞的移动来促进毛发生长。(2)胸腺素β4通过促进MMP-2的合成和分泌来影响毛发的生长。(3)胸腺素β4也有可能通过诱导毛乳头及其毛囊周围的血管形成而调控毛囊的周期性循环和促进毛发生长。 

2.8胸腺素β4与肿瘤 

胸腺素β4基因表达的上调与某些肿瘤的发生关系密切：人类髓状甲状腺癌伴转移的细胞中、非小细胞肺癌早期肿瘤细胞中、人结肠直肠癌细胞系中及口腔鳞状上皮细胞癌转移的细胞系中胸腺素β4基因呈高度表达；高度恶性黑色素瘤和乳腺癌细胞中胸腺素β4表达也明显上调。目前通过蛋白芯片生物标记系统，已经确认胸腺素β4为多种肿瘤细胞和正常细胞分泌的差异性蛋白。 

胸腺素β4表达上调与肿瘤发生关系密切可能是由于：胸腺素β4可以有 效诱导血管内皮细胞生长因子的表达而促使血管生成，并激活细胞迁移性，促使肿瘤恶性化；胸腺素β4可使细胞外基质和细胞间的粘连作用发生异常，引起表皮细胞侵染和恶性化；胸腺素β4有抗凋亡能力，其表达增加可使肿瘤细胞的凋亡程度降低。 

2.9胸腺素β4与心脏 

冠状动脉的形成可以分为血管发生、血管形成和动脉形成3个阶段。Smart等通过选择性的敲除胸腺素β4基因，观察胸腺素β4在心脏发育过程中的作用，发现胸腺素β4在心血管形成的上述3个关键时期是不可缺少的：胸腺素β4裂解产物AcSDKP可促进心外膜细胞分化为内皮细胞，而且可能是胸腺素β4促进血管发生作用的基础；胸腺素β4能够诱导心外膜发挥其血管生成的潜能。 

Bock-Mrguett等研究发现，胸腺素β4从心肌层中分泌，刺激心外膜细胞的旁分泌，促使心外膜的细胞移到心肌层并分化成形成冠状动脉的内皮细胞和固定血管的平滑肌细胞。在研究胸腺素β4对成年小鼠局部缺血心脏的修复作用时，发现胸腺素β4可以促进心肌细胞和内皮细胞在胚胎心脏中的迁移，并可显著地增强心脏的修复功能，增加心肌细胞的存活率和减小瘢痕形成。 

3、胸腺素β4的应用前景 

3.1治疗创伤 

因为胸腺素β4可促进血管生成，并可促进创伤愈合，因此可以用来治疗皮肤、角膜、结膜等组织的损伤。目前FDA批准RegeneRx生物制药公司进行五项关于胸腺素β4的临床试验，包括压迫性溃疡、大疱性表皮松解、静脉淤积性溃疡、糖尿病玻璃体切割术后和急性心肌梗死，其中前四项已进入II期临床试验。 

3.2治疗肿瘤 

细胞的运动性是肿瘤转移的前提，胸腺素β4具有调节肌动蛋白的作用，与细胞的运动性有必然的联系。应用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术可检测胸腺素β4在癌组织中表达增高，提示胸腺素β4可否作为检测肿瘤恶变的标志物，对胸腺素β4研究的深入将有助于肿瘤的诊断、分级及预后等方面的工作；胸腺素β4在肿瘤发生中的重要作用使其可能成为肿瘤治疗的一个重要目标，即通过调节胸腺素β4功能而实现治疗目的；此外，运用反义胸腺素β4mRNA转染细胞或胸腺素β4抗体会导致肿瘤形成和转移减少，为临床治疗提供重要的理论意义，获得控制肿瘤转移的有效治疗措施。 

3.3治疗脱发 

尽管胸腺素β4促毛囊生长作用的许多分子生物学机制目前尚未阐明，但已有的实验证据已经给研究者们一些启示，通过开展相关的基础与临床研究，胸腺素β4很有希望引入到顽固的脱发疾病的治疗中。 

3.4治疗炎症 

感染性休克引起胸腺素β4快速消失，提示胸腺素β4也许参与炎症早期级联激活过程和脓毒血症引起的临床后遗症，胸腺素β4也许有治疗感染性休克和与actin中毒相关综合征的作用。胸腺素β4亚砜失去了对肌动蛋白聚合的调控作用，能有效地防止人体发炎而形成的肿胀，还能避免人体免疫反应失去控制，并可充当信号显示人体免疫系统已无法完全保护自身组织免受损伤。科研人员以这种蛋白质为基础开发研制出治疗风湿性关节炎等慢性炎症的新药，其副作用小于常用的类固醇消炎药，已开始用于慢性褥疮、糖尿病溃疡、眼部损伤、皮肤老化、败血性休克、化脓性感染等疾病的临床试验治疗。 

4、胸腺素β4原核表达的研究 

虽然胸腺素β4有着广泛的应用前景，但由于其分子太小，难于直接在大肠杆菌中表达。目前用于实验室及临床试验的胸腺素β4多为化学合成品，价格昂贵；而从哺乳动物组织中提取胸腺素β4，过程复杂而且产量较低，使其应用受到限制，如何以更经济的方法获取此多肽显得非常重要。 

Tsuji Y等用大肠杆菌高效表达了胸腺素β4与TNF构成的嵌合体蛋白，在适当的酸性环境中将二者之间的Asp-Pro桥切开，胸腺素β4从嵌合体蛋白中释放，经过纯化便可得到较多的胸腺素β4蛋白。 

陈妍柯等将胸腺素β4基因片段克隆入质粒pLDH4的EcoR V和Hind III位点之间，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α，诱导后的菌体经硫酸铵盐析技术、Source RPC反相层析柱和Q Sepharose HP阴离子交换柱纯化，得到的N端融合5个氨基酸的HKCDI-Tβ4蛋白，可提高E-玫瑰花环结花率并能够促进淋巴细胞的增殖和分化。 

贾琪等构建重组表达质粒pET-28a(+)-Tβ4，将其转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后表达带6×His标签的融合蛋白，并经镍柱一步亲和层析即获得纯化，CAM试验证明His₆-Tβ4蛋白有促进毛细血管生成的活性。 

XK Li等构建重组表达质粒pTXB-T β4，将其转化大肠杆菌ER 2566，IPTG诱导得到的融合蛋白经一步亲和纯化、DTT自动水解后，得到的胸腺素β4C端融合5个氨基酸(LEGSS)，不仅可以促进淋巴细胞的增殖和分化，而且可以促进伤口愈合。 

如上述所述，虽然构建的胸腺素β4的不同表达载体，表达及纯化融合或嵌合蛋白，并有一定的生物活性，但同时存在以下缺陷：纯化工艺复杂成本较高，表达产物不稳定表达。带有蛋白桥的融合蛋白还需要重新酶切、纯化；带有His标签的重组蛋白纯化工艺需要昂贵的镍柱亲和纯化，大大增加了成本，不适于工业化生产；而且His标签影响了重组蛋白在临床试验的应用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法，本发明将胸腺素β4以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达并纯化，得到具有胸腺素β4生物学活性的重组胸腺素β4二串体蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产，为其广泛应用奠定基础。 

为了实现上述目的，本发明重组胸腺素β4二串体蛋白为：通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的胸腺素β4(Tβ4)，其连接方式为：Tβ4-Gly-Ser-Tβ4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明编码重组核苷酸是用BamH I酶切位点连接2段胸腺素β4的基因序列，在5’端加入Nde I酶切位点、3’端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，其连接方式为：Nde I酶切位点-Tβ4基因-BamH I酶切位点-Tβ4基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。重组胸腺素β4二串体核苷酸构建于表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②，所述的pET-22b(+)-Tβ4②是通过Nde I酶切位点和Sal I酶切位点将重组胸腺素β4二串体核苷酸克隆入质粒pET-22b(+)。 

重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法，按照以下步骤： 

1)构建胸腺素β4二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tβ4② 

a)pET-22b(+)-Tβ4①的构建 

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素β4的氨基酸序列转化为cDNA序列，5’端引入Nde I酶切位点，3’端引入BamH I酶切位点，设计的基因序列如下： 

catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaag 

aaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaag 

caggc ggggg aaagc ggatc c， 

人工合成上述基因并将其克隆入表达载体pET-22b(+)Nde I、BamH I酶切位点之 间，得到重组质粒pET-22b(+)-Tβ4①； 

b)pET-22b(+)-Tβ4②的构建 

通过PCR将步骤a)所述的胸腺素β4基因两端的酶切位点Nde I、BamH I突变成BamH I和Sal I，并引入终止密码子TAG，设计PCR引物如下： 

F：cgcggatcca gtgataaacc ggatatggc 

R：gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttcc 

PCR反应的循环参数：95℃预变性5min后，按下列参数循环30次：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，最后再于72℃延伸10min；收集PCR退火产物； 

用BamH I和Sal I双酶切位点将PCR退火产物克隆入pET-22b(+)-Tβ4①，构建成重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②，重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，两个胸腺素β4基因在的重组质粒连接方式为Nde I酶切位点-Tβ4基因-BamH I酶切位点-Tβ4基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 

3)胸腺素β4二串体蛋白的纯化 

a)用重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，0.01mM IPTG诱导4h后收集菌体，按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将菌体重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；在冰浴中超声裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH₄)₂SO₄至饱和度为60％，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清； 

b)上清液顺次用a液充分平衡的疏水柱层析纯化；用B液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白胸腺素β4二串体蛋白所在洗脱峰的洗脱液，用50倍洗脱峰体积的C液透析，中间换C液三到四次；透析后用C液充分平衡的阴离子交换柱层析纯化，用D液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰的洗脱液， 用50倍洗脱峰体积磷酸盐缓冲液PBS透析，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到纯化的胸腺素β4二串体蛋白； 

所述的A液：20mM Tris-HCl pH 7.5，60％(NH₄)₂SO₄，1mM EDTA，B液：20mMTris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，C液：20mM Tris-HCl pH 7.0，1mM EDTA，D液：20mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，1mM EDTA。 

本发明采用免疫印迹分析证明胸腺素β4二串体蛋白可与兔抗人胸腺素β4多克隆抗体特异性结合，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测得胸腺素β4二串体蛋白的分子量与理论分子量相一致，说明本发明构建的表达载体成功表达，得到预期的重组胸腺素β4二串体蛋白。 

纯化的重组胸腺素β4二串体蛋白与标准品胸腺素β4均可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化，说明重组胸腺素β4二串体蛋白具有胸腺素β4的生物活性。 

ELISA结果显示胸腺素β4二串体蛋白免疫组小鼠血清与PBS对照组小鼠血清相比几乎一样，不含有抗人胸腺素β4二串体蛋白的抗体；这表明纯化胸腺素β4二串体蛋白免疫原性低，短期使用不会诱发抗体产生，为其在体内发挥生物学效应奠定基础。 

与现有技术相比，本发明采用以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达并纯化，得到具有胸腺素β4生物学活性的重组胸腺素β4二串体蛋白，解决了胸腺素β4分子太小无法在大肠杆菌中直接表达的问题，克服了其他形式的融合或嵌合蛋白纯化工艺复杂成本较高，表达产物不稳定表达的缺陷；而且胸腺素β4二串体蛋白免疫原性低，短期使用不会诱发抗体产生，为其广泛代替其他形式的胸腺素β4的应用奠定了基础。 

附图说明

图1是胸腺素β4基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图； 

图2是胸腺素β4二串体重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②的双酶切琼脂糖电泳鉴定图； 

图3是胸腺素β4二串体重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②的DNA测序结果图； 

图4是胸腺素β4二串体蛋白的诱导表达和纯化聚丙烯酰胺电泳图； 

图5是胸腺素β4二串体蛋白的免疫印迹鉴定图； 

图6是胸腺素β4二串体蛋白的质谱结果图； 

图7是用MTT法测定胸腺素β4二串体蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响结果Excel统计图； 

图8是用胸腺素β4二串体蛋白与小鼠抗胸腺素β4二串体蛋白抗血清ELISA结果Excel统计图。 

具体实施方式

本发明利用大肠杆菌偏爱密码子，合成人胸腺素β4全长基因，结合PCR技术构建了人胸腺素β4二串体基因表达载体pET-22b(+)-Tβ4②，重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导表达后，经盐析、疏水作用层析和离子交换作用层析纯化重组蛋白，最终获得了高纯度的人胸腺素β4二串体蛋白，并采用Western blot和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对其进行鉴定，通过脾淋巴细胞增殖实验测定其活性。 

具体按照以下步骤实现： 

1)构建胸腺素β4二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tβ4② 

a)pET-22b(+)-Tβ4①的构建 

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素β4的氨基酸序列转化为cDNA序列，5’端引入Nde I酶切位点，3’端引入BamH I酶切位点，设计的基因序列如下： 

catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaag 

aaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaag 

caggcggggg aaagcggatc c，划线部分分别为Nde I、BamH I酶切位点，委托北京奥科生物技术有限责任公司合成上述基因并克隆入pGH载体中。将人胸腺素β4基因亚克隆入表达载体pET-22b(+)(NOVAGEN公司)中，构建重组质粒pET-22b(+)-Tβ4①。 

b)pET-22b(+)-Tβ4②的构建 

通过PCR将步骤a)所述的胸腺素β4基因两端的酶切位点Nde I、BamH I突变成BamH I和Sal I，并引入终止密码子TAG，设计PCR引物如下： 

F：cgcggatcca gtgataaacc ggatatggc 

R：gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttcc 

划线部分分别为BamH I和Sal I酶切位点，委托上海英峻生物公司合成上述引物。 

PCR反应体系如下： 

20ng/ml模板DNA     1μl 

20μM Primer 1     1μl 

20μM Primer 2     1μl 

2×Taq PCR Mix     12.5μl 

ddH₂O              9.5μl 

总计               25μl 

PCR反应的循环参数：95℃预变性5min后，按下列参数循环30次：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min。最后再于72℃延伸10min。PCR产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小144bp的DNA片段，如图1泳道2所示；图中泳道1：DNA marker；泳道2：β4基因PCR扩增产物； 

用BamH I和Sal I双酶切位点将PCR退火产物克隆入pET-22b(+)-Tβ4①，构 建成重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②，重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，两个胸腺素β4基因在的重组质粒连接方式为Nde I酶切位点-Tβ4基因-BamH I酶切位点-Tβ4基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 

重组质粒转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小273bp的插入片段，如图2泳道4所示，泳道3为Tβ4大小为138bp片段；图2中泳道1：DNA marker；泳道2：pET-22b(+)-Tβ4②/Nde I和BamH I双酶切；泳道3：pET-22b(+)-Tβ4②/BamH I和Sal I双酶切；泳道4：pET-22b(+)-Tβ4②/Nde I和Sal I双酶切。DNA测序结果(如图3所示)，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示，经过比较发现PCR过程中有一个碱基发生突变，第207个碱基由T突变以C，三联密码子由ACT突变为ACC，均编码苏氨酸，为同义突变。 

3)胸腺素β4二串体蛋白的纯化 

a)用重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜，次日以1∶100的比例接种于新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀＝0.4～0.6；加入0.01mM IPTG，诱导4h后收集菌体。按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将菌体重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；在冰浴中超声裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH4)₂SO₄至饱和度为60％，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清； 

b)上清顺次用A液充分平衡的疏水柱(苯基琼脂糖凝胶6FF，PhenylSepharose 6 Fast Flow，high sub，Pharmacia公司)层析纯化；用B液连续梯度洗脱10个柱床体积；收集目的蛋白胸腺素β4二串体蛋白所在洗脱峰的洗脱液，用 50倍洗脱峰体积的C液透析，中间换C液三到四次；透析后用C液充分平衡的阴离子交换柱(Q琼脂糖凝胶FF，Q Sepharose Fast Flow，Pharmacia公司)层析纯化，用D液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰，将洗脱峰用50倍洗脱峰体积磷酸盐缓冲液PBS透析，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到纯化的胸腺素β4二串体蛋白，分装后-20℃保存备用； 

所述的A液：20mM Tris-HCl pH 7.5，60％(NH4)₂SO₄，1mM EDTA，B液：20mMTris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，C液：20mM Tris-HCl pH 7.0，1mM EDTA，D液：20mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，1mM EDTA。 

SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测诱导表达和纯化胸腺素β4二串体蛋白，参见图4，图中M：protein marker；泳道1：未诱导BL21/pET-22b(+)-Tβ4②；泳道2：0.01mM IPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tβ4②4h；泳道3：超声裂菌沉淀；泳道4：超声裂菌上清；泳道5：硫酸铵盐析沉淀；泳道6：硫酸铵盐析上清；泳道7：疏水作用纯化目的蛋白；泳道8：阴离子交换作用纯化目的蛋白；电泳结果显示，IPTG诱导后目的蛋白表达，且诱导后4小时表达量最高，如泳道1-2所示；采用本发明所述纯化方法可以成功纯化目的蛋白，得到纯度大于95％的目的蛋白，如泳道8所示。 

4)胸腺素β4二串体蛋白的鉴定 

a)免疫印迹 

未经诱导及诱导后的BL21菌体在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20％甲醇)中100V恒压电泳1h，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mMTris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.05％Tween-20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中室温封闭1h，TBST室温洗3次，每次5min，加入兔抗人胸腺素 β4多克隆抗体(Abcam公司，按1∶500稀释)，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，再加入HRP-山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，按1∶4000稀释)，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，最后用TBS(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl)洗3次，NC膜浸入DAB显色液中，室温避光显色1min，蒸馏水冲洗终止反应。DAB显色后在相应电泳位置有条带显现，如附图5泳道1所示，表明胸腺素β4二串体蛋白可与兔抗人胸腺素β4多克隆抗体特异性结合；图中M：protein marker；泳道1：0.01mM IPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tβ4②4h；泳道2：未诱导BL21/pET-22b(+)-Tβ4。 

b)质谱分析 

用截留分子量为5000Da的超滤离心管对纯化的蛋白进行除盐、浓缩，0.22μm滤器过滤除菌后，委托军事医学科学院仪器测试分析中心对其进行分子量测定。胸腺素β4二串体蛋白的理论分子量约为：胸腺素β4的分子量×2+甘氨酸分子量+丝氨酸分子量-水分子量×3＝4963×2+75+105-18×3＝10052。质谱分析测得胸腺素β4二串体蛋白的实际分子量为10020.5，如附图6所示，与理论分子量相近。 

5)人胸腺素β4二串体蛋白体外生物学活性检测 

将两只BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠沥干，置于无菌纸上，在小鼠左腹侧中部剪开小口，取出脾脏，置于不锈钢滤网上，滤网置于盛有10ml 10％FCS RPMI 1640液的培养皿上方，用注射器针芯轻轻研压脾脏，并用培养液反复淋洗，收集脾细胞悬液；取4个10ml离心管，每管加入5ml小鼠淋巴细胞分离液后，再缓慢加入脾细胞悬液2.5ml，离心(1500rpm×20min)后吸出淋巴细胞层，用10％FCS RPMI 1640培养液洗涤细胞一次，离心(1500rpm×10min)后倾倒上清液，加入5ml 10％FCS RPMI 1640培养液重悬细胞并计数，调整 细胞密度为2×10⁶细胞/ml，加入ConA，使其终浓度为2.5μg/ml，按4×10⁵细胞/孔铺96孔细胞培养板。 

将96孔板置37℃、5％CO₂培养箱培养6h，再分别加入胸腺素β4二串体蛋白及标准品胸腺素β4(Pro-Spec公司)，使其终浓度为2μM、4μM、8μM，对照组加入等量的PBS，每组设3个复孔，继续培养72h后加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃5％CO2培养箱培养4h，离心(2000rpm×10min)后小心吸弃上清，加入150μl DMSO，10min后在波长570nm处读数，此实验重复两次，结果如图7所示。经过统计学分析可知：各浓度的胸腺素β4二串体蛋白和标准品胸腺素β4所对应的吸光值均高于对照组，且差异有统计学意义；同一浓度的胸腺素β4二串体蛋白和标准品胸腺素β4所对应的吸光值无明显差异。表明各浓度的胸腺素β4二串体蛋白和标准品胸腺素β4均可刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，并且同一浓度的胸腺素β4二串体蛋白和标准品胸腺素β4刺激淋巴细胞增殖的确能力相同。 

6)胸腺素β4二串体蛋白免疫原性鉴定 

将12只BALB/c小鼠(6～8周龄，雄性，由第四军医大学实验动物中心提供)随机分成2组，每组6只。胸腺素β4二串体蛋白免疫组腹腔注射β4二串体蛋白的PBS溶液，剂量为40μg/天，对照组给予等量的PBS，7天后将每只小鼠摘眼球取血，血液置于4℃过夜，离心(12000rpm×5min，4℃)后收集血清，用ELISA法检测血清中抗体滴度，具体方法如下： 

将胸腺素β4二串体蛋白溶解于包被液(Na₂CO₃ 0.32g，NaHCO₃ 0.59g，纯水定容至200ml，pH 9.6)中，终浓度为1μg/ml，加入ELISA板孔中(100μl/孔)，4℃包被过夜；倒掉包被液，加入封闭液(含1％BSA、0.05％Tween-20的PBS，pH 7.4)，37℃封闭2h；弃去封闭液，用洗涤液(含0.05％Tween-20的PBS，pH 7.4)洗6次，每次2min，分别加入稀释25、50、 100、200倍的各小鼠血清，100μl/孔，37℃孵育2h；弃去血清，用洗涤液洗6次，每次2min，加入二抗HRP-山羊抗鼠IgG(1∶10000)，100μl/孔，37℃孵育1h；弃去二抗，用洗涤液洗6次，每次2min；加入底物显色液(Na₂HPO₄12H₂O 0.184g，C₆H₈O₇·H₂O 0.051g，纯水定容至10ml pH 5.0，再加入OPD 8mg，30％H₂O₂ 30μl)，100μl/孔，37℃，显色10-20min；加入终止液(1M H₂SO₄)，100μl/孔，终止反应；酶标仪读数，测定每孔在490nm的吸光值。 

ELISA结果如图8所示，经过统计学分析可知：在不同血清稀释度下，免疫组与对照组所对应的吸光值无统计学差异，表明胸腺素β4二串体蛋白免疫原性小，短期使用不会诱发抗体产生。 

重组胸腺素β4二串体氨基酸及核苷酸序列 

<110>中国人民解放军第四军医大学 

<120>重组胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法 

<160>2 

<210>1 

<211>88 

<212>PRT 

<213>人工合成 

<400>1 

Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr 

1               5                   10                  15                  20 

Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala 

21             25                  30                  35                   40 

Gly Glu Ser Gly Ser Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser 

41             45                  50                  55                   60 

Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu 

61             65                  70                  75                   80 

Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 

81              85           88 

<210>2 

<211>279 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<400>2 

catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaag     60 

aaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaag    120 

caggcggggg aaagcggatc cagtgataaa ccggatatgg ccgagattga gaaatttgat    180 

aagtcaaaat tgaagaaaac ggaaacccag gaaaagaacc cgttgccttc aaaagagacc    240 

atcgaacagg aaaagcaggc gggggaaagc taggtcgac                           279 

Claims (1)

1.一种重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法，其特征在于，其制备方法按照以下步骤：

1)构建胸腺素β4二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②

a)pET-22b(+)-Tβ4①的构建

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素β4的氨基酸序列转化为cDNA序列，5’端引入Nde I酶切位点，3’端引入BamH I酶切位点，设计的基因序列如下：catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaagaaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaagcaggcggggg aaagcggatc c，

人工合成上述基因并将其克隆入表达载体pET-22b(+)Nde I、BamH I酶切位点之间，得到重组质粒pET-22b(+)-Tβ4①；

b)pET-22b(+)-Tβ4②的构建

通过PCR将步骤a)所述的胸腺素β4基因两端的酶切位点Nde I、BamH I突变成BamH I和Sal I，并引入终止密码子TAG，设计PCR引物如下：

F：cgcggatcca gtgataaacc ggatatggc

R：gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttcc

PCR反应的循环参数：95℃预变性5min后，按下列参数循环30次：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，最后再于72℃延伸10min；收集PCR退火产物；

用BamH I和Sal I双酶切位点将PCR退火产物克隆入pET-22b(+)-Tβ4①，构建成重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②，重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定获导预期大小的插入片段，两个胸腺素β4基因在的重组质粒连接方式为Nde I酶切位点-Tβ4基因-BamH I酶切位点-Tβ4基因-TAG-SalI 酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)胸腺素β4二串体蛋白的纯化

a)用重组质粒pET-22b(+)-Tβ4②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，0.01mM IPTG诱导4h后收集菌体，按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将菌体重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；在冰浴中超声裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH₄)₂SO₄至饱和度为60％，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清；

b)上清液顺次用A液充分平衡的疏水柱层析纯化；用B液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白胸腺素β4二串体蛋白所在洗脱峰的洗脱液，用50倍洗脱峰体积的C液透析，中间换C液三到四次；透析后用C液充分平衡的阴离子交换柱层析纯化，用D液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰的洗脱液，用50倍洗脱峰体积磷酸盐缓冲液PBS透析，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到纯化的胸腺素β4二串体蛋白；

所述的A液：20mM Tris-HCl pH 7.5，60％(NH₄)₂SO₄，1mM EDTA，B液：20mMTris-HCl pH 7.5，1mMEDTA，C液：20mMTris-HCl pH 7.0，1mMEDTA，D液：20mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，1mM EDTA。 

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