JPH11171898A - Ｉｖ型コラーゲン高分子画分、その製法、その測定法及び肝疾患の判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ＩＶ型コラーゲン高分子画分を取得し、これを
選択的に測定することにより、肝線維化段階をより詳細
に判定できる方法を提供する。 【解決手段】ペプシン加水分解により可溶化したコラー
ゲン溶液を１．２Ｍ以下の食塩で塩析し沈殿物を再溶解
後、前回の塩濃度以下で再度塩析したときの上清から、
ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインより高い分子量を有し、
その構造中に７Ｓドメインを有するＩＶ型コラーゲン高
分子画分を得る。またそれに対し反応性を有する抗体
と、試料を反応させることにより、試料中のＩＶ型コラ
ーゲン高分子画分を測定し、肝臓疾患における肝線維化
度の判定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＩＶ型コラーゲン
高分子画分及びその製造法に関するものである。また本
発明は、ＩＶ型コラーゲン高分子画分を測定する方法お
よびこれを測定することによる肝臓の線維化度の判定方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】肝疾患において、肝臓が線維化する現象
が知られているが、これは肝臓におけるＩＶ型コラーゲ
ンの合成と分解とのバランスが崩れ、分解に比べて合成
が増大することによって引き起こされるものである。肝
臓の線維化の指標として、血清中のＩＶ型コラーゲンを
測定することの有用性が多数報告されており、慢性肝炎
から肝硬変へと病状が進展するに従って、血清中のＩＶ
型コラーゲン濃度が上昇することが知られている（特開
平８−１０００００号公報、斎藤ら、肝臓 ３７巻、Ｎ
ｏ．６，ｐ．３０４−３１１）。これは肝臓が線維化し
た部分の主成分がＩＶ型コラーゲンであり、肝線維化度
が血清中のＩＶ型コラーゲン濃度に直接的に反映される
ためである。

【０００３】ところで、血液中のＩＶ型コラーゲン分子
は、肝臓の線維化過程において、すなわち、肝臓におけ
るＩＶ型コラーゲンの合成及び分解の過程において血液
中に放出されたものであり、分子種としては均一ではな
いことが報告されている。これはＩＶ型コラーゲンの構
造が、アミノ末端の７Ｓドメイン、カルボキシル末端の
ＮＣ１及びＮＣ２領域、及び中間部のペプチドがらせん
状により合わさったトリプルヘリカル領域から構成され
た網目構造であり、これがコラゲナーゼなどにより部分
分解されて血液中に放出されるためである。

【０００４】Ｍｕｒａｗａｋｉら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４，ｐ．１４８−１５４，１９９６
及びＣｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２１
２，ｐ．７３−７８，（１９９２）（以下、Ｃ．Ｃ．Ａ
とする）の報告によれば、７Ｓドメインを認識する抗体
を用いてアッセイを行った場合、血液中のＩＶ型コラー
ゲンとして主に２つの分子種が検出され、それらは
（１）７Ｓドメインを含み、７Ｓドメインより高い分子
量を有する高分子画分、及び（２）７Ｓドメインそのも
のである。また同報告によれば、７Ｓドメインを認識す
る抗体とトリプルヘリカル領域を認識する抗体とを用い
てアッセイを行った場合、上述の（１）及び（２）の２
つの分子種よりもさらに低分子量の分子が検出される。
これらのことから、血清中のＩＶ型コラーゲン分子とし
ては、分子量の異なる３つの分子種が共存していること
が明らかにされている。

【０００５】さらに上述のＣ．Ｃ．Ａの報告によれば、
健常人及び肝疾患患者ともに血液中のＩＶ型コラーゲン
として上述の３つの分子種が存在することが示されてい
る。しかし肝疾患患者では、慢性肝炎から肝硬変へと肝
臓の線維化がより進行し症状が悪化するにつれて、ＩＶ
型コラーゲンの３つの分子種のうち、７Ｓドメインを含
み、７Ｓドメインより高い分子量を有する高分子画分が
血液中で著しく増加する。このＩＶ型コラーゲン高分子
画分は、コラーゲナーゼによる分解を受けていないほと
んど完全な形をしたＩＶ型コラーゲンであると考えられ
ることから、血液中のＩＶ型コラーゲン高分子画分量の
増減は、肝臓におけるＩＶ型コラーゲン合成の増減を直
接的に反映し、一方、血液中の７Ｓドメインまたはそれ
より小さい分子量のＩＶ型コラーゲンの増減は、肝臓の
線維化組織からのＩＶ型コラーゲン分解の増減を反映し
ていると考察されている。

【０００６】しかしながら、ＩＶ型コラーゲン高分子画
分の分離・精製の報告はこれまでにない。前述のＭｕｒ
ａｗａｋｉらの報告においても、患者血清をゲル濾過に
て分離し、市販のＩＶ型コラーゲン測定キットを用い
て、各フラクションの反応性を検討し、７Ｓドメインよ
り高い分子量を有するフラクションにも反応性がみられ
ることを示すにすぎないものである。

【０００７】このように市販のＩＶ型コラーゲン測定キ
ットの中にも、ＩＶ型コラーゲン高分子画分への反応性
を示すものはあるが、前述の７Ｓドメインまたはこれよ
り分子量の小さいＩＶ型コラーゲンへの反応性が高く、
ＩＶ型コラーゲン高分子画分のみを特異的に測定できる
ものはなかった。したがって、肝臓におけるＩＶ型コラ
ーゲンの合成を直接反映した測定法はこれまで存在しな
かった。

【０００８】ところで特開平８−１０００００号公報に
記載のハイブリドーマＣＯＬ ＩＶ−６７（工業技術院
生命工学工業技術研究所に平成６年９月２７日に寄託；
微工研菌寄第Ｐ−１４５６１号。平成７年９月２５日に
原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託へ移管；ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５２４０）が産生するモノクローナル抗体
（以下、モノクローナル抗体６７という）は、ＩＶ型コ
ラーゲン高分子画分に対して特異的に反応することが見
出だされた。そのため、モノクローナル抗体６７の免疫
原中にＩＶ型コラーゲン高分子画分が存在したことが推
測されたが、特開平８−１０００００号公報に記載の免
疫原の精製法では、ＩＶ型コラーゲン高分子画分が必ず
しも取得できなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】肝臓の線維化を進行さ
せるのは、コラーゲンの合成と代謝のバランスが崩壊
し、ＩＶ型コラーゲンが異常に合成されることが原因で
あることが明らかとなっている。従って、肝臓の線維化
の進行をより直接的に観察する方法としては、肝疾患の
進行と共に著しく増加し、ＩＶ型コラーゲン合成を直接
反映したＩＶ型コラーゲン高分子画分のみを特異的に測
定し、かつＩＶ型コラーゲンの分解産物であると考えら
れる７Ｓドメインまたはより低分子のＩＶ型コラーゲン
を同時に測定することがない方法が好ましい。それによ
り鋭敏でかつ肝臓の線維化初期段階におけるＩＶ型コラ
ーゲン合成亢進を検出することが可能になる。

【００１０】本発明の目的は、このＩＶ型コラーゲン高
分子画分を取得し、これを特異的に測定する方法を提供
し、ＩＶ型コラーゲン高分子画分を測定することによ
り、肝線維化段階をより鋭敏でかつ詳細に判定できる方
法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題に
関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本
発明は、以下の性質を有することを特徴とするＩＶ型コ
ラーゲン高分子画分である；ａ．ＩＶ型コラーゲン７Ｓ
ドメインより高い分子量を有する、ｂ．その構造中に７
Ｓドメインを有する、ｃ．ペプシン加水分解により可溶
化したコラーゲン溶液を、１．２Ｍ以下の食塩で塩析
し、沈殿物を再溶解後、前回の塩濃度以下で再度塩析
し、回収した上清に含まれる。

【００１２】また本発明は、ペプシン加水分解により可
溶化したコラーゲン溶液を、１．２Ｍ以下の食塩で塩析
し、沈殿物を再溶解後、前回の塩濃度以下で再度塩析
し、上清を回収してＩＶ型コラーゲン高分子画分を得る
ことを特徴とする、ＩＶ型コラーゲン高分子画分の製造
法である。

【００１３】また本発明は、前述のＩＶ型コラーゲン高
分子画分に特異的な抗体と、試料中のＩＶ型コラーゲン
高分子画分を反応させることを特徴とする、ＩＶ型コラ
ーゲン高分子画分の測定法である。

【００１４】また本発明は、前述のＩＶ型コラーゲン高
分子画分に特異的な抗体を含有することを特徴とする、
ＩＶ型コラーゲン高分子画分測定に用いられるキットで
ある。

【００１５】さらに本発明は、上述の測定法を用いるこ
とを特徴とする、肝臓疾患における肝線維化度の判定法
である。

【００１６】また本発明は、ａ．試料中のＩＶ型コラー
ゲン高分子画分を測定し、ｂ．健常人のＩＶ型コラーゲ
ン高分子画分を測定し、ｃ．ａとｂとの比を測定するこ
とを特徴とするＩＶ型コラーゲン高分子画分の測定法で
ある。

【００１７】また本発明は、このようにして求めた比か
ら、肝線維化度を判定する方法である。以下、本発明を
さらに詳細に説明する。

【００１８】本発明によるＩＶ型コラーゲン高分子画分
は、ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインより高い分子量を有
する。これはゲル濾過を行った場合、ＩＶ型コラーゲン
高分子画分は、ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインより常に
先に溶出されることから確認された。またその構造中に
７Ｓドメインを有することは、市販のＩＶ型コラーゲン
７Ｓドメイン測定キット（ＩＶ型コラーゲン・７Ｓキッ
ト、日本ＤＰＣコーポレーション製；以下キット（Ａ）
という）に対し反応性を有することから確認された（Ｉ
Ｖ型コラーゲン・７Ｓキット取扱説明書 日本ＤＰＣコ
ーポレーション；Ｙａｍａｄａら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５、ｐ．４６７−４７０、１９９
２；Ｒｉｓｔｅｌｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｖｏｌ．１０８、ｐ．２３９−２５０、１９８０）。

【００１９】そして本発明のＩＶ型コラーゲン高分子画
分は、ペプシン加水分解により可溶化したコラーゲン溶
液を、１．２Ｍ以下の食塩で塩析し、沈殿物を再溶解
後、前回の塩濃度以下で再度塩析し、回収した上清に含
まれるものである。

【００２０】本発明で使用されるペプシン加水分解によ
る可溶化コラーゲン溶液には特に限定はなく、常法によ
り調製することができる。例えば、Ｓａｇｅらの方法
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４巻１９号、ｐ．９８
９３−９９００，１９７９）に従って得ることができ
る。また１．２Ｍ以下の食塩による塩析の前に、必要に
応じて適宜コラーゲン溶液の精製を行ってもよい。この
１．２Ｍ以下の食塩による塩析は、好ましくは０．５〜
１．０Ｍ、さらに好ましく０．６〜０．８Ｍの食塩によ
る塩析である。この塩析により得た沈殿物を再溶解後、
続いて前回の塩濃度以下で再度塩析し、今度は上清を回
収する。回収した上清からＩＶ型コラーゲン高分子画分
を取得する方法には特に限定はなく、必要に応じ、適宜
塩析、再溶解、透析、カラムクロマトグラフィー（ＤＥ
ＡＥ−セファロース、ゲル濾過）などの精製を行えばよ
い。特にゲル濾過により７Ｓドメインより先に溶出され
る画分を得ることにより、ＩＶ型コラーゲン高分子画分
を精製することが好ましい。

【００２１】従来のＩＶ型コラーゲンの精製は、前述の
Ｓａｇｅらの方法に準拠する場合が多く、それによると
ペプシン加水分解により可溶化したコラーゲン溶液を
０．７Ｍ食塩で塩析したときに、本発明とは異なり沈殿
物ではなく上清を回収する方法であった。しかし本発明
では、ペプシン加水分解により可溶化したコラーゲン溶
液を、１．２Ｍ以下の食塩で塩析したときの沈殿物を回
収することにより、より高分子の、ほとんど完全な形を
保持したＩＶ型コラーゲンを得ることができる。そして
本発明では、続いて前回の塩濃度以下で再度塩析し、Ｉ
Ｖ型コラーゲン高分子画分を含む上清を回収するのであ
る。

【００２２】本発明によるＩＶ型コラーゲン高分子画分
の測定法は、ＩＶ型コラーゲン高分子画分に特異的な抗
体と、試料中のＩＶ型コラーゲン高分子画分を反応させ
ることを特徴とするものである。

【００２３】ここで使用される抗体は、ＩＶ型コラーゲ
ン高分子画分に対し特異的に反応するものであれば特に
限定はなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
のいずれでもよい。また抗体の製法には特に限定はな
く、ＩＶ型コラーゲン高分子画分を免疫原として製造し
てもよく、また遺伝子工学的な手法を用いて製造しても
よい。ＩＶ型コラーゲン高分子画分に対して特異的に反
応するモノクローナル抗体としてモノクローナル抗体６
７を例示することができる。このモノクローナル抗体
は、前述のように、ハイブリドーマＣＯＬ ＩＶ−６７
（工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６年９月２
７日に寄託；微工研菌寄第Ｐ−１４５６１号。平成７年
９月２５日に原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託へ
移管；ＦＥＲＭ ＢＰ−５２４０）から産生されるもの
である。

【００２４】ＩＶ型コラーゲン高分子画分に特異的な抗
体と、試料中のＩＶ型コラーゲン高分子画分を反応させ
る方法には特に限定はなく、公知の免疫反応系を用いる
ことができる。例えばサンドイッチ測定法、競合法など
をあげることができ、具体的には、特開平８−１０００
００号公報に記載のモノクローナル抗体６７とＩＶ型コ
ラーゲンに対するポリクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチ測定系を例示することができる。

【００２５】本発明の測定法に使用される試薬は、キッ
ト化することができる。このキットは、試薬としてＩＶ
型コラーゲン高分子画分に特異的な抗体を含有するもの
であり、それを試料中のＩＶ型コラーゲン高分子画分と
反応させることににより測定を行うことができるもので
ある。

【００２６】本発明では、このようにＩＶ型コラーゲン
高分子画分に特異的な抗体と、試料中のＩＶ型コラーゲ
ン高分子画分とを反応させ、ＩＶ型コラーゲン高分子画
分を検出することにより、肝臓疾患における肝線維化度
の判定を行うことができる。前述のように肝臓の線維化
は、コラーゲンの合成と代謝のバランスが崩壊し、ＩＶ
型コラーゲンが異常に合成されることが原因であること
が明らかとなっている。従って肝線維化の進行をより直
接的に観察するためには、ＩＶ型コラーゲンの分解産物
と考えられる７Ｓドメインまたはより低分子のＩＶ型コ
ラーゲンを測定するよりも、コラーゲン合成を直接的に
反映していると考えられ、かつ肝硬変において著しく増
加するＩＶ型コラーゲン高分子画分を測定することが重
要である。

【００２７】現在、肝臓線維化の程度を示すものとして
新犬山分類（Ｃ型肝炎研究の進歩、肝炎ウイルスの変
異、犬山分類の再検討、犬山シンポジウム記録刊行会編
集、中外医学社、１９９６、ｐ．１８３−１８８）があ
り、Ｆ０；線維化なし、Ｆ１；門脈域の線維性拡大によ
る軽度の線維化、Ｆ２；線維性架橋形成、Ｆ３；小葉の
ひずみを伴う線維性架橋形成、及びＦ４；肝硬変と分類
される。これら各段階の患者血清中のＩＶ型コラーゲン
高分子画分を測定すると、段階が進むに従いすなわち肝
線維化の進行に伴い測定値が上昇することが明らかとな
った。従って本発明により血中のＩＶ型コラーゲン高分
子画分を測定することにより、肝臓線維化度の鑑別・判
定を行うことができる。

【００２８】また本発明では、ａ．試料中のＩＶ型コラ
ーゲン高分子画分を測定し、その一方でｂ．健常人のＩ
Ｖ型コラーゲン高分子画分を測定し、ａとｂとの比を測
定することを特徴とするＩＶ型コラーゲン高分子画分の
測定法である。このときのＩＶ型コラーゲン高分子画分
の測定法には特に限定はないが、ＩＶ型コラーゲン高分
子画分を特異的に測定することが好ましく、本発明のよ
うにＩＶ型コラーゲン高分子画分に特異的な抗体を用い
て測定することがさらに好ましい。

【００２９】このａとｂとの比を求めることにより肝線
維化度をより明確に判定することができる。例えばａ／
ｂという値を求めた場合、前述の新犬山分類の段階が進
むに従い、即ち肝線維化の進行に伴い、その値が大きく
上昇する。前述のようにＩＶ型コラーゲンとしては、３
つの分子種が存在することが知られている。ＩＶ型コラ
ーゲンとしてこれらの分子種の混合物を測定し、健常人
のＩＶ型コラーゲンと試料中のＩＶ型コラーゲンとの比
をとるよりも、本発明のようにＩＶ型コラーゲン高分子
画分に着目し、高分子画分の比すなわちａ／ｂを測定す
る方が、肝線維化の進行に伴い値の上昇比率が大きい。
従って、ａ／ｂを求めることにより、肝臓の線維化度の
鑑別・判定をよりよく行うことができる。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、より生体内存在様式に
近い、肝臓のＩＶ型コラーゲン合成を直接反映している
といわれるＩＶ型コラーゲン高分子画分を得ることがで
きる。一般に肝臓の線維化発症初期においてまずコラー
ゲンの合成が増加し、続いて分解の上昇が起きると考え
られており、本発明の測定法によれば初期のコラーゲン
合成の増加を検出することができ、それだけ早期に治療
を開始することが可能となり、治療効果が大きい。特に
インターフェロン療法は、慢性肝炎のときに有効である
が、既に肝硬変となった場合には無効である。また肝線
維化度が低いときほどインターフェロン療法が有効であ
る（特開平８−３３４５１３号公報など）。このように
早期の線維化を発見することは重要であり、本発明によ
る測定系は早期の線維化発見に有効である。インターフ
ェロン療法において、インターフェロン使用の可否の境
界線は、新犬山分類の主にＦ２とＦ３の間にあるため、
本発明のように特にＦ２とＦ３とを区別しうる測定法は
重要である。また本発明による測定系はキット化するこ
とができる。

【００３１】また本発明は、コラーゲン合成の増加を検
出するのに有効なばかりでなく、インターフェロンなど
による治療効果の判定にも有効である。すなわち従来の
測定法では、治癒が始まりコラーゲン分解量が上昇した
としても測定値は高値となるが、本発明の方法によれ
ば、コラーゲン合成を検出するため、治癒が始まった時
点でその測定値は低下してくるものと考えられ、必要以
上の治療・投薬を防ぐことが可能である。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を記述する。しか
し、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではな
い。なお、以下の実施例で使用したモノクローナル抗体
６７及びＩＶ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体
は、特開平８−１０００００号公報に記載のものであ
る。

【００３３】実施例１ 抗原ヒトＩＶ型コラーゲンの調製 市販キット（アボット社製）を用いてＨＢＶ、ＨＣＶお
よびＨＩＶ−１／２陰性を確認した２１個のヒト満期胎
盤（凍結保存）を解凍し、遠心により血液成分を除いた
後、これをミートチョッパーで細断した湿重量６，５０
０ｇを原料とした。これを４倍量（Ｗ／Ｖ）の１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−３Ｎａに懸濁し、４℃において２０時間撹拌し
た。次いでＢｅｃｋｍａｎ ＪＳ−４．２ローターを用
いて４℃下で４２００回転、２０分間遠心して沈澱を集
めた。さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ
７．５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ−３Ｎａを用いて洗浄操作
を３回繰り返した。続いて、４倍量（Ｗ／Ｖ）の５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，１．０Ｍ
ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ−３Ｎａおよび０．５Ｍ
酢酸による洗浄を同様にして４回ずつ繰り返し行い、洗
浄前処理胎盤組織１３Ｋｇを得た。

【００３４】この洗浄前処理胎盤組織１，２００ｇを
０．５Ｍ酢酸に懸濁し、容積を４，５００ｍｌに合わせ
た後、６ｇのペプシン（シグマ社製）を加えて１２０時
間、４℃で撹拌して加水分解を行った。加水分解液を、
４℃下で１５，０００×Ｇ、２時間遠心して得られた上
清に０．５Ｍ酢酸を加え、容積を再び４，５００ｍｌに
調製し、この液を撹拌しながら５２６ｇの食塩を加え
て、食塩濃度を２．０Ｍに合わせた後、更に２０時間、
４℃で撹拌して可溶化コラーゲン画分を沈澱させた。こ
の塩析物を１５，０００×Ｇで２時間、４℃で遠心して
得られた沈澱を、０．５Ｍ酢酸に懸濁し、４℃にて２０
時間撹拌しながら溶解した。これを４℃にて１５，００
０×Ｇ、２時間遠心し、得られた上清の蛋白質濃度を
０．５Ｍ酢酸で２．０ｍｇ／ｍｌに調整した。なお、蛋
白質濃度はＢＳＡ標準品（バイオラッド社製）を標準と
したローリー法で決定した。

【００３５】上記の可溶化コラーゲン溶液に、終濃度が
０．７Ｍとなるように撹拌しながら食塩を加え、更に４
℃で２０時間撹拌した。前述のＳａｇｅらの文献によれ
ば、ＩＶ型コラーゲンはこのとき上清側に回収される
が、ここではより生体内のＩＶ型コラーゲンの存在様式
に近いかたちのものを得るために、１５，０００×Ｇ、
２時間、４℃で遠心して得た沈澱画分を回収し、これを
再び０．５Ｍ酢酸に懸濁し、４℃で２０時間撹拌して溶
解してから、上と同条件で遠心して上清を得た。この上
清の蛋白質濃度を０．５Ｍ酢酸で２．０ｍｇ／ｍｌに合
わせた後、終濃度が再び０．７Ｍとなるように撹拌しな
がら食塩を加え、更に４℃で２０時間撹拌後、同様に遠
心して得た上清に更に食塩を加えて終濃度を１．８Ｍに
合わせ、４℃で２０時間撹拌した。

【００３６】これを４℃で１５，０００×Ｇ、２時間遠
心して得た沈澱を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，
ｐＨ７．５，１．０Ｍ ＮａＣｌに懸濁し、ｐＨを１．
０ＭＮａＯＨで７．０に合わせ、４℃で２時間撹拌溶解
してから、４℃で５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐ
Ｈ７．５，１．０Ｍ ＮａＣｌに対して一晩透析した。
透析液を４℃下で１００，０００×Ｇ、３０分間遠心し
て上清を得て、蛋白質濃度を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液，ｐＨ７．５，１．０Ｍ ＮａＣｌにて２．０
ｍｇ／ｍｌに合わせた後、終濃度が２．０Ｍとなるよう
に撹拌しながら食塩を加え、更に４℃で２０時間撹拌
し、再び上述の条件で遠心して沈澱を得た。

【００３７】これを０．１Ｍ酢酸に溶解し、０．１Ｍ酢
酸に対して４℃で一晩透析後、４℃で１００，０００×
Ｇ、３０分間遠心した。得られた上清の蛋白質濃度を
０．１Ｍ酢酸で１．０ｍｇ／ｍｌに合わせた後、終濃度
が０．２Ｍとなるように撹拌しながら食塩を加え、更に
４℃で２０時間撹拌してから、４℃において１００，０
００×Ｇ、３０分間遠心して上清を得て、ここに終濃度
が０．７Ｍとなるように撹拌しながら食塩を加え、更に
４℃で２０時間撹拌後、同様に遠心して得た沈澱を再
び、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，
１．０Ｍ ＮａＣｌに懸濁した。

【００３８】ｐＨを１．０Ｍ ＮａＯＨで７．０に合わ
せた後、４℃で２時間撹拌溶解し，この溶液を４℃で一
晩５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，
１．０Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。この透析液を、
４℃で１００，０００×Ｇ、３０分間遠心して得られた
上清の蛋白質濃度を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液，ｐＨ７．５，１．０Ｍ ＮａＣｌを用いて１．０ｍ
ｇ／ｍｌに合わせた後、終濃度が１．３Ｍとなるように
撹拌しながら食塩を加え、更に４℃で２０時間撹拌し
た。これを遠心して得た上清に、終濃度が２．０Ｍとな
るように撹拌しながら食塩を加え、更に２０時間、４℃
で撹拌後、同様に遠心して得た沈澱を１０ｍＭ酢酸に溶
解し、次いで、１０ｍＭ酢酸に対して４℃で一晩透析し
たものを３０分間、１００，０００×Ｇ、４℃で遠心し
た。

【００３９】得られた上清の蛋白質濃度を１０ｍＭ酢酸
で１．０ｍｇ／ｍｌに合わせた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．６，２０ｍＭ ＮａＣｌ，
２．０Ｍ尿素に対して４℃で２０時間透析し、透析後の
液を４℃で１００，０００×Ｇ、３０分間遠心した上清
を、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，
２．０Ｍ尿素に対して４℃で２０時間透析した。透析後
の液を４℃で１００，０００×Ｇ、３０分間遠心した上
清を、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，
２．０Ｍ尿素で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅに吸着させ、平衡化緩衝液で３カラム容積分洗った
後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出さ
せ、２３０ｎｍでの吸光度を測定してピークに相当する
溶出液を集めた。これを１０ｍＭ酢酸に透析後、４℃下
１００，０００×Ｇにて３０分間遠心し、上清にＩＶ型
コラーゲン高分子画分を有するヒトＩＶ型コラーゲン
（１５０ｍｇ）を得た。

【００４０】実施例２ ヒトＩＶ型コラーゲン高分子画分の精製 上記の方法によって取得されたＩＶ型コラーゲンの中か
ら、ＩＶ型コラーゲン高分子画分を取得するために、分
子量分画を行った。

【００４１】実施例１で得たヒトＩＶ型コラーゲン２５
ｍｇを０．１Ｍ酢酸に透析した後、終濃度が４．５Ｍと
なるように食塩を加え、４℃で一晩撹拌して生成した沈
澱を４℃で１００，０００×Ｇ、３０分間遠心して得
た。これを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ
７．５，１．０Ｍ ＣａＣｌ₂に溶解し、次いで、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，１．０Ｍ
ＣａＣｌ₂に対して２５℃にて一晩透析後、４５℃、
３０分間加熱処理を行った。加熱処理後の溶液を、２５
℃で１００，０００×Ｇ、３０分間遠心し、得られた上
清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．
５，１．０Ｍ ＣａＣｌ₂で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓ
ｅ６カラムに供し、室温にてゲル濾過を行った。ボイド
に溶出された画分（最初のピークの前まで）を収集し、
これを１０ｍＭ酢酸を用いて透析し、４℃にて１００，
０００×Ｇ、３０分間遠心した上清をヒトＩＶ型コラー
ゲン高分子画分（３ｍｇ）とした。

【００４２】実施例３ ＩＶ型コラーゲン高分子画分測定系の構築 特開平８−１０００００号公報実施例４に従い、モノク
ローナル抗体６７を用いた本発明の測定系を構築した。
即ち、固相にポリスチレンビーズ、標識にアルカリ性ホ
スファターゼ、固相化抗体にモノクローナル抗体６７、
標識化抗体に抗ＩＶ型コラーゲン・ポリクローナル抗体
を用いたサンドイッチ測定系を構築した。この測定系に
おいて、実施例２で得た種々の濃度のＩＶ型コラーゲン
高分子画分を測定して得た検量線を図１に示す。図１か
らこの測定系がＩＶ型コラーゲン高分子画分の測定系で
あることが確認された。

【００４３】実施例４ 本発明による測定系及び市販キット（Ａ）の、７Ｓドメ
イン及びＩＶ型コラーゲン高分子画分に対する反応性の
評価 モノクローナル抗体６７をプレートに固相化し、各ウェ
ルに７Ｓドメイン（市販キット（Ａ）のキャリブレー
タ）または実施例２で得たＩＶ型コラーゲン高分子画分
を種々の濃度で加え抗原抗体反応を行い、洗浄後、ＨＲ
Ｐ標識ウサギ抗ＩＶ型コラーゲンポリクローナル抗体を
加え、結合物中のＨＲＰ量を定量し、反応性の違いを検
討した。結果を図２に示す。図中、縦軸は吸光度、横軸
は抗原濃度を示す。図中、黒丸はＩＶ型コラーゲン高分
子画分、三角は７Ｓドメインをそれぞれ用いた場合であ
る。この結果より、本発明による測定系は、７Ｓドメイ
ンに比べてＩＶ型コラーゲン高分子画分に対する反応性
が高く、より特異的にＩＶ型コラーゲン高分子画分を検
出することができることが明らかとなった。一方、市販
キット（Ａ）において同様の抗原を用いて反応を行った
結果を図３に示す。図中、黒丸はＩＶ型コラーゲン高分
子画分、三角は７Ｓドメインをそれぞれ用いた場合であ
る。また縦軸のＢ／Ｂ０は、抗原を添加した場合の抗原
抗体反応による結合物中の放射性同位体のカウントと抗
原を添加しなかった場合の結合物中の放射性同位体のカ
ウントとの比である。図３から明らかなように、市販キ
ット（Ａ）では、ＩＶ型コラーゲン高分子画分、７Ｓド
メインともほぼ同等の反応性を示すことが示された。

【００４４】実施例５ ヒト血清のゲル濾過クロマトグラフィーによるフラクシ
ョンへの反応性 ２０℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した肝
硬変患者血清の上清０．２ｍｌを、１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌで
平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ１０／３０を用い
て室温で分離し、取得した各フラクションについて、実
施例４の本発明による測定系、市販キット（Ａ）および
市販のＩＶ型コラーゲン測定キット（パナッセイＩＶ・
Ｃ 第一化学薬品、以下市販キット（Ｂ）とする）で反
応性を比較検討した。その結果を図４に示す。図中、四
角は２８０ｎｍにおける吸光度、黒丸は本発明の測定
系、白丸はキット（Ａ）、三角はキット（Ｂ）の結果を
それぞれ示す。

【００４５】図４に示すとおり、前述のＳａｇｅらの文
献に記載のように、市販キット（Ａ）では、ＩＶ型コラ
ーゲン高分子画分及び７Ｓドメイン（分子量２３Ｋ）の
両方を検出するため、ピークは２峰性を示した。また市
販キット（Ｂ）では、７Ｓドメインよりも分子量の小さ
い分子のみを認識していることがわかった。これに対し
て、本測定系においては、分子量が７Ｓドメインよりも
大きいＩＶ型コラーゲン高分子画分を特異的に検出して
おり、これは市販キット（Ａ）のピークの１つと一致し
た。このＩＶ型コラーゲン高分子画分のピークは、肝臓
で合成されるＩＶ型コラーゲン量を反映していることか
ら、ＩＶ型コラーゲン高分子画分を特異的に検出する本
発明の測定法は、ＩＶ型コラーゲンの生成をよりよく反
映した測定系であるといえる。

【００４６】実施例６ ＩＶ型コラーゲン高分子画分を特異的に検出する本発明
の測定系の臨床例を用いた評価 肝臓疾患患者より血清を取得し、実施例３の本発明の測
定系を用いてＩＶ型コラーゲン高分子画分を測定し、肝
生検の病理診断によって下された肝線維化の程度と比較
した。対象は１６４名で、内訳は肝臓線維化の度合を示
す新犬山分類にて分類したとき、Ｆ０＋Ｆ１：４７例、
Ｆ２：４３例、Ｆ３：２７例、Ｆ４：４７例である。こ
れら各群の平均値、標準偏差を表１に示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】表１から、肝線維化の進行に伴い、即ち、
Ｆ０＋Ｆ１からＦ４に向かうに従い、本発明によるＩＶ
型コラーゲン高分子画分の測定値が上昇することが分か
った。さらに各群間で有意差があるかどうかをＦｉｓｈ
ｅｒの検定により検定を行った。結果を表２に示す。

【００４９】

【表２】

【００５０】表２から、Ｆ０＋Ｆ１とＦ２の間は有意差
が認められなかったが、他の群間すなわち、Ｆ０＋Ｆ１
とＦ３の間、Ｆ０＋Ｆ１とＦ４の間、Ｆ２とＦ３の間、
Ｆ２とＦ４の間、Ｆ３とＦ４の間に有意差は認められ
た。従って本発明の測定系により、これらの群間の鑑
別、即ち肝線維化程度の判定を行うことができる。特に
Ｆ２とＦ３との間は従来の測定法では鑑別することがで
きず、本発明による測定系で初めて鑑別することができ
るようになった。

【００５１】さらに、Ｆ３とＦ４（従来の慢性活動性肝
炎と肝硬変の鑑別にあたる）のＲＯＣ曲線を作成したと
ころ、図５のように１９ｎｇ／ｍｌをカットオフとした
とき特異性８２．１％、感度８０．９％であり、前述の
Ｍｕｒａｗａｋｉらの報告に記載のキット（Ａ）の値
（特異性８８％、感度８３％、カットオフ９ｎｇ／ｍ
ｌ）とほぼ同等の性能を示した。

【００５２】実施例７ 臨床例を用いた測定系の評価（その２） 肝臓疾患患者より血清を取得し、実施例３の本発明によ
る測定または市販キット（Ａ）を用いた測定を行った。
対象は計１９９名で、内訳は健常人：３３例、Ｆ０＋Ｆ
１：４７例、Ｆ２：４３例、Ｆ３：２９例、Ｆ４：４７
例である。これら各群の平均値、標準偏差を表３に示
す。

【００５３】

【表３】

【００５４】表３より明らかなように、本発明の測定法
は、市販キット（Ａ）による測定よりも、肝線維化の進
展に伴い、測定値がより上昇することが示された。これ
は本発明の測定法が市販キット（Ａ）よりもＩＶ型コラ
ーゲン高分子画分を特異的に検出しているためと考えら
れる。

【００５５】さらに表３の結果をもとに、各群間の測定
値に有意差があるかどうかの確認をｔ検定にて実施し
た。本発明による結果を表４に、市販キット（Ａ）によ
る結果を表５に示す。

【００５６】

【表４】

【００５７】

【表５】

【００５８】ｔ検定の結果から、本発明及び市販キット
（Ａ）共にＦ０＋Ｆ１群とＦ２群の検定以外はすべて有
意差が認められた。またＦ０＋Ｆ１群とＦ２群との比較
において、本発明と市販キット（Ａ）とでｐ値を比較す
ると、本発明による測定の方がｐ値がはるかに小さく、
本発明による測定の方がＦ０＋Ｆ１群とＦ２群との病態
差をより鋭敏に反映していることが示された。さらにＦ
２群とＦ３群との鑑別においても同様に、本発明のｐ値
は０．０００１未満であるが、市販キット（Ａ）では、
０．０００９であり、本発明の方がより鋭敏にＦ２群と
Ｆ３群との病態差を反映していることが示された。これ
らの結果から、本発明によるＩＶ型コラーゲン高分子画
分の測定は、市販キッと（Ａ）と比べて肝線維化の進展
度合をより的確に反映し、生検によることなく肝線維化
の進行度を示す指標を与えることが明らかとなった。

【００５９】実施例８ 臨床例を用いた測定系の評価（その３） 実施例７表３の値をもとにして、本発明の測定法による
ａ．各群の試料中のＩＶ型コラーゲン高分子画分と、
ｂ．健常人のＩＶ型コラーゲン高分子画分との比ａ／ｂ
を求めた。また市販キット（Ａ）を用いて測定した場合
のａ´．各群の測定値と、ｂ´．健常人の測定値との比
ａ´／ｂ´を求めた。結果を表６に示す。

【００６０】

【表６】

【００６１】表６から明らかなように、市販キット
（Ａ）から求めた比ａ´／ｂ´と比較して、本発明によ
る比ａ／ｂの方が、肝線維化の進展に伴い値がより大き
く上昇し、肝線維化度の進展をより反映していることが
わかった。従って本発明による比ａ／ｂを求める方が肝
線維化度の鑑別・判定を早期から明確に行うことができ
る。これは本発明による測定では、ＩＶ型コラーゲン高
分子画分を特異的に検出するのに対し、市販キット
（Ａ）による測定では、実施例４，５で示したようにＩ
Ｖ型コラーゲン高分子画分及び７Ｓドメインの両方とも
検出してしまうことが原因と考えられる。従ってこのよ
うな比を測定する場合には、ＩＶ型コラーゲン高分子画
分を特異的に検出し、その比を求めることが重要である
ことが分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で得られた、本発明による測定系の検
量線を示す図である。

【図２】実施例４で得られた、本発明による測定系の各
種抗原に対する反応性を示す図である。

【図３】実施例４で得られた、市販キット（Ａ）の各種
抗原に対する反応性を示す図である。

【図４】実施例５で得られた、本発明の測定系及び市販
キット（Ａ），（Ｂ）のゲル濾過各フラクションへの反
応性を示す図である。

【図５】実施例６で得られたＲＯＣ曲線を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 俊雄 神奈川県横浜市泉区和泉町6212−３グリー ンハイムいずみ野８−304 (72)発明者 丸尾 直子 神奈川県横浜市西区戸部本町49−15−408

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の性質を有することを特徴とするＩＶ
   型コラーゲン高分子画分； ａ．ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインより高い分子量を有
   する ｂ．その構造中に７Ｓドメインを有する ｃ．ペプシン加水分解により可溶化したコラーゲン溶液
   を、１．２Ｍ以下の食塩で塩析し、沈殿物を再溶解後、
   前回の塩濃度以下で再度塩析し、回収した上清に含まれ
   る。
2. 【請求項２】ペプシン加水分解により可溶化したコラー
   ゲン溶液を、１．２Ｍ以下の食塩で塩析し、沈殿物を再
   溶解後、前回の塩濃度以下で再度塩析し、上清を回収し
   てＩＶ型コラーゲン高分子画分を得ることを特徴とす
   る、ＩＶ型コラーゲン高分子画分の製造法。
3. 【請求項３】請求項１に記載のＩＶ型コラーゲン高分子
   画分に特異的な抗体と、試料中のＩＶ型コラーゲン高分
   子画分を反応させることを特徴とする、ＩＶ型コラーゲ
   ン高分子画分の測定法。
4. 【請求項４】請求項１に記載のＩＶ型コラーゲン高分子
   画分に特異的な抗体を含有することを特徴とする、ＩＶ
   型コラーゲン高分子画分測定に用いられるキット。
5. 【請求項５】請求項３に記載の測定法を用いることを特
   徴とする、肝線維化度の判定法。
6. 【請求項６】ａ．試料中のＩＶ型コラーゲン高分子画分
   を測定し、 ｂ．健常人のＩＶ型コラーゲン高分子画分を測定し、 ｃ．ａとｂとの比を測定する ことを特徴とするＩＶ型コラーゲン高分子画分の測定
   法。
7. 【請求項７】請求項６に記載の測定法を用いることを特
   徴とする、肝線維化度の判定法。