JPWO2002042769A1 - 抗ラミニン−１抗体の測定法およびその応用 - Google Patents
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Abstract
ヒトから採取した血清または血漿サンプルをラミニン−１またはそのフラグメントと反応させた後、サンプル中のラミニン−１に対する自己抗体である抗ラミニン−１抗体がラミニン−１に結合したか否かを測定してサンプル中の抗ラミニン−１抗体を検出することにより、習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患を診断することが出来る。
Description
技術分野
本発明は、ラミニン−１に対する自己抗体（抗ラミニン−１抗体）の測定法、該方法を実施するためのキット、および習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の診断などの臨床への応用に関するものである。
背景技術
習慣流産とは、妊娠はするものの、自然流産あるいは死産を反復することを意味する。この習慣流産の原因は多岐にわたり、免疫機能の異常もその１つと考えられている。
自己免疫的原因による習慣流産を診断する手段としては、自己抗体である抗カルジオリピン抗体（最近、この自己抗体の抗原はカルジオリピンとβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）との複合体であることが明らかとされ、β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体と称されている）を測定する方法などが知られている。
しかしながら、上記方法の信頼性は完璧ではないので、測定の結果が陰性であっても習慣流産の可能性は否定できなかった。また、他のマーカーを組み合わせて測定したとしても、満足する結果は得られていない。そのため、既存のマーカーとは異なる新たなマーカーの開発が望まれていた。
また、不妊症、不育症、子宮内膜症においても習慣流産と似たような状況であり、より簡便で信頼性の高いマーカーの開発が望まれていた。
ラミニンは基底膜内に存在する最も豊富な糖タンパク質で、ナイドジェン、ＩＶ型コラーゲンなどの基底膜のその他の成分と複合体を形成している。また、ラミニンは、通常、３本のポリペプチドがコイル状により合わさって非対称の十字型の構造をとり、多くのアイソフォームの存在が確認されている。すなわち、ラミニンを構成する３つのポリペプチドであるα鎖（〜４００ｋＤａ）、β鎖（〜２００ｋＤａ）およびγ鎖（〜２００ｋＤａ）の組み合わせによって様々なアイソフォームを形成することが可能であり、現在まで、少なくとも１２個のアイソフォームの存在が報告されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３７，６８５−７０１（１９９７）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４５，６０５−６１８（１９９９））。
たとえば、ラミニン−１（α１、β１、γ１）は腎臓、胎児脳、網膜、血管等に存在し、メロシン（＝ラミニン−２；α２、β１、γ１）は骨格筋、心臓、胎盤等に存在し、ｓ−ラミニン（＝ラミニン−３；α１、β２、γ１）は神経筋末端プレートの接合部の基底膜、血管内皮および糸球体基底膜に存在し、ｓ−メロシン（＝ラミニン−４；α２、β２、γ１）はＳｃｈｗａｎｎ細胞、胎盤などに存在し、カリニン／ナイセイン（＝ラミニン−５；α３、β３、γ２）とｋ−ラミニン（＝ラミニン−６；α３、β１、γ１）とｋｓ−ラミニン（＝ラミニン−７；α３、β２、γ１）は皮膚の基底膜に特有のものであることが明らかとなっている。
このようなラミニンあるいはそのフラグメントを検出することにより、肝線維症／肝硬変、アルコール性肝線維症、糖尿病性合併症、腎疾患、慢性多発関節炎、腫瘍、アルツハイマー症などの様々な疾患の診断に利用できる可能性があることが報告されている。
また、ラミニンに対する自己抗体である抗ラミニン抗体に関しても、抗ラミニン抗体が流産しやすいサルの血清から検出されること、抗ラミニン抗体を含む血清を培養したラットの胎児に添加すると、胎児の異常が起こること、抗ラミニン抗体をマウスに免疫することにより流産を誘導することができること等が報告（Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉ．，５１，７１１−７１８（１９８９）、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，４０，４７−５７（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６８１８−６８２２（１９９５）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１０，３４６−３５７（１９８３））されていることから、抗ラミニン抗体は流産を引き起こす原因の１つではないかと推測されている。
しかしながら、ヒトにおける抗ラミニン抗体の測定の意義は、血清には存在せず、尿中に特異的に存在する分子量２００ｋＤａのラミニンに対する自己抗体の測定が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断に利用できる可能性が報告（特開平８−３６９６６、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．，８（２），２７９−２９１（１９９５））されているだけで、習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の診断に使用できるか否かに関してはまったく示唆されていない。
発明の開示
本発明者らは、婦人科関連疾患における新たなマーカーとしてラミニンに注目し、鋭意検討を重ねた結果、種々のラミニンアイソフォームの中のラミニン−１（分子量：約９００ｋＤａ）に対する自己抗体である抗ラミニン−１抗体が習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の患者血清に特異的に存在し、この抗ラミニン−１抗体の測定が婦人科関連疾患の診断に有用であることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、サンプルをラミニン−１またはそのフラグメントと反応させた後、サンプル中の抗ラミニン−１抗体がラミニン−１またはそのフラグメントに結合したか否かを測定することからなる、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定法に関するものである。
また、本発明は、構成試薬としてラミニン−１またはそのフラグメントを含み、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキットに関するものである。
さらに本発明は、上記方法またはキットにより測定したサンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定値から婦人科関連疾患を検出する方法に関するものである。
発明を実施するための最良の形態
測定対象のサンプルとしては、抗ラミニン−１抗体を含有すると疑われるサンプルであれば特に制限されない。そのようなサンプルを具体的に例示すれば、ヒトの血液、血清、血漿などをあげることができ、特に血清及び血漿サンプルが好適である。
サンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定は、サンプルをラミニン−１と反応させた後、サンプル中の抗ラミニン−１抗体がラミニン−１に結合したか否かを測定することにより実施できる。
使用するラミニン−１としては、公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，９９３３−９９３７（１９７９））に従い癌細胞より調製したもの、あるいは市販のラミニン−１（旭テクノグラス社製）を使用することができる。
また、サンプル中の抗ラミニン−１抗体との反応性を失わない限りにおいて、ラミニン−１の酵素あるいは化学処理により得られるフラグメントあるいはそれをコードする遺伝子を用いたＤＮＡ組換え技術により製造した組換えフラグメント等であってもかまわない。このようなフラグメントとしては、例えばラミニン−α１鎖のＧドメイン（アミノ酸残基２１１１−３０６０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（３８）２９４５８−２９４６５（２０００））などが挙げられる。
ラミニン−１またはそのフラグメントの使用形態としては、固相化物もしくは標識化物の形態で使用することができる。
ラミニン−１またはそのフラグメントの固相化に使用できる担体の材質としては、ラミニン−１またはそのフラグメントとの結合性の高いものであれば特に制限されず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレンなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したものであってもかまわない。
担体の形状としては、マイクロタイタープレート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状などが例示され、測定法に応じて適宜選択することができる。
固相担体へのラミニン−１またはそのフラグメントの固相化は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法を用いて行えばよい。
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するために、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもかまわない。
また、標識化ラミニン−１またはそのフラグメントを調製する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金など）などを使用することができる。
ラミニン−１またはそのフラグメントの標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）に従って行えばよい。
このような固相化物及び／または標識化物を用いたサンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定は、サンプル中の自己抗体などの抗体の測定法として汎用されている方法に準じて行えばよく、たとえば、固相化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いたサンプル中の抗ラミニン−１抗体の具体的な測定手順は以下の通りである。
固相化ラミニン−１を用いた方法
（ａ）抗ラミニン−１抗体を含有する疑いのあるサンプルを、ラミニン−１またはそのフラグメントが固定化されてなる固相担体とインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、過剰のサンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を標識化された抗ヒトイムノグロブリン抗体とインキュベートし、そして
（ｄ）固相と液相を分離（ＢＦ分離）後、どちらかの相の標識量を測定して、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を算出する。
また、標識化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いたサンプル中の抗ラミニン−１抗体の具体的な測定手順は、たとえば以下の通りである。
標識化ラミニン−１を用いた方法
（ａ）抗ラミニン−１抗体を含有する疑いのあるサンプルを、標識されたラミニン−１またはそのフラグメントとインキュベートし、
（ｂ）抗ラミニン−１抗体と結合した標識化ラミニン−１またはそのフラグメントと未結合の標識化ラミニン−１またはそのフラグメントとを分離し、そして
（ｃ）どちらか一方の相の標識量を測定して、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を算出する。
また、抗ラミニン−１抗体を測定するためのキットは、キットの構成試薬としてラミニン−１またはそのフラグメントを含有していればよく、その他の構成試薬は、キットの採用する測定法に応じて適宜必要とされる試薬を添付すればよい。たとえば、固相化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いた抗ラミニン−１抗体測定用キットとしては、次のようなものを例示することができる。
▲１▼固相化ラミニン−１またはそのフラグメント
▲２▼標識化抗ヒトイムノグロブリン抗体
また、標識化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いた抗ラミニン−１抗体測定用キットとしては、次のようなものを例示することができる。
▲１▼標識化ラミニン−１またはそのフラグメント
▲２▼ＢＦ分離剤〔ＤＣＣ（デキストラン被覆活性炭）、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウムなど〕
さらに上記キットには、採用する測定法あるいは標識の種類などにより必要な試薬（サンプル希釈溶液、洗浄溶液、酵素基質溶液、反応停止液、標準抗体溶液など）を適宜添付することができる。
このようなキットを用い、上述した方法によりサンプル中の抗ラミニン−１抗体を測定し、健常人の測定値と比較し、その結果が健常人レベルよりも高い場合には習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の可能性大と判断し、精密検査を行うのが好ましい。
実施例
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）サンプル
流産経験のある女性（習慣流産）２０７人（平均年齢：３１．０±３．８歳、平均流産回数：２．７±１．１回）、健康な妊婦１００人（平均年齢：３０．７±４．５歳）及び妊娠していない健常者４０人（女性）（平均年齢：２９．６±５．１歳）から血液を採取し、サンプルとした。ただし、流産経験のある２０７人のうち、アレルギー疾患のある３０人のサンプルは測定から除外した。
（２）アッセイ
▲１▼β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体の測定
β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体のＥＬＩＳＡは松浦らの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３８８５−３８９１（１９９２））を多少変更して行った。すなわち、ポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−１：Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）にカルジオリピン（２．５μｇ／５０μｌ／ウエル）をコートし、１％ＢＳＡでブロッキング後、ヒトβ２−ＧＰＩ（１．０μｇ／５０μｌ）と１００倍希釈血清サンプル（５０μｌ）を各ウエルに添加し、よく撹拌後、室温で３０分間インキュベートする。
インキュベーション後、過酸化水素含有テトラメチルベンチジン溶液を添加して反応させた後、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線から抗カルジオリピン抗体の抗体価（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を算出する。
▲２▼ループス・アンチコアギュラントの測定（ｌｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ：ＬＡ）
トロンボプラスチンを部分的に活性化するための時間（ａＰＰＴ）を決定するためのリン脂質として脳ケファリンを使用し、非妊娠のコントロール血漿（５０μｌ）、標準血漿（５０μｌ）及び希釈した脳ケファリン（１００μｌ）を混合し、３７℃で３分間正確にインキュベートし、２５ｍＭ ＣａＣｌ２を１００μｌ添加し、凝血時間を測定する。
標準血漿とサンプル血漿を１：１で混合した時、延長された凝血時間（平均＋３ＳＤ、７．３７秒より長い）が元に戻らない場合、ＬＡは陽性と判断する。
▲３▼抗核抗体（ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＮＡ）と抗ＤＮＡ抗体の測定
公知の方法（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８９，１２９−１３３（１９９０））に従い、ＡＮＡはＨｅｐＧ２細胞スライドを用いた間接免疫蛍光法により測定し、抗ＤＮＡ抗体は市販のキットを用いて行った。
▲４▼抗ラミニン−１抗体の測定
ラミニン−１は、公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，９９３３−９９３７（１９７９））に従い調製した。
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−１Ｂ：Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）にラミニン−１（１０μｇ／ｍｌ）をコートし（５０μｌ／ウエル）、４℃で一夜インキュベート後、１０％牛胎児血清でブロッキング後、２００倍希釈血清サンプル（１００μｌ／ウエル）を添加し、室温で１時間インキュベートする。
インキュベーション後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗ヒトイムノグロブリン（ＩｇＧ／ＩｇＭ）抗体を添加し、室温で１時間インキュベートし、過酸化水素含有ｏ−フェニレンジアミン溶液を添加して反応させた後、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定する。測定値が妊娠していない健常者の血漿中の抗ラミニン−１抗体の平均＋ＳＤよりも大きい場合には、抗ラミニン−１抗体は陽性と判断する。
（３）結果
前記サンプルを測定した結果、習慣流産の女性から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）のレベルは、健康な妊婦及び妊娠していない健常者の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）レベルと比較して有意に高値を示した（Ｐ＝０．００４３、Ｐ＝０．００７３）（図１参照）。
また、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）は、習慣流産の１７７サンプル中、５５サンプルが陽性であり（３１．１％）、１２２サンプルが陰性であった（６８．９％）。また、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＭ）は、４９サンプルで陽性で（２７．７％）、１２８サンプルで陰性であった（７２．３％）。
正常出産の確率を解析した結果、表１に示すように、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）陽性の習慣流産における正常出産の確率は、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）陰性の習慣流産における正常出産の確率と比較して有意に低いことが明らかとなった。
また、抗ラミニン−１抗体が陽性の習慣流産と陰性の習慣流産との間には、妊婦の年齢、流産の回数などの有意な差はなかった。
習慣流産における抗ラミニン−１抗体と他の自己抗体との相関に関して解析した結果、表２に示すように、抗ラミニン−１抗体と他の自己抗体との間に有意な相関は見いだせなかった。また、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）陽性の習慣流産５５サンプルにおける自己抗体の出現率は、β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体（ａＣＬ）が１．８％（１／５５）、ＬＡが２０．０％（１１／５５）、抗ＤＮＡ抗体１４．５％（８／５５）および抗核抗体（ＡＮＡ）２１．８％（１２／５５）であった。
実施例２
実施例１記載の方法で、不妊症と抗ラミニン−１抗体との関連性を検討したところ、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）は、体外受精を行った不妊症患者５０サンプル中、１２サンプルが陽性であり（２４．０％）、３８サンプルが陰性であり（７６．０％）、健常人の数値と比較して有意に高い出現率を示した（Ｐ＝０．００８８）。
また、子宮内膜症を合併した不妊症患者（体外受精）における抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）の陽性率は、表３に示すように、７５％（８人中６名が陽性）と極めて高い値を示した。
実施例３
（１）サンプル
腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者５３人（平均年齢：３３．４±４．７歳、年齢範囲：２６〜４５歳）、人工受精と胚転移を受けた不妊症患者（ＩＶＦ）５０人（平均年齢：３４．１±４．４歳、年齢範囲：２３〜４５歳、人工授精を受けた平均回数：２．８±２．６回）及び妊娠していない健常者（女性）３９人（平均年齢：２９．６±５．１歳、年齢範囲：２２〜４１歳）から血漿を採取し、サンプルとした。ＩＶＦ患者については膣から卵母細胞を摘出する前日に血漿サンプルを採取した。これらの不妊症患者の臨床プロファイル（不妊原因）を表４に示した。ただし、不妊症患者の中にはその原因が不明である子宮異常あるいはホルモン異常の患者も含まれていた。ＩＶＦ患者５０人のうち８人は子宮内膜症であった。腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者５３人は、腹腔鏡検査または開腹検査により子宮内膜症患者とそうでない患者に分けられた。子宮内膜症患者の重症度をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｒｉｔｉｌｉｔｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＦＳ）による分類法の変法により分類した。即ち、子宮内膜症患者３４人のうち、７人がステージＩ（最小程度の症状）、６人がステージＩＩ（軽症）、１３人がステージＩＩＩ（中程度の症状）、８人がステージＩＶ（重症）であった。
（２）アッセイ
▲１▼抗ラミニン−１抗体の測定
実施例１の（２）▲４▼で記載した方法とほぼ同様の方法により、血漿サンプル中の抗ラミニン−１抗体を測定した。測定値が妊娠していない健常者の血漿中の抗ラミニン−１抗体の平均＋ＳＤよりも大きい場合には、抗ラミニン−１抗体は陽性と判断した。
▲２▼腫瘍抗原１２５（ＣＡ−１２５）の測定
市販品のラジオイムノアッセイキット（ＣＡ−１２５ ＩＩ ＩＲＭＡ ｋｉｔ；Ｃｅｎｔｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８４；４４：１０４８−５３）を用いてサンプル中のＣＡ−１２５を測定した。結果は標準曲線から得た。２０Ｕ／ｍｌ値をカットオフ値とした。なお、ＣＡ−１２５は子宮内膜症のマーカーとしても利用されている。
▲３▼ラミニン−α１鎖のＧドメインを用いた抗ラミニン−１抗体の測定
ラミニン−α１鎖のＧドメイン（アミノ酸残基＃２１１１―３０６０）をコードするプラスミドで形質転換されたチャイニーズ・ハムスター卵母細胞の培養液から、ハイトラップヘパリンアフィニティーカラムとＦＰＬＣシステムを用いてラミニン−α１鎖の組換えＧドメインを精製した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００；２７５：２９４５８−６５）。組換えＧドメインをポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ １Ｂ）にコートし（１μｇ／５０μｌ／ウエル）、４℃で一夜インキュベート後、ブロッキングした。２５倍希釈サンプル（１００μｌ／ウエル）をウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで実施例１の（２）▲４▼で記載した方法と同様の方法により、ラミニン−α１鎖の組換えＧドメイインに結合した抗ラミニン−１抗体を測定した。
（３）結果
▲１▼抗ラミニン−１抗体と不妊症の原因との関係
５０人のＩＶＦ患者を含む１０３人の不妊症患者と妊娠していない健常者３９人からのサンプルについて抗ラミニン−１抗体を測定し、不妊症の原因と抗ラミニン−１抗体レベルとの関係を分析した。得られた結果を表４に示した。表４から分かるように、抗ラミニン−１抗体陽性の患者と子宮内膜症との間には有意な相関関係があった。抗ラミニン−１抗体陽性患者３２人のうち２１人（６６％）が子宮内膜症であり、抗ラミニン−１抗体陰性患者７１人のうち２１人（３０％）（ｐ＝０．０００６３）が子宮内膜症であった。不妊症の他の原因と抗ラミニン−１抗体陽性患者との間には有意な相関関係は見られなかった。
図２に、妊娠していない健常者、子宮内膜症の不妊症患者および子宮内膜症でない不妊症患者から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）の測定結果を示した。図２から分かるように、不妊症患者（ｎ＝１０３）の抗ラミニン−１抗体レベルは、妊娠していない健常者（ｎ＝３９）のそれより有意に高値を示した（ｐ＝０．００２９）。不妊症患者１０３人のうち３２人（３１％）が抗ラミニン−１抗体陽性であった。子宮内膜症の不妊症患者の抗ラミニン−１抗体レベルは、妊娠していない健常者及び子宮内膜症でない不妊症患者のそれよりも有意に高値を示した（ｐ＜０．０００１）。
腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者５３人については、子宮内膜症患者の重症度と抗ラミニン−１抗体レベルとの関係を調べた。その結果を図３に示した。図３から分かるように、ステージＩＩまたはステージＩＩＩの子宮内膜症の不妊症患者の抗ラミニン−１抗体レベルは、ステージＩあるいはＩＶの患者のそれに比べてかなり高い値を示した。ステージＩＩまたはステージＩＩＩの患者のレベルは、子宮内膜症でない不妊症患者のそれよりも有意に高値を示した（それぞれｐ＝０．００７４とｐ＝０．００２５）。ステージＩおよびＩＶの患者のレベルは、子宮内膜症でない患者のそれとは有意には相違しなかった。ステージＩＩの不妊症患者６人のうち４人（６７％）及びステージＩＩＩの不妊症患者１３人のうち７人（５４％）が抗ラミニン−１抗体陽性であった。
▲２▼ＩＶＦ患者における子宮内膜症と抗ラミニン−１抗体およびＣＡ−１２５との関係
ＩＶＦ患者における子宮内膜症と抗ラミニン−１抗体およびＣＡ−１２５との関係を表５に示した。表５から分かるように、ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体陽性の頻度は、子宮内膜症を有する患者の方が子宮内膜症でない患者に比べて有意に高かった（子宮内膜症でない患者４２人のうち６人（１４％）が陽性であるのに対して、子宮内膜症を有する患者８人のうち６人（７５％）が陽性であった（ｐ＝０．００３）。子宮内膜症を有する患者とＣＡ−１２５の存在とは有意な関係は見られなかった（子宮内膜症でない患者４２人のうち１１人（２６％）がＣＡ−１２５陽性であるのに対して、子宮内膜症を有する患者８人のうち４人（５０％）がＣＡ−１２５陽性であった。ｐ＝０．１８）。
ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体とＣＡ−１２５との関係を表６に示した。表６から分かるように、ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体陽性とＣＡ−１２５陽性とは有意な相関関係が見られた（ｐ＝０．０２０）。しかし、図４に示すように、抗ラミニン−１抗体レベルとＣＡ−１２５値との間には相関関係が見られなかった（ｒ２＝０．０２５）。
▲３▼ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体のラミニン−１とラミニン−α１鎖のＧドメインとに対する交差反応性
ＩＶＦ患者５０人から採取したサンプルを用いて、抗ラミニン−１抗体がラミニン−α１鎖のＧドメインを認識できるかどうかを調べた。得られた結果を図５に示した。図５から分かるように、ＩＶＦ患者からのサンプル中の抗ラミニン−１抗体はＧドメインと交差反応した。更に、抗ラミニン−１抗体とインタクトラミニン−１分子との免疫反応性と、抗ラミニン−１抗体とＧドメインとの免疫反応性の間には相関関係が認められた。
産業上の利用可能性
種々のラミニンアイソフォームの中のラミニン−１に対する自己抗体（抗ラミニン−１抗体）が習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の患者血清または血漿に特異的に存在し、この自己抗体は自己免疫疾患で見い出される他の自己抗体（たとえば、抗リン脂質抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗核抗体など）との相関もないことから、ヒトの婦人科関連疾患の新規のマーカーとして臨床上有用であることは、本発明者らによって初めて見いだされたことである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び図１Ｂは、健常者、健康な妊婦、習慣流産から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ／ＩｇＭ）の測定結果を示したものである。
図２は、妊娠していない健常者、子宮内膜症を有する不妊症患者および子宮内膜症を有しない不妊症患者から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）の測定結果を示したものである。
図３は、子宮内膜症患者の重症度と抗ラミニン−１抗体レベルとの関係を示したものである。
図４は、抗ラミニン−１抗体レベルとＣＡ−１２５値との間の相関を示したものである。
図５は、ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体のラミニン−１とラミニン−α１鎖のＧドメインとに対する交差反応性を示したものである。
本発明は、ラミニン−１に対する自己抗体（抗ラミニン−１抗体）の測定法、該方法を実施するためのキット、および習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の診断などの臨床への応用に関するものである。
背景技術
習慣流産とは、妊娠はするものの、自然流産あるいは死産を反復することを意味する。この習慣流産の原因は多岐にわたり、免疫機能の異常もその１つと考えられている。
自己免疫的原因による習慣流産を診断する手段としては、自己抗体である抗カルジオリピン抗体（最近、この自己抗体の抗原はカルジオリピンとβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）との複合体であることが明らかとされ、β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体と称されている）を測定する方法などが知られている。
しかしながら、上記方法の信頼性は完璧ではないので、測定の結果が陰性であっても習慣流産の可能性は否定できなかった。また、他のマーカーを組み合わせて測定したとしても、満足する結果は得られていない。そのため、既存のマーカーとは異なる新たなマーカーの開発が望まれていた。
また、不妊症、不育症、子宮内膜症においても習慣流産と似たような状況であり、より簡便で信頼性の高いマーカーの開発が望まれていた。
ラミニンは基底膜内に存在する最も豊富な糖タンパク質で、ナイドジェン、ＩＶ型コラーゲンなどの基底膜のその他の成分と複合体を形成している。また、ラミニンは、通常、３本のポリペプチドがコイル状により合わさって非対称の十字型の構造をとり、多くのアイソフォームの存在が確認されている。すなわち、ラミニンを構成する３つのポリペプチドであるα鎖（〜４００ｋＤａ）、β鎖（〜２００ｋＤａ）およびγ鎖（〜２００ｋＤａ）の組み合わせによって様々なアイソフォームを形成することが可能であり、現在まで、少なくとも１２個のアイソフォームの存在が報告されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３７，６８５−７０１（１９９７）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４５，６０５−６１８（１９９９））。
たとえば、ラミニン−１（α１、β１、γ１）は腎臓、胎児脳、網膜、血管等に存在し、メロシン（＝ラミニン−２；α２、β１、γ１）は骨格筋、心臓、胎盤等に存在し、ｓ−ラミニン（＝ラミニン−３；α１、β２、γ１）は神経筋末端プレートの接合部の基底膜、血管内皮および糸球体基底膜に存在し、ｓ−メロシン（＝ラミニン−４；α２、β２、γ１）はＳｃｈｗａｎｎ細胞、胎盤などに存在し、カリニン／ナイセイン（＝ラミニン−５；α３、β３、γ２）とｋ−ラミニン（＝ラミニン−６；α３、β１、γ１）とｋｓ−ラミニン（＝ラミニン−７；α３、β２、γ１）は皮膚の基底膜に特有のものであることが明らかとなっている。
このようなラミニンあるいはそのフラグメントを検出することにより、肝線維症／肝硬変、アルコール性肝線維症、糖尿病性合併症、腎疾患、慢性多発関節炎、腫瘍、アルツハイマー症などの様々な疾患の診断に利用できる可能性があることが報告されている。
また、ラミニンに対する自己抗体である抗ラミニン抗体に関しても、抗ラミニン抗体が流産しやすいサルの血清から検出されること、抗ラミニン抗体を含む血清を培養したラットの胎児に添加すると、胎児の異常が起こること、抗ラミニン抗体をマウスに免疫することにより流産を誘導することができること等が報告（Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉ．，５１，７１１−７１８（１９８９）、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，４０，４７−５７（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６８１８−６８２２（１９９５）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１０，３４６−３５７（１９８３））されていることから、抗ラミニン抗体は流産を引き起こす原因の１つではないかと推測されている。
しかしながら、ヒトにおける抗ラミニン抗体の測定の意義は、血清には存在せず、尿中に特異的に存在する分子量２００ｋＤａのラミニンに対する自己抗体の測定が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断に利用できる可能性が報告（特開平８−３６９６６、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．，８（２），２７９−２９１（１９９５））されているだけで、習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の診断に使用できるか否かに関してはまったく示唆されていない。
発明の開示
本発明者らは、婦人科関連疾患における新たなマーカーとしてラミニンに注目し、鋭意検討を重ねた結果、種々のラミニンアイソフォームの中のラミニン−１（分子量：約９００ｋＤａ）に対する自己抗体である抗ラミニン−１抗体が習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の患者血清に特異的に存在し、この抗ラミニン−１抗体の測定が婦人科関連疾患の診断に有用であることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、サンプルをラミニン−１またはそのフラグメントと反応させた後、サンプル中の抗ラミニン−１抗体がラミニン−１またはそのフラグメントに結合したか否かを測定することからなる、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定法に関するものである。
また、本発明は、構成試薬としてラミニン−１またはそのフラグメントを含み、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキットに関するものである。
さらに本発明は、上記方法またはキットにより測定したサンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定値から婦人科関連疾患を検出する方法に関するものである。
発明を実施するための最良の形態
測定対象のサンプルとしては、抗ラミニン−１抗体を含有すると疑われるサンプルであれば特に制限されない。そのようなサンプルを具体的に例示すれば、ヒトの血液、血清、血漿などをあげることができ、特に血清及び血漿サンプルが好適である。
サンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定は、サンプルをラミニン−１と反応させた後、サンプル中の抗ラミニン−１抗体がラミニン−１に結合したか否かを測定することにより実施できる。
使用するラミニン−１としては、公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，９９３３−９９３７（１９７９））に従い癌細胞より調製したもの、あるいは市販のラミニン−１（旭テクノグラス社製）を使用することができる。
また、サンプル中の抗ラミニン−１抗体との反応性を失わない限りにおいて、ラミニン−１の酵素あるいは化学処理により得られるフラグメントあるいはそれをコードする遺伝子を用いたＤＮＡ組換え技術により製造した組換えフラグメント等であってもかまわない。このようなフラグメントとしては、例えばラミニン−α１鎖のＧドメイン（アミノ酸残基２１１１−３０６０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（３８）２９４５８−２９４６５（２０００））などが挙げられる。
ラミニン−１またはそのフラグメントの使用形態としては、固相化物もしくは標識化物の形態で使用することができる。
ラミニン−１またはそのフラグメントの固相化に使用できる担体の材質としては、ラミニン−１またはそのフラグメントとの結合性の高いものであれば特に制限されず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレンなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したものであってもかまわない。
担体の形状としては、マイクロタイタープレート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状などが例示され、測定法に応じて適宜選択することができる。
固相担体へのラミニン−１またはそのフラグメントの固相化は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法を用いて行えばよい。
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するために、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもかまわない。
また、標識化ラミニン−１またはそのフラグメントを調製する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金など）などを使用することができる。
ラミニン−１またはそのフラグメントの標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）に従って行えばよい。
このような固相化物及び／または標識化物を用いたサンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定は、サンプル中の自己抗体などの抗体の測定法として汎用されている方法に準じて行えばよく、たとえば、固相化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いたサンプル中の抗ラミニン−１抗体の具体的な測定手順は以下の通りである。
固相化ラミニン−１を用いた方法
（ａ）抗ラミニン−１抗体を含有する疑いのあるサンプルを、ラミニン−１またはそのフラグメントが固定化されてなる固相担体とインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、過剰のサンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を標識化された抗ヒトイムノグロブリン抗体とインキュベートし、そして
（ｄ）固相と液相を分離（ＢＦ分離）後、どちらかの相の標識量を測定して、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を算出する。
また、標識化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いたサンプル中の抗ラミニン−１抗体の具体的な測定手順は、たとえば以下の通りである。
標識化ラミニン−１を用いた方法
（ａ）抗ラミニン−１抗体を含有する疑いのあるサンプルを、標識されたラミニン−１またはそのフラグメントとインキュベートし、
（ｂ）抗ラミニン−１抗体と結合した標識化ラミニン−１またはそのフラグメントと未結合の標識化ラミニン−１またはそのフラグメントとを分離し、そして
（ｃ）どちらか一方の相の標識量を測定して、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を算出する。
また、抗ラミニン−１抗体を測定するためのキットは、キットの構成試薬としてラミニン−１またはそのフラグメントを含有していればよく、その他の構成試薬は、キットの採用する測定法に応じて適宜必要とされる試薬を添付すればよい。たとえば、固相化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いた抗ラミニン−１抗体測定用キットとしては、次のようなものを例示することができる。
▲１▼固相化ラミニン−１またはそのフラグメント
▲２▼標識化抗ヒトイムノグロブリン抗体
また、標識化ラミニン−１またはそのフラグメントを用いた抗ラミニン−１抗体測定用キットとしては、次のようなものを例示することができる。
▲１▼標識化ラミニン−１またはそのフラグメント
▲２▼ＢＦ分離剤〔ＤＣＣ（デキストラン被覆活性炭）、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウムなど〕
さらに上記キットには、採用する測定法あるいは標識の種類などにより必要な試薬（サンプル希釈溶液、洗浄溶液、酵素基質溶液、反応停止液、標準抗体溶液など）を適宜添付することができる。
このようなキットを用い、上述した方法によりサンプル中の抗ラミニン−１抗体を測定し、健常人の測定値と比較し、その結果が健常人レベルよりも高い場合には習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の可能性大と判断し、精密検査を行うのが好ましい。
実施例
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）サンプル
流産経験のある女性（習慣流産）２０７人（平均年齢：３１．０±３．８歳、平均流産回数：２．７±１．１回）、健康な妊婦１００人（平均年齢：３０．７±４．５歳）及び妊娠していない健常者４０人（女性）（平均年齢：２９．６±５．１歳）から血液を採取し、サンプルとした。ただし、流産経験のある２０７人のうち、アレルギー疾患のある３０人のサンプルは測定から除外した。
（２）アッセイ
▲１▼β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体の測定
β２−ＧＰＩ依存性抗カルジオリピン抗体のＥＬＩＳＡは松浦らの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３８８５−３８９１（１９９２））を多少変更して行った。すなわち、ポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−１：Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）にカルジオリピン（２．５μｇ／５０μｌ／ウエル）をコートし、１％ＢＳＡでブロッキング後、ヒトβ２−ＧＰＩ（１．０μｇ／５０μｌ）と１００倍希釈血清サンプル（５０μｌ）を各ウエルに添加し、よく撹拌後、室温で３０分間インキュベートする。
インキュベーション後、過酸化水素含有テトラメチルベンチジン溶液を添加して反応させた後、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線から抗カルジオリピン抗体の抗体価（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を算出する。
▲２▼ループス・アンチコアギュラントの測定（ｌｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ：ＬＡ）
トロンボプラスチンを部分的に活性化するための時間（ａＰＰＴ）を決定するためのリン脂質として脳ケファリンを使用し、非妊娠のコントロール血漿（５０μｌ）、標準血漿（５０μｌ）及び希釈した脳ケファリン（１００μｌ）を混合し、３７℃で３分間正確にインキュベートし、２５ｍＭ ＣａＣｌ２を１００μｌ添加し、凝血時間を測定する。
標準血漿とサンプル血漿を１：１で混合した時、延長された凝血時間（平均＋３ＳＤ、７．３７秒より長い）が元に戻らない場合、ＬＡは陽性と判断する。
▲３▼抗核抗体（ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＮＡ）と抗ＤＮＡ抗体の測定
公知の方法（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８９，１２９−１３３（１９９０））に従い、ＡＮＡはＨｅｐＧ２細胞スライドを用いた間接免疫蛍光法により測定し、抗ＤＮＡ抗体は市販のキットを用いて行った。
▲４▼抗ラミニン−１抗体の測定
ラミニン−１は、公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，９９３３−９９３７（１９７９））に従い調製した。
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−１Ｂ：Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）にラミニン−１（１０μｇ／ｍｌ）をコートし（５０μｌ／ウエル）、４℃で一夜インキュベート後、１０％牛胎児血清でブロッキング後、２００倍希釈血清サンプル（１００μｌ／ウエル）を添加し、室温で１時間インキュベートする。
インキュベーション後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗ヒトイムノグロブリン（ＩｇＧ／ＩｇＭ）抗体を添加し、室温で１時間インキュベートし、過酸化水素含有ｏ−フェニレンジアミン溶液を添加して反応させた後、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定する。測定値が妊娠していない健常者の血漿中の抗ラミニン−１抗体の平均＋ＳＤよりも大きい場合には、抗ラミニン−１抗体は陽性と判断する。
（３）結果
前記サンプルを測定した結果、習慣流産の女性から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）のレベルは、健康な妊婦及び妊娠していない健常者の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）レベルと比較して有意に高値を示した（Ｐ＝０．００４３、Ｐ＝０．００７３）（図１参照）。
また、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）は、習慣流産の１７７サンプル中、５５サンプルが陽性であり（３１．１％）、１２２サンプルが陰性であった（６８．９％）。また、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＭ）は、４９サンプルで陽性で（２７．７％）、１２８サンプルで陰性であった（７２．３％）。
正常出産の確率を解析した結果、表１に示すように、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）陽性の習慣流産における正常出産の確率は、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）陰性の習慣流産における正常出産の確率と比較して有意に低いことが明らかとなった。
また、抗ラミニン−１抗体が陽性の習慣流産と陰性の習慣流産との間には、妊婦の年齢、流産の回数などの有意な差はなかった。
実施例１記載の方法で、不妊症と抗ラミニン−１抗体との関連性を検討したところ、抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）は、体外受精を行った不妊症患者５０サンプル中、１２サンプルが陽性であり（２４．０％）、３８サンプルが陰性であり（７６．０％）、健常人の数値と比較して有意に高い出現率を示した（Ｐ＝０．００８８）。
また、子宮内膜症を合併した不妊症患者（体外受精）における抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）の陽性率は、表３に示すように、７５％（８人中６名が陽性）と極めて高い値を示した。
（１）サンプル
腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者５３人（平均年齢：３３．４±４．７歳、年齢範囲：２６〜４５歳）、人工受精と胚転移を受けた不妊症患者（ＩＶＦ）５０人（平均年齢：３４．１±４．４歳、年齢範囲：２３〜４５歳、人工授精を受けた平均回数：２．８±２．６回）及び妊娠していない健常者（女性）３９人（平均年齢：２９．６±５．１歳、年齢範囲：２２〜４１歳）から血漿を採取し、サンプルとした。ＩＶＦ患者については膣から卵母細胞を摘出する前日に血漿サンプルを採取した。これらの不妊症患者の臨床プロファイル（不妊原因）を表４に示した。ただし、不妊症患者の中にはその原因が不明である子宮異常あるいはホルモン異常の患者も含まれていた。ＩＶＦ患者５０人のうち８人は子宮内膜症であった。腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者５３人は、腹腔鏡検査または開腹検査により子宮内膜症患者とそうでない患者に分けられた。子宮内膜症患者の重症度をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｒｉｔｉｌｉｔｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＦＳ）による分類法の変法により分類した。即ち、子宮内膜症患者３４人のうち、７人がステージＩ（最小程度の症状）、６人がステージＩＩ（軽症）、１３人がステージＩＩＩ（中程度の症状）、８人がステージＩＶ（重症）であった。
（２）アッセイ
▲１▼抗ラミニン−１抗体の測定
実施例１の（２）▲４▼で記載した方法とほぼ同様の方法により、血漿サンプル中の抗ラミニン−１抗体を測定した。測定値が妊娠していない健常者の血漿中の抗ラミニン−１抗体の平均＋ＳＤよりも大きい場合には、抗ラミニン−１抗体は陽性と判断した。
▲２▼腫瘍抗原１２５（ＣＡ−１２５）の測定
市販品のラジオイムノアッセイキット（ＣＡ−１２５ ＩＩ ＩＲＭＡ ｋｉｔ；Ｃｅｎｔｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８４；４４：１０４８−５３）を用いてサンプル中のＣＡ−１２５を測定した。結果は標準曲線から得た。２０Ｕ／ｍｌ値をカットオフ値とした。なお、ＣＡ−１２５は子宮内膜症のマーカーとしても利用されている。
▲３▼ラミニン−α１鎖のＧドメインを用いた抗ラミニン−１抗体の測定
ラミニン−α１鎖のＧドメイン（アミノ酸残基＃２１１１―３０６０）をコードするプラスミドで形質転換されたチャイニーズ・ハムスター卵母細胞の培養液から、ハイトラップヘパリンアフィニティーカラムとＦＰＬＣシステムを用いてラミニン−α１鎖の組換えＧドメインを精製した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００；２７５：２９４５８−６５）。組換えＧドメインをポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ １Ｂ）にコートし（１μｇ／５０μｌ／ウエル）、４℃で一夜インキュベート後、ブロッキングした。２５倍希釈サンプル（１００μｌ／ウエル）をウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで実施例１の（２）▲４▼で記載した方法と同様の方法により、ラミニン−α１鎖の組換えＧドメイインに結合した抗ラミニン−１抗体を測定した。
（３）結果
▲１▼抗ラミニン−１抗体と不妊症の原因との関係
５０人のＩＶＦ患者を含む１０３人の不妊症患者と妊娠していない健常者３９人からのサンプルについて抗ラミニン−１抗体を測定し、不妊症の原因と抗ラミニン−１抗体レベルとの関係を分析した。得られた結果を表４に示した。表４から分かるように、抗ラミニン−１抗体陽性の患者と子宮内膜症との間には有意な相関関係があった。抗ラミニン−１抗体陽性患者３２人のうち２１人（６６％）が子宮内膜症であり、抗ラミニン−１抗体陰性患者７１人のうち２１人（３０％）（ｐ＝０．０００６３）が子宮内膜症であった。不妊症の他の原因と抗ラミニン−１抗体陽性患者との間には有意な相関関係は見られなかった。
腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者５３人については、子宮内膜症患者の重症度と抗ラミニン−１抗体レベルとの関係を調べた。その結果を図３に示した。図３から分かるように、ステージＩＩまたはステージＩＩＩの子宮内膜症の不妊症患者の抗ラミニン−１抗体レベルは、ステージＩあるいはＩＶの患者のそれに比べてかなり高い値を示した。ステージＩＩまたはステージＩＩＩの患者のレベルは、子宮内膜症でない不妊症患者のそれよりも有意に高値を示した（それぞれｐ＝０．００７４とｐ＝０．００２５）。ステージＩおよびＩＶの患者のレベルは、子宮内膜症でない患者のそれとは有意には相違しなかった。ステージＩＩの不妊症患者６人のうち４人（６７％）及びステージＩＩＩの不妊症患者１３人のうち７人（５４％）が抗ラミニン−１抗体陽性であった。
▲２▼ＩＶＦ患者における子宮内膜症と抗ラミニン−１抗体およびＣＡ−１２５との関係
ＩＶＦ患者における子宮内膜症と抗ラミニン−１抗体およびＣＡ−１２５との関係を表５に示した。表５から分かるように、ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体陽性の頻度は、子宮内膜症を有する患者の方が子宮内膜症でない患者に比べて有意に高かった（子宮内膜症でない患者４２人のうち６人（１４％）が陽性であるのに対して、子宮内膜症を有する患者８人のうち６人（７５％）が陽性であった（ｐ＝０．００３）。子宮内膜症を有する患者とＣＡ−１２５の存在とは有意な関係は見られなかった（子宮内膜症でない患者４２人のうち１１人（２６％）がＣＡ−１２５陽性であるのに対して、子宮内膜症を有する患者８人のうち４人（５０％）がＣＡ−１２５陽性であった。ｐ＝０．１８）。
ＩＶＦ患者５０人から採取したサンプルを用いて、抗ラミニン−１抗体がラミニン−α１鎖のＧドメインを認識できるかどうかを調べた。得られた結果を図５に示した。図５から分かるように、ＩＶＦ患者からのサンプル中の抗ラミニン−１抗体はＧドメインと交差反応した。更に、抗ラミニン−１抗体とインタクトラミニン−１分子との免疫反応性と、抗ラミニン−１抗体とＧドメインとの免疫反応性の間には相関関係が認められた。
産業上の利用可能性
種々のラミニンアイソフォームの中のラミニン−１に対する自己抗体（抗ラミニン−１抗体）が習慣流産、不妊症、不育症、子宮内膜症などの婦人科関連疾患の患者血清または血漿に特異的に存在し、この自己抗体は自己免疫疾患で見い出される他の自己抗体（たとえば、抗リン脂質抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗核抗体など）との相関もないことから、ヒトの婦人科関連疾患の新規のマーカーとして臨床上有用であることは、本発明者らによって初めて見いだされたことである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び図１Ｂは、健常者、健康な妊婦、習慣流産から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ／ＩｇＭ）の測定結果を示したものである。
図２は、妊娠していない健常者、子宮内膜症を有する不妊症患者および子宮内膜症を有しない不妊症患者から採取したサンプル中の抗ラミニン−１抗体（ＩｇＧ）の測定結果を示したものである。
図３は、子宮内膜症患者の重症度と抗ラミニン−１抗体レベルとの関係を示したものである。
図４は、抗ラミニン−１抗体レベルとＣＡ−１２５値との間の相関を示したものである。
図５は、ＩＶＦ患者における抗ラミニン−１抗体のラミニン−１とラミニン−α１鎖のＧドメインとに対する交差反応性を示したものである。
Claims (11)
- サンプルをラミニン−１またはそのフラグメントと反応させた後、サンプル中の抗ラミニン−１抗体がラミニン−１またはそのフラグメントに結合したか否かを測定することからなる、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定法。
- ラミニン−１またはそのフラグメントが固相に固定化された固相化ラミニン−１またはそのフラグメントである、請求項１記載の方法。
- ラミニン−１またはそのフラグメントが標識化された標識化ラミニン−１またはそのフラグメントである、請求項１記載の方法。
- サンプルが血液、血漿または血清である、請求項１記載の方法。
- 請求項１記載の方法により測定したサンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定値から婦人科関連疾患を検出する方法。
- 婦人科関連疾患が、習慣流産、不妊症、不育症または子宮内膜症である、請求項５記載の方法。
- 構成試薬としてラミニン−１またはそのフラグメントを含み、サンプル中の抗ラミニン−１抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキット。
- ラミニン−１またはそのフラグメントが固相に固定化された固相化ラミニン−１またはそのフラグメントである、請求項７記載のキット。
- ラミニン−１またはそのフラグメントが標識化された標識化ラミニン−１またはそのフラグメントである、請求項７記載のキット。
- 請求項７記載のキットにより測定したサンプル中の抗ラミニン−１抗体の測定値から婦人科関連疾患を検出する方法。
- 婦人科関連疾患が、習慣流産、不妊症、不育症または子宮内膜症である、請求項１０記載の方法。
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