WO2002042769A1 - Procede de detection d'un anticorps anti-laminine-1 et sa mise en application - Google Patents

Procede de detection d'un anticorps anti-laminine-1 et sa mise en application Download PDF

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Junko Inagaki
Koji Aoki
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Matsuura, Eiji
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring an autoantibody against laminin-1 (anti-laminin-1 antibody), a kit for performing the method, and a method for gynecological-related diseases such as habitual miscarriage, infertility, infertility, and endometriosis. It is related to clinical applications such as diagnosis. Background art
  • Habitual miscarriage means repeated pregnancy but repeated spontaneous or stillbirth.
  • the causes of this habitual miscarriage are diverse, including abnormalities in immune function.
  • an anti-cardiolipin antibody As a means of diagnosing habitual miscarriage due to autoimmune causes, an anti-cardiolipin antibody (recently, the antigen of this autoantibody is a complex of cardiolipin and / 3-2-glycoside tin I (2-GPI))
  • the method is known to measure J3 2-GPI-dependent anti-cardiolipin antibody).
  • the reliability of the above method was not perfect, the possibility of habitual miscarriage could not be ruled out even if the measurement result was negative.
  • satisfactory results have not been obtained even when other markers are combined and measured. Therefore, the development of a new marker different from the existing markers has been desired.
  • Infertility, infertility and endometriosis are also similar to habitual miscarriage, and the development of a simpler and more reliable marker has been desired.
  • Laminin is the most abundant glycoprotein found in basement membranes and forms a complex with other components of basement membranes such as nitrogen and type IV collagen.
  • Laminin usually has an asymmetrical cross-shaped structure in which three polypeptides are combined in a coil shape, and the existence of many isoforms has been confirmed. That is, the combination of the three polypeptides that constitute laminin, ⁇ chain (up to 400 kDa), chain (up to 200 kDa), and ⁇ chain (up to 200 kDa)
  • Various eyes Soforms can be formed, and to date, at least 12 isoforms have been reported to exist (J. Cell Biol., 137, 685-701 (1997), J. Cell Biol., 145, 605-618 (1999)).
  • k-laminin laminin-6; ⁇ 3, ⁇ 1, y1)
  • ks-laminin laminin-7; ⁇ 3, ⁇ 2, ⁇ 1)
  • laminin or its fragments By detecting such laminin or its fragments, it can be used to diagnose various diseases such as liver fibrosis, cirrhosis, alcoholic liver fibrosis, diabetic complications, renal disease, chronic polyarthritis, tumors, and Alzheimer's disease. It is reported that there is a possibility.
  • anti-laminin antibodies which are autoantibodies to laminin, are detected in the serum of aborted monkeys and monkeys, and when added to rat embryos cultured with serum containing anti-laminin antibodies, fetal It has been reported that abnormalities occur in mice and that abortion can be induced by immunizing mice with an anti-laminin antibody (Fertil. Steri., 51, 711-718 (1989), Teratology, 40, 47-57 (1989). ), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6818-6822 (1995), Am. J. Pathol., 110, 346-357 (1983)) that anti-laminin antibodies cause abortion. It is speculated that this is one of them.
  • the present inventors have focused on laminin as a new marker in gynecological-related diseases, and as a result of diligent studies, have found that laminin-1 (molecular weight: about 900 kDa) in various laminin isoforms
  • laminin-1 molecular weight: about 900 kDa
  • Anti-laminin-1 antibody which is an autoantibody, is present specifically in the serum of patients with gynecological-related diseases such as miscarriage, infertility, infertility, and endometriosis.
  • the present inventors have found that the present invention is useful for diagnosing a disease and completed the present invention.
  • the present invention comprises, after reacting a sample with laminin-1 or a fragment thereof, determining whether the anti-laminin-11 antibody in the sample has bound to laminin-1 or a fragment thereof.
  • the present invention relates to a method for measuring anti-laminin-1 antibody.
  • the present invention also relates to a kit containing laminin-11 or a fragment thereof as a constituent reagent and used in a method for measuring the amount of anti-laminin-1 antibody in a sample.
  • the present invention relates to a method for detecting a gynecological-related disease from a measured value of an anti-laminin-1 antibody in sampnole measured by the above method or kit.
  • 1A and 1B show the results of measurement of anti-laminin-1 antibody (IgGZlgM) in samples collected from healthy subjects, healthy pregnant women, and habitual abortions.
  • IgGZlgM anti-laminin-1 antibody
  • Figure 2 shows the results of measurement of anti-laminin-11 antibody (IgG) in sampnoles collected from healthy individuals who are not pregnant, infertile patients with endometriosis, and infertile patients without endometriosis. It is shown.
  • IgG anti-laminin-11 antibody
  • Figure 3 shows the relationship between the severity of endometriosis patients and anti-laminin-1 antibody levels.
  • FIG. 4 shows the correlation between anti-laminin-11 antibody levels and CA-125 values.
  • FIG. 5 shows the cross-reactivity of the anti-laminin-1 antibody with laminin-1 and the G domain of laminin-1 a1 chain in IVF patients.
  • the sample to be measured is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing an anti-laminin-1 antibody.
  • Specific examples of such a sample include human blood, serum, and plasma, and a serum and plasma sample is particularly preferable.
  • the measurement of anti-laminin-11 antibody in the sample can be performed by reacting the sample with laminin-11 and then measuring whether the anti-laminin-11 antibody in the sample has bound to laminin-1. .
  • laminin-1 As laminin-1 to be used, one prepared from cancer cells according to a known method (J. Biol. Chem., 254, 9933-9937 (1979)) or a commercially available laminin-1 (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) is used. be able to.
  • a recombinant fragment produced by a DNA recombination technique using a fragment obtained by the enzyme or chemical treatment of laminin-11 or a gene encoding the same is used. May be used.
  • Such fragments include, for example, the G domain of laminin- ⁇ 1 chain (amino acid residue 211-310; J. Biol. Chem., 275 (38) 29458-29465 (2000)). Is mentioned.
  • Laminin-1 or a fragment thereof can be used in the form of a solid phase or a labeled form.
  • the material of the carrier that can be used for immobilizing laminin-1 or a fragment thereof is not particularly limited as long as it has a high binding property to laminin-1 or a fragment thereof.
  • polyvinyl chloride, polystyrene, styrene- Synthetic organic polymer compounds such as divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, nylon, polybutyl alcohol, polyacrylamide, polyacrylonitrile, and polypropylene; dextran derivatives (such as Sephadex); and agarose gel (Sepharose, biogel, etc.), cellulose (paper disc, filter paper, etc.)
  • inorganic polymer compounds such as glass, silica gel, silicone, etc., even if they have introduced functional groups such as amino, aminoalkyl, carboxyl, acyl, and hydroxyl groups. I don't care.
  • the shape of the carrier examples include a plate shape such as a microtiter plate and a disk, a particle shape such as a bead, a tube shape such as a test tube and a tube, a fibrous shape and a film shape, and the like. You can choose.
  • the immobilization of laminin-11 or a fragment thereof on the solid support may be performed by a known method such as a physical adsorption method, an ionic bonding method, a covalent bonding method, and an entrapment method.
  • the solid phase reagent thus obtained may be subjected to a blocking treatment using a conventional blocking agent such as BSA, sugar, skim milk or the like in order to suppress non-specific binding.
  • a conventional blocking agent such as BSA, sugar, skim milk or the like
  • radioactive isotopes 3 2 P,: i H , 1 4 C, 1 2 5 I , etc.
  • enzymes 3- Galata tosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
  • coenzymes 3- Galata tosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
  • coenzymes 3- Galata tosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
  • coenzymes e.g., ATP, biotin, heme, etc.
  • fluorescent dyes fluorescein derivatives, rhodamine derivatives, etc.
  • metal particles gold, silver, Platinum, etc.
  • Labeling of laminin-1 or a fragment thereof can be carried out by a known method suitable for the selected labeling agent (for example, “Seismic Chemistry Laboratory Lecture 5 Immunobiochemical Research Method”, Tokyo Chemical Dojin, Ltd. Issue) See pages 102-112).
  • the measurement of the anti-laminin-1 antibody in a sample using such a solid-phased product and / or a labeled product may be performed according to a method generally used as a method for measuring an antibody such as an autoantibody in a sample.
  • the specific procedure for measuring anti-laminin-1 antibody in a sample using immobilized laminin-1 or a fragment thereof is as follows.
  • a specific procedure for measuring an anti-laminin-1 antibody in a sample using labeled laminin-1 or a fragment thereof is, for example, as follows.
  • the kit for measuring anti-laminin-1 antibody only needs to contain laminin-1 or a fragment thereof as a constituent reagent of the kit, and the other constituent reagents depend on the assay method used in the kit. If necessary, attach necessary reagents.
  • the following kit can be exemplified as a kit for measuring anti-laminin-11 antibody using immobilized laminin-11 or a fragment thereof.
  • kits for measuring anti-laminin-11 antibody using labeled laminin-11 or a fragment thereof include the following.
  • reagents sample diluting solution, washing solution, enzyme substrate solution, reaction stopping solution, standard antibody solution, etc.
  • sample diluting solution washing solution, enzyme substrate solution, reaction stopping solution, standard antibody solution, etc.
  • the anti-laminin 1 Measure the body and compare it with the measurement of a healthy person. If the result is higher than the level of a healthy person, the possibility of gynecological-related diseases such as habitual abortion, infertility, infertility, endometriosis, etc. It is preferable to carry out a precision inspection.
  • Women with miscarriage (habitual miscarriage) 2 0 7 (average age: 31.0 ⁇ 3.8 years, average number of miscarriages: 2.7 ⁇ 1. 1), healthy pregnant women 100 (average) Age: 30.7 Saturday, 4.5 years old) and 40 healthy (non-pregnant) women (mean age: 29.6 ⁇ 5.1 years old).
  • the sample of 30 people with allergic diseases was excluded from the measurement.
  • the ELISA of a 32-GPI-dependent anti-cardiolipin antibody was obtained by the method of Matsuura et al. (J. Immunol. 148, 3885-3891 (1992)) with some modifications. That is, a microtiter plate (Immulon-l: Dynex Technologies Inc.) made of polystyrene is coated with force lipolipin (2.5 ⁇ g Z50 ⁇ l nodule), and after blocking with 1% BSA, the human is treated. -Add GPI (1.0 / ig / 501) and 100-fold diluted serum sample (50 ⁇ l) to each well, mix well, and incubate at room temperature for 30 minutes.
  • GPI 1.0 / ig / 501
  • 100-fold diluted serum sample 50 ⁇ l
  • cerebral kephalin as a phospholipid to determine the time to partially activate thromboplastin (aPPT), non-pregnant control plasma (50% mu 1), a standard plasma (5 0 ⁇ 1) and diluted brain cephalin the (1 00 ⁇ 1) were mixed, 3 7 ° accurately incubated for 3 minutes at C, 2 5mM C a C l 2 and 1 00 mu 1) and measure the clotting time.
  • LA is considered positive if the prolonged clotting time (mean + 3 SD, longer than 7.37 seconds) does not return when the standard and sample plasmas are mixed 1: 1.
  • AN ⁇ was measured by indirect immunofluorescence using a HepG 2 cell slide, and anti-DNA antibody was obtained from a commercially available kit. This was performed using
  • Laminin-1 was prepared according to a known method (J. Biol. Chem., 254, 9933-9937 (1979)).
  • Coat laminin 1 (10 ⁇ g / m 1) on a microtiter plate (Iron ulon-lB: Dynex Technologies In) (501 ⁇ g / m 1), incubate overnight at 4 ° C, then 10% After blocking with fetal calf serum, add a 200-fold diluted serum sample (100 ⁇ l Nowell) and incubate at room temperature for 1 hour.
  • IgGZlgM horseradish peroxidase
  • the level of anti-laminin-1 antibody (IgG) in a sample collected from a woman who had aborted habits was determined to be the same as that of a healthy pregnant woman and a healthy non-pregnant person.
  • Anti-laminin 1 antibody IgG
  • 55 out of 1-7 samples of habitual abortion were positive (31.1%) and 122 samples were negative (68. 9%).
  • Anti-laminin-11 antibody IgM was positive in 49 samples (27.7%) and negative in 128 samples (72.3%).
  • the probability of normal birth in an anti-laminin_1 antibody (IgG) -positive habitual miscarriage is the anti-laminin-1 antibody (IgG) -negative habitual miscarriage. It was found to be significantly lower than the probability of normal birth in.
  • infertile patients undergoing laparoscopy or laparotomy (mean age: 33.4 sat 4.7 years, age range: 26-45 years), infertile patients undergoing artificial insemination and embryo transfer (IVF) 50 (Average age: 34.1 ⁇ 4.4 years, age range: 23-45 years, average number of times of artificial insemination: 2.8 ⁇ 2.6 times) and healthy person who is not pregnant (female) Plasma was collected from 39 patients (mean age: 29.6 ⁇ 5.1 years, age range: 22 to 41 years) and used as a sample. For IVF patients, plasma samples were collected the day before oocyte removal from the vagina. Table 4 shows the clinical profiles (fertility causes) of these infertile patients.
  • infertility patients also included those with child abnormalities or hormonal abnormalities whose cause is unknown.
  • Eight of 50 IVF patients had endometriosis. Fifty-three laparoscopic or laparotomy infertile patients were separated by laparoscopic or laparoscopic examination into those with endometriosis and those without. The severity of endometriosis patients was classified by a modification of the American Feritility Society (AFS) classification method. Of the 34 patients with endometriosis, 7 had stage I (minimal symptoms), 6 had stage II (mild symptoms), 13 had stage III (medium symptoms), and 8 had stage I (middle symptoms). IV (severe).
  • AFS American Feritility Society
  • the anti-laminin-11 antibody in the plasma sample was measured by a method substantially similar to that described in (2)) of Example 1.
  • An anti-laminin-1 antibody was considered positive if the measured value was greater than the mean + SD of anti-laminin-1 antibody in plasma of healthy non-pregnant subjects.
  • CA-125 in the sample was measured using a commercially available Radioimmunoassay kit (CA-125 II IRMA kit; Centcore, Inc., Malvern, PA) (Cancer Research 1984; 44: 1048-53). . The results were obtained from a standard curve. The 2 O U / m1 value was set as the force cutoff value. CA-125 is also used as a marker for endometriosis.
  • FIG. 2 shows the results of measurement of anti-laminin-1 antibody (IgG) in samples obtained from healthy subjects who are not pregnant, infertile patients with endometriosis, and infertile patients without endometriosis.
  • IgG anti-laminin-1 antibody
  • FIG. 3 shows the results.
  • anti-laminin-1 antibody levels in patients with stage II or stage III endometriosis infertility were significantly higher than those in stage I or IV patients.
  • the levels in stage I and IV patients were not significantly different from those in patients without endometriosis. 4 out of 6 patients with stage II infertility (67%) and stage III infertility Seven of the 13 subjects (54%) were positive for anti-laminin-1 antibody.
  • Table 5 shows the relationship between endometriosis and anti-laminin-1 antibody and CA-125 in IVF patients.
  • the frequency of anti-laminin-11 antibody positivity in patients with IVF was significantly higher in patients with endometriosis than in patients without endometriosis (childhood endometriosis).
  • Six out of 42 patients (14%) were positive, whereas 6 out of 8 patients with endometriosis (75%) were positive (p 0.003).
  • No significant relationship was found between patients with endometriosis and the presence of CA-125 (even though 11 (26%) of 42 non-endometriosis patients were CA-125 positive).
  • Fig. 5 shows the obtained results.
  • the anti-laminin-11 antibody in the sample from the IV F patient cross-reacted with the G domain.
  • a correlation was found between the immunoreactivity of the anti-laminin-1 antibody and one molecule of intactlaminin and the immunoreactivity of the anti-laminin-1 antibody and the G domain.

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Description

明 細 書 抗ラミニンー 1抗体の測定法およびその応用 技術分野
本発明は、 ラミニンー 1に対する自己抗体 （抗ラミニンー 1抗体） の測定法、 該方法を実施するためのキット、 および習慣流産、 不妊症、 不育症、 子宮内膜症 などの婦人科関連疾患の診断などの臨床への応用に関するものである。 背景技術
習慣流産とは、 妊娠はするものの、 自然流産あるいは死産を反復することを意 味する。 この習慣流産の原因は多岐にわたり、 免疫機能の異常もその 1つと考え られている。
自己免疫的原因による習慣流産を診断する手段としては、 自己抗体である抗カ ルジオリピン抗体 （最近、 この自己抗体の抗原はカルジォリピンと /3 2-グリコプ 口ティン I ( 2-G P I ) との複合体であることが明らかとされ、 J3 2-G P I依 存性抗カルジオリピン抗体と称されている） を測定する方法などが知られている。 し力、しながら、 上記方法の信頼性は完璧ではないので、 測定の結果が陰性であ つても習慣流産の可能性は否定できなかった。 また、 他のマーカーを組み合わせ て測定したとしても、 満足する結果は得られていない。 そのため、 既存のマーカ 一とは異なる新たなマーカーの開発が望まれていた。
また、 不妊症、 不育症、 子宮内膜症においても習慣流産と似たような状況であ り、 より簡便で信頼性の高いマーカーの開発が望まれていた。
ラミニンは基底膜内に存在する最も豊富な糖タンパク質で、 ナイ ドジェン、 I V型コラーゲンなどの基底膜のその他の成分と複合体を形成している。 また、 ラ ミニンは、 通常、 3本のポリペプチドがコイル状により合わさって非対称の十字 型の構造をとり、 多くのァイソフォームの存在が確認されている。 すなわち、 ラ ミニンを構成する 3つのポリペプチドである α鎖 （〜4 0 0 k D a ) 、 鎖 （〜 2 0 0 k D a ) および γ鎖 （〜2 0 0 k D a ) の組み合わせによって様々なアイ ソフォームを形成することが可能であり、 現在まで、 少なくとも 1 2個のアイソ フォームの存在が報告されている （J. Cell Biol. , 137, 685-701(1997)、 J. Cell Biol. , 145, 605—618(1999)) 。
たとえば、 ラミニンー 1 (" 1、 ]3 1、 y 1 ) は腎臓、 胎児脳、 網膜、 血管等 に存在し、 メロシン （=ラミニン一 2 ； α 2、 β 1、 y 1 ) は骨格筋、 心臓、 胎 盤等に存在し、 s—ラミニン （=ラミニン一 3 ； ひ 1、 /3 2、 y 1 ) は神経筋末 端プレートの接合部の基底膜、 血管内皮および糸球体基底膜に存在し、 s —メロ シン （=ラミニン一 4 ; α 2、 β 2、 γ 1 ) は S c hw a n n細胞、 胎盤などに 存在し、 カリニン/ナイセイン （=ラミニン一 5 ; α 3、 β 3, γ 2) と kーラ ミニン （=ラミニン一 6 ; α 3、 β 1、 y 1 ) と k s—ラミニン （=ラミニンー 7 ； α 3、 β 2、 γ 1 ) は皮膚の基底膜に特有のものであることが明らかとなつ ている。
このようなラミニンあるいはそのフラグメントを検出することにより、 肝線維 症 肝硬変、 アルコール性肝線維症、 糖尿病性合併症、 腎疾患、 慢性多発関節炎、 腫瘍、 アルツハイマー症などの様々な疾患の診断に利用できる可能性があること が報告されている。
また、 ラミニンに対する自己抗体である抗ラミニン抗体に関しても、 抗ラミニ ン抗体が流産しゃすレ、サルの血清から検出されること、 抗ラミニン抗体を含む血 清を培養したラットの胎児に添加すると、 胎児の異常が起こること、 抗ラミニン 抗体をマウスに免疫することにより流産を誘導することができること等が報告 (Fertil. Steri., 51， 711—718(1989)、 Teratology, 40, 47—57(1989)、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6818-6822(1995)、 Am. J. Pathol. , 110， 346- 357(1983)) されていることから、 抗ラミニン抗体は流産を引き起こす原因の 1 つではないかと推測されている。
しかしながら、 ヒ トにおける抗ラミニン抗体の測定の意義は、 血清には存在せ ず、 尿中に特異的に存在する分子量 2 0 0 k D aのラミニンに対する自己抗体の 測定が全身性ェリテマトーデス （ S L E) の診断に利用できる可能性が報告 （特 開平 8— 3 6 9 6 6、 J. Autoimmun. , 8(2)， 279-291(1995)) されているだけで、 習慣流産、 不妊症、 不育症、 子宮内膜症などの婦人科関連疾患の診断に使用でき るか否かに関してはまったく示唆されていない。 発明の開示
本発明者らは、 婦人科関連疾患における新たなマーカーとしてラミニンに注目 し、 鋭意検討を重ねた結果、 種々のラミニンァイソフォームの中のラミニンー 1 (分子量：約 9 0 0 k D a ) に対する自己抗体である抗ラミニンー 1抗体が習慣 流産、 不妊症、 不育症、 子宮内膜症などの婦人科関連疾患の患者血清に特異的に 存在し、 この抗ラミニンー 1抗体の測定が婦人科関連疾患の診断に有用であるこ とを見いだし、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、 サンプルをラミニンー 1またはそのフラグメントと反応 させた後、 サンプル中の抗ラミニン一 1抗体がラミニンー 1またはそのフラグメ ントに結合したか否かを測定することからなる、 サンプル中の抗ラミニン一 1抗 体の測定法に関するものである。
また、 本発明は、 構成試薬としてラミニン一 1またはそのフラグメントを含み、 サンプル中の抗ラミニン— 1抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキットに 関するものである。
さらに本発明は、 上記方法またはキットにより測定したサンプノレ中の抗ラミニ ンー 1抗体の測定値から婦人科関連疾患を検出する方法に関するものである。 図面の簡単な説明
図 1 A及び図 1 Bは、 健常者、 健康な妊婦、 習慣流産から採取したサンプル中 の抗ラミニン— 1抗体 （I g GZ l g M) の測定結果を示したものである。
図 2は、 妊娠していない健常者、 子宮内膜症を有する不妊症患者および子宮内 膜症を有しない不妊症患者から採取したサンプノレ中の抗ラミニン一 1抗体 （I g G) の測定結果を示したものである。
図 3は、 子宮内膜症患者の重症度と抗ラミニンー 1抗体レベルとの関係を示し たものである。
図 4は、 抗ラミニン一 1抗体レベルと C A— 1 2 5値との間の相関を示したも のである。 図 5は、 I V F患者における抗ラミニン一 1抗体のラミニンー 1とラミニン一 a 1鎖の Gドメインとに対する交差反応性を示したものである。 発明を実施するための最良の形態
測定対象のサンプルとしては、 抗ラミニンー 1抗体を含有すると疑われるサン プルであれば特に制限されない。 そのようなサンプルを具体的に例示すれば、 ヒ トの血液、 血清、 血漿などをあげることができ、 特に血清及び血漿サンプルが好 適である。
サンプル中の抗ラミニン一 1抗体の測定は、 サンプルをラミニン一 1と反応さ せた後、 サンプル中の抗ラミニン一 1抗体がラミニン— 1に結合したか否かを測 定することにより実施できる。
使用するラミニンー 1としては、 公知の方法 （J. Biol. Chem. , 254, 9933 - 9937 (1979) ) に従い癌細胞より調製したもの、 あるいは市販のラミニンー 1 (旭 テクノグラス社製） を使用することができる。
また、 サンプノレ中の抗ラミニンー 1抗体との反応性を失わない限りにおいて、 ラミニン一 1の酵素あるいは化学処理により得られるフラグメントあるいはそれ をコードする遺伝子を用いた D N A組換え技術により製造した組換えフラグメン ト等であってもかまわない。 このようなフラグメントとしては、 例えばラミニン - α 1鎖の G ドメイン （ァミノ酸残基 2 1 1 1 - 3 0 6 0 ; J. Biol. Chem. , 275 (38) 29458-29465 (2000) ) などが挙げられる。
ラミニンー 1またはそのフラグメントの使用形態としては、 固相化物もしくは 標識化物の形態で使用することができる。
ラミニンー 1またはそのフラグメントの固相化に使用できる担体の材質として は、 ラミニンー 1またはそのフラグメン卜との結合性の高いものであれば特に制 限されず、 例えば、 ポリ塩化ビニル、 ポリスチレン、 スチレン—ジビニルベンゼ ン共重合体、 スチレン—無水マレイン酸共重合体、 ナイロン、 ポリビュルアルコ ール、 ポリアクリルアミ ド、 ポリアクリロニトリル、 ポリプロピレンなどの合成 有機高分子化合物、 デキストラン誘導体 （セフアデックスなど） 、 ァガロースゲ ノレ （セファロース、 バイオゲルなど） 、 セルロース （ペーパーディスク、 濾紙な ど） などの多糖類、 ガラス、 シリカゲル、 シリコーンなどの無機高分子化合物が 挙げられ、 これらはァミノ基、 アミノアルキル基、 カルボキシル基、 ァシル基、 水酸基などの官能基を導入したものであってもかまわない。
担体の形状としては、 マイクロタイタープレート、 ディスクなどの平板状、 ビ ーズなどの粒子状、 試験管、 チューブなどの管状、 その他繊維状、 膜状などが例 示され、 測定法に応じて適宜選択することができる。
固相担体へのラミニン一 1またはそのフラグメントの固相化は、 物理的吸着法、 イオン結合法、 共有結合法、 包括法など公知の方法を用いて行えばよい。
このようにして得られた固相試薬は、 非特異的結合を抑制するために、 B S A、 糖、 スキムミルクなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施し てもかまわない。
また、 標識化ラミニン一 1またはそのフラグメントを調製する場合、 使用する 標識体としては、 放射性同位体 （3 2 P、 ：i H、 1 4 C、 1 2 5 Iなど） 、 酵素 （]3—ガ ラタ トシダーゼ、 ペルォキシダーゼ、 アルカリホスファターゼなど） 、 補酵素 · 補欠分子族 （F A D、 F MN、 A T P、 ピオチン、 ヘムなど） 、 蛍光色素 （フル ォレセイン誘導体、 ローダミン誘導体など） 、 金属粒子 （金、 銀、 白金など） な どを使用することができる。
ラミニン一 1またはそのフラグメントの標識化は、 選択した標識剤に適した公 知の方法 （例えば 「続生化学実験講座 5免疫生化学研究法」 （株） 東京化学同人、 ( 1 9 8 6年発行） 第 1 0 2〜1 1 2頁参照） に従って行えばよい。
このような固相化物及び または標識化物を用いたサンプル中の抗ラミニンー 1抗体の測定は、 サンプル中の自己抗体などの抗体の測定法として汎用されてい る方法に準じて行えばよく、 たとえば、 固相化ラミニン一 1またはそのフラグメ ントを用いたサンプル中の抗ラミニン 1抗体の具体的な測定手順は以下の通り である。
固相化ラミニンー 1を用いた方法
( a ) 抗ラミニン _ 1抗体を含有する疑いのあるサンプルを、 ラミニン— 1また はそのフラグメントが固定化されてなる固相担体とインキュベートし、
( b ) 該固相担体を洗浄して、 過剰のサンプルを除去し、 ( c ) 該固相担体を標識化された抗ヒ トイムノグロブリン抗体とインキュベート し、 そして
( d ) 固相と液相を分離 （B F分離） 後、 どちらかの相の標識量を測定して、 サ ンプル中の抗ラミニン一 1抗体の抗体量を算出する。
また、 標識化ラミニンー 1またはそのフラグメントを用いたサンプル中の抗ラ ミニンー 1抗体の具体的な測定手順は、 たとえば以下の通りである。
標識化ラミニンー 1を用いた方法
( a ) 抗ラミニンー 1抗体を含有する疑いのあるサンプルを、 標識されたラミニ ン一 1またはそのフラグメントとインキュベートし、
( b ) 抗ラミニン一 1抗体と結合した標識化ラミニン一 1またはそのフラグメン トと未結合の標識化ラミニン一 1またはそのフラグメン卜とを分離し、 そして ( c ) どちらか一方の相の標識量を測定して、 サンプル中の抗ラミニンー 1抗体 の抗体量を算出する。
また、 抗ラミニン一 1抗体を測定するためのキットは、 キットの構成試薬とし てラミニン 1またはそのフラグメントを含有していればよく、 その他の構成試 薬は、 キットの採用する測定法に応じて適宜必要とされる試薬を添付すればよレ、。 たとえば、 固相化ラミニン一 1またはそのフラグメントを用いた抗ラミニン一 1 抗体測定用キットとしては、 次のようなものを例示することができる。
①固相化ラミニン一 1またはそのフラグメント
②標識化抗ヒ トイムノグロプリン抗体
また、 標識化ラミニン一 1またはそのフラグメントを用いた抗ラミニン一 1抗 体測定用キットとしては、 次のようなものを例示することができる。
①標識化ラミニン一 1またはそのフラグメント
② B F分離剤 〔D C C (デキストラン被覆活性炭） 、 ポリエチレングリコール、 硫酸アンモニゥムなど〕
さらに上記キッ卜には、 採用する測定法あるいは標識の種類などにより必要な 試薬 （サンプル希釈溶液、 洗浄溶液、 酵素基質溶液、 反応停止液、 標準抗体溶液 など） を適宜添付することができる。
このようなキットを用い、 上述した方法によりサンプル中の抗ラミニン一 1抗 体を測定し、 健常人の測定値と比較し、 その結果が健常人レベルよりも高い場合 には習慣流産、 不妊症、 不育症、 子宮内膜症などの婦人科関連疾患の可能性大と 判断し、 精密検查を行うのが好ましい。 実施例
以下、 本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、 本発明はこれらによって 何ら限定されるものではない。
実施例 1
( 1 ) サンプル
流産経験のある女性 （習慣流産） 2 0 7人 （平均年齢： 3 1. 0 ± 3. 8歳、 平均流産回数： 2. 7 ± 1. 1回） 、 健康な妊婦 1 0 0人 （平均年齢： 3 0. 7土 4. 5歳） 及び妊娠していない健常者 4 0人 （女性） （平均年齢： 2 9. 6 ± 5. 1歳） から血液を採取し、 サンプルとした。 ただし、 流産経験のある 2 0 7人の うち、 アレルギー疾患のある 3 0人のサンプルは測定から除外した。
(2) アツセィ
① ] 32-G P I依存性抗カルジオリピン抗体の測定
]32-G P I依存性抗カルジオリピン抗体の E L I S Aは松浦らの方法 （J. Immunol. 148, 3885-3891(1992)) を多少変更して行った。 すなわち、 ポリスチ レン製マイクロタイタープレー卜 (Immulon-l :Dynex Technologies Inc. ) に力 ルジオリ ピン （2. 5 μ gZ50 μ 1ノゥエル） をコートし、 1 %B SAでプロ ッキング後、 ヒ ト） 32- G P I ( 1. 0 /i g/5 0 1 ) と 1 0 0倍希釈血清サン プノレ （5 0 μ 1 ) を各ゥエルに添加し、 よく撹拌後、 室温で 3 0分間インキュべ 一トする。
インキュベーション後、 過酸化水素含有テトラメチルベンチジン溶液を添加し て反応させた後、 2 Ν硫酸を添加して反応を停止させ、 4 5 0 nmの吸光度を測 定し、 標準曲線から抗カルジオリピン抗体の抗体価 （units/ml) を算出する。
②ノレープス · アンチコアギュラントの測定 (lupus anticoagulants: LA)
トロンボプラスチンを部分的に活性化するための時間 （a P PT) を決定する ためのリン脂質として脳ケフアリンを使用し、 非妊娠のコントロール血漿 （5 0 μ 1 ) 、 標準血漿 （ 5 0 μ 1 ) 及び希釈した脳ケファリン （ 1 00 μ 1 ) を混合 し、 3 7 °Cで 3分間正確にインキュベートし、 2 5mM C a C l 2を 1 00 μ 1添力!]し、 凝血時間を測定する。
標準血漿とサンプル血漿を 1 ： 1で混合した時、 延長された凝血時間 （平均 + 3 SD、 7. 3 7秒より長い） が元に戻らない場合、 LAは陽性と判断する。 ③抗核抗体 （antinuclear antibody： ANA) と抗 DNA抗体の測定
公知の方法 （Am. J. Med. , 89， 129-133(1990)) に従い、 AN Αは He p G 2 細胞スライドを用いた間接免疫蛍光法により測定し、 抗 DNA抗体は市販のキッ トを用いて行った。
④抗ラミニンー 1抗体の測定
ラミニン— 1は、 公知の方法 （J. Biol. Chem. , 254, 9933-9937(1979)) に従 い調製した。
マイクロタイタープレート (I匪 ulon-lB:Dynex Technologies In ) にラミニ ン一 1 ( 1 0 μ g/m 1 ) をコートし （50 1 Zゥエル） 、 4°Cで一夜ィンキ ュベート後、 1 0%牛胎児血清でブロッキング後、 2 00倍希釈血清サンプル (1 00 μ 1ノウエル） を添加し、 室温で 1時間インキュベートする。
インキュベーション後、 ホースラディッシュペルォキシダーゼ （HRP) で標 識された抗ヒ トイムノグロブリン （I g GZ l gM) 抗体を添加し、 室温で 1時 間インキュベートし、 過酸化水素含有 o—フエ二レンジァミン溶液を添加して反 応させた後、 2 N硫酸を添加して反応を停止させ、 490 nmの吸光度を測定す る。 測定値が妊娠していない健常者の血漿中の抗ラミニン— 1抗体の平均 + S D よりも大きい場合には、 抗ラミニン _ 1抗体は陽性と判断する。
(3) 結果
前記サンプルを測定した結果、 習慣流産の女性から採取したサンプル中の抗ラ ミニンー 1抗体 （I g G) のレベルは、 健康な妊婦及び妊娠していない健常者の 抗ラミニンー 1抗体 （ I g G) レベルと比較して有意に高値を示した （P = 0. 0043、 P = 0. 00 7 3) (図 1参照） 。
また、 抗ラミニン 1抗体 （I g G) は、 習慣流産の 1 Ί 7サンプル中、 5 5 サンプルが陽性であり （3 1. 1 %) 、 1 2 2サンプルが陰性であった （6 8. 9%) 。 また、 抗ラミニン一 1抗体 （I gM) は、 4 9サンプルで陽性で （2 7. 7%) 、 1 2 8サンプルで陰性であった （7 2. 3 %) 。
正常出産の確率を解析した結果、 表 1に示すように、 抗ラミニン _ 1抗体 （ I g G) 陽性の習慣流産における正常出産の確率は、 抗ラミニンー 1抗体 （ I g G) 陰性の習慣流産における正常出産の確率と比較して有意に低いことが明らか となった。
また、 抗ラミニンー 1抗体が陽性の習慣流産と陰性の習慣流産との間には、 妊 婦の年齢、 流産の回数などの有意な差はなかった。 表 1 ：抗ラミニン— 1抗体と流産回数及び妊娠経過との関係
Figure imgf000011_0001
習慣流産における抗ラミニンー 1抗体と他の自己抗体との相関に関して解析し た結果、 表 2に示すように、 抗ラミニン— 1抗体と他の自己抗体との間に有意な 相関は見いだせなかった。 また、 抗ラミニン _ 1抗体 （I g G) 陽性の習慣流産 5 5サンプルにおける自己抗体の出現率は、 ；32- G P I依存性抗カルジォリ ピン 抗体 （ a C L) が 1. 8 % ( 1 /5 5) 、 L Aが 2 0. 0 % ( 1 1 /5 5) 、 抗 DNA抗体 1 4. 5% (8/5 5) および抗核抗体 （ANA) 2 1. 8% ( 1 2 Z5 5) であった。 表 2 ：習慣流産における抗ラミニンー 1抗体と他の自己抗体との相関
Figure imgf000012_0001
実施例 2
実施例 1記載の方法で、 不妊症と抗ラミニンー 1抗体との関連性を検討したと ころ、 抗ラミニン一 1抗体 （I gG) は、 体外受精を行った不妊症患者 50サン プル中、 1 2サンプノレが陽性であり （24. 0%) 、 38サンプルが陰性であり (76. 0%) 、 健常人の数値と比較して有意に高い出現率を示した （P = 0. 0088) 。
また、 子宮内膜症を合併した不妊症患者 （体外受精） における抗ラミニンー 1 抗体 （I gG) の陽性率は、 表 3に示すように、 75% (8人中 6名が陽性） と 極めて高い値を示した。
表 3 ：子宫内膜症を合併した不妊症患者における抗ラミニンー 1抗体の陽性率 子宫内膜症
% 陽性 陰性 Fisher s exact test
(P値）
f几ラミニン一 1抗体
(IgG)
陽性 75. 0 6 6
0. 001 27 陰性 25. 0 2 36 実施例 3
(1) サンプノレ
腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者 53人 （平均年齢： 33.4土 4. 7歳、 年齢範囲： 26〜45歳） 、 人工受精と胚転移を受けた不妊症患者 ( I VF) 50人 （平均年齢 : 34. 1 ±4. 4歳、 年齢範囲： 23〜45歳、 人工授精を受けた平均回数： 2. 8 ± 2. 6回） 及び妊娠していない健常者 （女 性） 39人 （平均年齢： 29. 6± 5. 1歳、 年齢範囲： 22〜4 1歳） から血 漿を採取し、 サンプルとした。 I VF患者については膣から卵母細胞を摘出する 前日に血漿サンプルを採取した。 これらの不妊症患者の臨床プロファイル （不妊 原因） を表 4に示した。 ただし、 不妊症患者の中にはその原因が不明である子宫 異常あるいはホルモン異常の患者も含まれていた。 I VF患者 50人のうち 8人 は子宮内膜症であった。 腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者 53人は、 腹腔鏡検査または開腹検査により子宮内膜症患者とそうでない患者に分けられた。 子宫内膜症患者の重症度を American Feritility Society (AFS) による分類法 の変法により分類した。 即ち、 子宫内膜症患者 34人のうち、 7人がステージ I (最小程度の症状） 、 6人がステージ I I (軽症） 、 1 3人がステージ I I I (中程度の症状） 、 8人がステージ I V (重症） であった。
(2) アツセィ
①抗ラミニンー 1抗体の測定
実施例 1の （2) ④で記載した方法とほぼ同様の方法により、 血漿サンプル中 の抗ラミニン一 1抗体を測定した。 測定値が妊娠していない健常者の血漿中の抗 ラミニン— 1抗体の平均 +SDよりも大きい場合には、 抗ラミニンー 1抗体は陽 性と判断した。
②腫瘍抗原 1 25 (CA-1 25) の測定
市販品のラジオィムノアッセィキット （CA - 125 II IRMA kit; Centcore, Inc. , Malvern, PA) (Cancer Research 1984; 44: 1048- 53)を用いてサンプル中の C A - 1 25を測定した。 結果は標準曲線から得た。 2 O U/m 1値を力ットオフ値 とした。 なお、 CA— 1 25は子宫内膜症のマーカーとしても利用されている。
③ラミニン一 α 1鎖の Gドメインを用いた抗ラミニン一 1抗体の測定 ラミニンーひ 1鎖の Gドメイン （アミノ酸残基 # 2 1 1 1— 3 0 6 0) をコー ドするプラスミ ドで形質転換されたチャイニーズ ·ハムスター卵母細胞の培養液 から、 ハイ トラップへパリンァフィ二ティーカラムと F P L Cシステムを用いて ラミニン一 α 1鎖の組換え G ドメインを精製した （J. Biol. Chem. , 2000; 275: 29458-65) 。 組換え Gドメインをポリスチレンプレート （I隱 ulon IB) にコート し （1 μ β/5 0 μ 1 /ゥエル） 、 4°Cで一夜インキュベート後、 ブロッキングし た。 2 5倍希釈サンプル （Ι Ο Ο μ 1 /ゥエル） をゥエルに添加し、 室温で 1時 間インキュベートした。 次いで実施例 1の （2) ④で記載した方法と同様の方法 により、 ラミニン一 c 1鎖の組換え Gドメイインに結合した抗ラミニン一 1抗体 を測定した。
(3) 結果
①抗ラミニン一 1抗体と不妊症の原因との関係
5 0人の I VF患者を含む 1 0 3人の不妊症患者と妊娠していない健常者 3 9 人からのサンプルについて抗ラミニンー 1抗体を測定し、 不妊症の原因と抗ラミ ニン— 1抗体レベルとの関係を分析した。 得られた結果を表 4に示した。 表 4か ら分かるように、 抗ラミニン一 1抗体陽性の患者と子宫内膜症との間には有意な 相関関係があった。 抗ラミニンー 抗体陽性患者 3 2人のうち 2 1人 （6 6 %) が子宮内膜症であり、 抗ラミニンー 1抗体陰性患者 7 1人のうち 2 1人 （3 0 %) (p = 0. 0 0 0 6 3) が子宮内膜症であった。 不妊症の他の原因と抗ラミ ニン一 1抗体陽性患者との間には有意な相関関係は見られなかった。
表 4 ：抗ラミニン一 1抗体と臨床プロファイル
Figure imgf000015_0001
図 2に、 妊娠していない健常者、 子宮内膜症の不妊症患者および子宮内膜症で ない不妊症患者から採取したサンプル中の抗ラミニンー 1抗体 （I gG) の測定 結果を示した。 図 2から分かるように、 不妊症患者 (n= 103) の抗ラミニン 一 1抗体レベルは、 妊娠していない健常者 （n = 39) のそれより有意に高値を 示した （p = 0. 0029) 。 不妊症患者 103人のうち 32人 （3 1%) が抗 ラミニン— 1抗体陽性であった。 子宮内膜症の不妊症患者の抗ラミニンー 1抗体 レベルは、 妊娠していない健常者及び子宫内膜症でない不妊症患者のそれよりも 有意に高値を示した （p < 0. 0001) 。
腹腔鏡検査または開腹検査を受けた不妊症患者 53人については、 子宮内膜症 患者の重症度と抗ラミニン一 1抗体レベルとの関係を調べた。 その結果を図 3に 示した。 図 3から分かるように、 ステージ I Iまたはステージ I I Iの子宮内膜 症の不妊症患者の抗ラミニンー 1抗体レベルは、 ステージ Iあるいは I Vの患者 のそれに比べてかなり高い値を示した。 ステージ I Iまたはステージ I I Iの患 者のレベルは、 子宮内膜症でない不妊症患者のそれよりも有意に高値を示した (それぞれ p = 0. 0074と p = 0. 0025) 。 ステージ Iおよび I Vの患 者のレベルは、 子宮内膜症でない患者のそれとは有意には相違しなかった。 ステ ージ I Iの不妊症患者 6人のうち 4人 （67%) 及びステージ I I Iの不妊症患 者 1 3人のうち 7人 （54%) が抗ラミニンー 1抗体陽性であった。
©I VF患者における子宫内膜症と抗ラミニンー 1抗体および CA— 1 25との 関係
I VF患者における子宮内膜症と抗ラミニンー 1抗体および C A— 1 25との 関係を表 5に示した。 表 5から分かるように、 I VF患者における抗ラミニン一 1抗体陽性の頻度は、 子宮内膜症を有する患者の方が子宮内膜症でない患者に比 ベて有意に高かった （子宫内膜症でない患者 42人のうち 6人 （14%) が陽性 であるのに対して、 子宮内膜症を有する患者 8人のうち 6人 （75%) が陽性で あった （p = 0.003) 。 子宮内膜症を有する患者と CA-125の存在とは有意な 関係は見られなかった （子宮内膜症でない患者 42人のうち 1 1人 （26%) が CA- 1 25陽性であるのに対して、 子宫内膜症を有する患者 8人のうち 4人 (50%) が CA— 1 25陽性であった。 p = 0. 1 8) 。 表 5 ： I VF患者における子宫内膜症と抗ラミニン— 1抗体および CA— 1 25 との関係
Figure imgf000016_0001
I VF患者における抗ラミニンー 1抗体と CA— 1 25との関係を表 6に示し た。 表 6から分かるように、 I VF患者における抗ラミニン一 1抗体陽性と C A - 1 25陽性とは有意な相関関係が見られた （p = 0. 020) 。 しかし、 図 4 に示すように、 抗ラミニン一 1抗体レベルと CA— 125値との間には相関関係 が見られなかった （r =0. 025) 表 6 ： I V F患者における抗ラミニン一 1抗体と C A— 1 2 5との関係
Figure imgf000017_0001
③ IVF患者における抗ラミニンー 1抗体のラミニン一 1とラミニン一 ct 1鎖の G ドメインとに対する交差反応性
I V F患者 5 0人から採取したサンプノレを用いて、 抗ラミニンー 1抗体がラミ ニン—ひ 1鎖の G ドメインを認識できるかどうかを調べた。 得られた結果を図 5 に示した。 図 5から分かるように、 I V F患者からのサンプル中の抗ラミニン一 1抗体は Gドメインと交差反応した。 更に、 抗ラミニン一 1抗体とインタク トラ ミニンー 1分子との免疫反応性と、 抗ラミニンー 1抗体と G ドメインとの免疫反 応性の間には相関関係が認められた。 産業上の利用可能性
種々のラミニンァイソフォームの中のラミニン一 1に対する自己抗体 （抗ラミ ニン— 1抗体） が習慣流産、 不妊症、 不育症、 子宮内膜症などの婦人科関連疾患 の患者血清または血漿に特異的に存在し、 この自己抗体は自己免疫疾患で見い出 される他の自己抗体 （たとえば、 抗リン脂質抗体、 抗 D N A抗体、 抗核抗体な ど） との相関もないことから、 ヒトの婦人科関連疾患の新規のマーカーとして臨 床上有用であることは、 本発明者らによつて初めて見レ、だされたことである。

Claims

請 求 の 範 囲
I . サンプルをラミニン一 1またはそのフラグメントと反応させた後、 サンプ ル中の抗ラミニン一 1抗体がラミニン 1またはそのフラグメントに結合したか 否かを測定することからなる、 サンプル中の抗ラミニンー 1抗体の測定法。
2 . ラミニン一 1またはそのフラグメン卜が固相に固定化された固相化ラミ二 ンー 1またはそのフラグメントである、 請求項 1記載の方法。
3 . ラミニンー 1またはそのフラグメントが標識化された標識化ラミニン一 1 またはそのフラグメントである、 請求項 1記載の方法。
4 . サンプルが血液、 血漿または血清である、 請求項 1記載の方法。
5 . 請求項 1記載の方法により測定したサンプル中の抗ラミニンー 1抗体の測 定値から婦人科関連疾患を検出する方法。
6 . 婦人科関連疾患が、 習慣流産、 不妊症、 不育症または子宮内膜症である、 請求項 5記載の方法。
7 . 構成試薬としてラミニン一 1またはそのフラグメントを含み、 サンプル中 の抗ラミニンー 1抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキット。
8 . ラミニン一 1またはそのフラグメントが固相に固定化された固相化ラミニ ンー 1またはそのフラグメントである、 請求項 7記載のキット。
9 . ラミニン一 1またはそのフラグメントが標識化された標識化ラミニンー 1 またはそのフラグメントである、 請求項 7記載のキット。
1 0 . 請求項 7記載のキットにより測定したサンプル中の抗ラミニン— 1抗体 の測定値から婦人科関連疾患を検出する方法。
I I . 婦人科関連疾患が、 習慣流産、 不妊症、 不育症または子宮内膜症である、 請求項 1 0記載の方法。
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