SU575353A1 - Способ получени карбоксипептидазы - Google Patents

Description

1

Изобретеиие относитс  к способу получени  протеолитйческог о фермеита карбоксипептндаэы (КФ 3.4.12), примен емой в пищевой, текстильной и медицинской промывшейиости, а также в научной и лабораторной практике.

В промышленном масштабе карбоксипептидаэу получают из сырь  животного происхождени  - поджелудочной железы крупного рогатого скота - путем многостадийной очистки и выделени  фракции, содержащей карбоксипептидазу. В результате получают суспензию фермента, весьма нестойкую при хранении.

В насто щее врем  наиболее перспе тивн1 О4И  вл ютс - способы получени  ферментов из микробных источников дешевого сырь  и мощного продуцента ферментов со специфическими свойствами

Одним из таких способов  вл етс  получение карбоксипептидазиой фракции из проназы - ферментного комплекса актиномицета Streptomyce&grisetis (str . ) путем осаждени  белков сол ми , например сульфатом дк 1они , и органическими растворител ми, фракционировани  белков на ионообменных смолах и молекул рных ситах с выделением смеси ферментов, вход щих в состав

проназы, и кх хроматографировани  на колонке с амберлитом.

Белок карбоксипептидазной фракции осаждают из раствора сульфатом ак юни , осадок раствор ют в буфере и лл лее диализуют с получением фермеита в виде раствора.

К недостаткам известного способа относ тс  низкий выход целевого продукта и получение фермеита с ииэкими| удельными активностью и стабильность при хранении.

Цель изобретени  - повышение стабильности фермента, его удельной активности и выхода - достигаетс  тем, tTO из культуральной жидкости актинов мидета Str. fHeeus после фильтровани  осаждают белки добавлением сульфата аммони  до полного насыщени , а полученную после диализа карбоксипепг тидазу лиофилизируют в ацетатном буфере , содержащем ионы кальци , предпочтительно в 0,05 М ацетатном буфере , содержащем 0,01 М ацетат кальци 

Claims (2)

1. Пример. 1,5 л культуральной жидкое ти ьктиномицета Str. seus штамм С-5 полученной с Киевского завода медпр паратов , фильтруют, добавл ют к филь рату сульфат аммони  до полного насы щени  (700-720 г соли на 1 Л фильтра та), центрифугируют (4000-6000 об/ми на холоду в течение 1 час и суспенди руют осадок в 50 мл воды, содержащей 0,001 М ацетат кальци . Затем смесь диалиэуют 4-5 час проTHS проточной воды и 12 час против дистиллированной воды с добавлением 0|OQ1 М ацетата кгшьци . Объем жидкости после диализа увеличиваетс  до 100 мл. Диализат нанос т на колонку {5 х X 40 см) I заполненную натрийкарбокси метилцеллюлозой с емкостью 0,7 мг-эк Белковые фракции элюируют линейным градиентом хлорида натри  (в одном сосуде 0,005 М ацетатный буфер, содержащий 0,001 И ионов кальци , а в другом 500 мл 0,35 М раствора хлорида натри  в буфере). Полученную после хроматографии гре тью фракцию осаждают насыщенным рас твором (98%) сульфата аммони , центрифугируют на холоду, раствор ют в минимальном количестве 0,05 М ацетат ного буфера, содержащего 0,01 М гщетат кальци , и диализуют 2 час проти проточной воды 12 час против буфера. Полученный диализат нанос т на колонку (2 X 30 см) с амберлитом СУ-50 в Ма форме, уравновешенную тем же буфером, и элюируют белковые фракции линейным градиентом ацетата натри  ( в одном сосуде 500 мл 0,05 М ацетатного буфера, содержащего 0,01 М ионов кальци , в другом 1 М раствор ацетата натри  в этом же буфере). Полученную после хроматографии тре тью фракцию, содержащую карбоксипептидазу , осаждают сульфатом аммони , диализуют против ацетатного буфера и лиофилизируют в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальци . Получают препарат карбокснпептидаг|ы, гомогенной при рехроматографии на колонке с амберлитом СУ-50, при электрофорезе в полиакриламидном геле и пд N-концевому анализу (аланин). К преимуществам предлагаемого способа относ тс  получение высокоактивного , с.табильного (лиофилкэированный препарат, содержащий 5-10% белка, сохран ет свою активность в течение нескольких лет) препарата карбокси- : пептидазы с высоким выходом (выход по белку от белков культуральной згиАкости 4-5%, по активности 10-20%) из микробного сырь ,  вл ющегос  отходом при производстве антибиотиков. Формула изобретени  1.Способ получени  карбоксипептида ,зы из белкового сырь  актиномицета Straptomvces , включахнций , извлечение из сырь  белков осаждением сульфатом аммони , фракционирование белков ионообменной хроматографи ей с последующим диализом, отличающийс  тем, что, с целью по вшиени  стабильности фермента, его удельной .активности и выхода, в качестве белкового сырь  используют культуральную жидкость актиномицета, из которой после фильтровани  осаждают белки добавлением сульфата аммони  до полного насыщени , а полученную после диализа карбоксипептидазу лиофилизируют в ацетатиом буфере, содержащем иоиы кальци .
2. 2.Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что лиофилизацию провод т в 0,05 М ацетатном буфере, содержгицем 0,01 М ацетат кальци .