RU1836957C - Способ получени трофобластического бета @ -гликопротеина - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биологической химии и касаетс  способа получени  трофобластического бета 1-гликопротеина. Целью изобретени   вл етс  сокращение времени. Способ осуществл етс  путем обработки сыворотки ретроплацентарной крови или осадка As, полученного при производстве гамма-глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови, сульфатом аммони , затем осадок раствор ют в воде и последовательно подвергают гель-фильтрации на сефадексе Г-100 в 0,02 М аммоний- ацетатном буфере, затем ионообменной хроматографии а ДЕАЕ-целлюлозе, затем подвергают целевой продукт аффинной хроматографии на сефарозе, с иммобилизованным цибакрон-синим и гельфильтрации на сефадексе. Г-200.

Description

Изобретение относитс  к биологической химии, а именно к препаративной и биологической технологии и может быть использовано в технологии получени  очищенногопрепарата трофобластспецифического бета-гликопро- теина (ТБГ), содержащегос  в биологических жидкост х и ткан х.

ТБГ  вл етс  необходимым препаратом дл  иммунодиагностики беременности, ее патологий, а также дл  диагностики злокачественных новообразований, развивающихс  из трофобласта (элементов хориона). В будущем возможно применение препарата ТБГ дл  получени  антифертильных антисывороток и, в св зи с обнаружением у этого белка иммунорегул торных свойств, как им- муномодул гора при некоторых нарушени х иммунорегул торной функции организма.

Если дл  диагностических целей не особенно важна высока  степень нативности данного белка, то дл  и мму но модул   торных

применений ТБГ должен выдел тьс  в особо м гких услови х, В насто щее врем  в качестве сырь  дл  получени  ТБГ используетс  сыворотка крови беременных женщин , сыворотка ретроплацентарной крови, плацента, а также отходы сырь , используемого дл  производства гамма-глобулина-из ретроплацентарной крови, чаще всего осадок Аз.

Данный способ прин т нами за прототип .

Целью изобретени   вл етс  сокращение времени выделени  (с 4-5 суток до 20 ч).

Отличительными признаками изобретени   вл етс  то, что примен ема  лоследо- вательность действий,состо ща  из концентрировани  (осаждение сульфатом аммони ), гельфильтрации, при которой происходит определенное разведение материала при его очистке, концентрирование при ионообменной хроматографии и аффинной хроматографии, разведение при гель- фильтрации в системе летучего буфера с

СО CJ

Оч

чэ ел VI

оследующей лиофилизацией позвол ет не римен ть диализа, при котором особенно асходуетс  врем  из-за продолжительноти каждой пороцедуры диализа 1-2 суток, и озвол ет получить целевой продукт пракически без примесей солей, так как при гельфильтрации происходит заодно и обес- соливание. Кроме того, используютс  широко известные и общеприн тые в препаративной белковой химии реактивы: сефадексы и ДЕАЕ целлюлоза, а дл  аффин- . ной хроматографии используетс  иммоби- лизованный цибакрон синий краситель - аналог голубой сефарозы(способ получени  которого защищен нами А.с. 968040 авт. Те- рентьев АА.и.др.}. можно также использовать и фирменную Голубую сефарозу (Швеци , Фармаци  файн Кемиклз). Отсутствие диализа в нашем способе получени  способствует наибольшей сохранности на- тивности белка, так как известно, что в растворах с низкой ионной силой белки подвергаютс  микроденатурации, а ферменты быстро тер ют свою энзимную актив- ность. Данна  последовательность операций обеспечивает довольно хороший выход ТБГ (около 20%), причем чистота препарата составл ет 95-96%.

Сущность изобретени  по сн етс  следующими примерами. :..

Пример 1. К 100мл сыворотки ретроп- лацентарной. крови,содержащей 8 мг ТБГ, добавл ют сульфат аммони  в количестве 30 г( насыщени ) смесь инкубируют при перемешивании 1 час и далее центрифугируют 45 минут при 6000 об/мин, полученный осадок суспендируют в минимальном количестве воды, дистмллмоованной (получаетс  20 мл) и нанос т на колонку е сефа- дексом Г-100 (колонка 5x100 см), выдел   при гельфильтрации око о 90 мл фракции с максимальной концентрацией ТБГ(около 80 мг/л). Гелъфильтрацию проводили в 0,02 м аммоний-ацетатном буфере, Полученную фракцию, содержащую ТБГ подвергали ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- целлюлрзе в том же буфере, осуществл   з юцмю 0,2 М хлоридом натри ,-после отмывки от балластных белков 0,06 М хлоридом натри . Получали около 20 мл элюата с концентрацией белка около 320 мг/л. Этот элюатбез вс кой обработки подвергают аффинной хроматографии на сефарозе и иммобилизованным цибакроном синим. Отмывку провод т 0,2 М хлоридом натри , а элюцию 2,0 М хлоридом натри . Полученный элюат 5 мл с концентрацией ТБГ около 640 мг/л подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом Г-200 в 6,1 м аммоний-бикарбо- натном буфере рН 8.0, выдел   фракцию

5

0

белков с молекул рной массой 120000 даль- тон. При выделении узкого пика 22 мл с концентрациай ТБГ около 80 мг/л, получали препарат ТБГ чистотой около 95%. После лиофилизации было получено 2 мг белого белкового порошка ТБГ. Если учесть концентрацию белка 80 мг/л х 22 мл получено 1,76 мг ТБГ (выход целевого продукта около 22%), то есть в препарате присутствует не более 12% солей, оставшихс  в результате не полного обессоливани  при гельфильтрации . Это можно считать незначительными примес ми, так как даже многосуточный диализ не может обеспечить полноту обессо- ливани .

П ример2.50 г осадка As. содержащего 32 мг ТБГ раствор ют в 450 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 6000 об/мин 30 минут, надосадочную жидкость отдел ют и добавл ют к ней сульфат аммони  из расчета 300 г на 1 л (20% насыщени ), тщательно перемешивают и через час центрифугируют при vex же услови х. Осадок раствор ют в минимальном количестве дис- тилли рованной воды (получаетс  около 21- 22 мл раствора или суспензии) и нанос т на колонку с сефадексом Г-100, провод  гель- фильтрацию в тех же услови х, что и в примере 1. Получали 90 мл фракции с содержанием ТБГ около 320 мг/л. Эту фракцию подвергают ионообменной хроматографии в услови х аналогичных примеру 1. Получают около 20 мл элюата с концентрацией белкз - ТБГ около 1280 мг/л, который после очистки с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном цибакрон синем красителе при услови х аналогичных примеру 1, дал фракцию в количестве 5 мл с содержанием ТБГ 2560 мг/л. В результате гельфильтрации этой фракции при тех же услови х, что и в примере 1, получали 20мл раствора с концентрацией ТБГ около 400 мг/л. После лиофилизации получали 8 мг препарата ТБГ, практически без солей. Чи- стота препарата .выше 96%. Выход около 25%.

5

0

5

0

П р и м е р 3. 50 г осадка As обрабатывают полностью аналогично примеру 2. Только аффинную хроматографию провод т на фирменной Голубой сефарозе, в результате чего получают 5 мл элюата с содержанием ТБГ около 2000 мг/л, из которого после гель- фильтрации протекавшей в тех же услови х, что в примерах 1 и 2, получено 22,5 мл препарата ТБГ с содержанием 320 мг/л. После лиофилизации получено 7,2 мг препарата ТБГ практически не содержащего солей. Следовательно выход ТБГ около 22,5%. Чи- стота препарата выше 96%.

Контроль за чистотой препарата осуществл лс  иммунохимически и е помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Количественное определение ТБГ производили иммуннохимически.

Таким образом, предложенный способ получени  ТБГ имеет определенные преимущества перед известным, что св зано главным образом с сокращением времени на выделение препарата, отсутствием в про- цедуре выделени  диализа против низкоионных растворов, что должно способствовать максимальному сохранению нативности препарата ТБГ, что может играть важную роль при выделении ТБГ с дальнейшим использованием его как биологически активного вещества. Кроме того, разработка различных значительно отличающихс  между собой способов выделени  ТБГ позволит при промышленном внедре- нии способов уменьшить зависимость производител  от наличи  тех или иных реактивов.

Сочетание традиционных методов препаративной белковой химии (высаливание, гельфильтраци , ионообменна  хроматографи ) с аффинной хроматографией на иммобилизованном цибакрон--синем красителе с заключительным этапом гель- фильтрации на сефадексе Г-200 в летучем буфере позволило добитьс  не только высокой чистоты препарата, но и относительно хорошего его выхода по целевому продукту (22-25%) в м гких услови х за одни сутки.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  трофобластического бета1-гликопротеина путем обработки сыворотки ретроплацентарной крови или осадка Аа, полученного при производстве гамма- глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови, сульфатом аммони , хроматографии и лирфилизэции, о т л и ч а- ю щ и и с   тем, что, с целью сокращени  времени процедуры, после обработки сульфатом аммони  осадок последовательно подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-100 в 0.02 М аммоний-ацетатном буфере, фракции, содержащие целевой продукт, подвергают ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в том же буфере, отмывку от балластных белков провод т 0,06 М хлоридом натри  и целевой продукт элю- ируют 0,2 М раствором хлорида натри , затем подвергают его аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным цибакрон-синим красителем, отмывают от балластных белков 0,2 М и элюируют 2,0 М раствором хлорида натри , элюат подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-200 в аммоний-бикарбонатном буфере 0,1 М, рН8,0.