SU535912A3 - Способ получени орготеина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИНА

ни  растворителем, или сульфатам аммони  и/или ультрафильтрацией или мембранным диализом.

Если белковые примеси остаютс , они могут быть отделены после диализа, чтобы удалить протеолитически разрушенные белки путем адсорбции и последующим элюированием и слабо кислотной или слабо основной ионообменной колонки, или гелевой фильтрацией, хроматографией, фракцион-ное осаждение растворителем , например, ацетоном или этанолом , или сульфатом аммони  и нагревание, например, .при 70-75°С, чтобы осадить оставшиес  белковые Примеси.

Пример 1. 1 кг бычьей печени смешивают с 2 л 0,025М тройного буфера, рН 7,5 в 0,ЗМ сахарозе и 0,05М КС1. Суспензию центрифугируют в течение 1-2 ч. Мутный верхний слой жидкости занимает объем 2150 мл и имеет рН 6,3-100 мл порци  поверхностного сло  (60 мг протеина/мл, О-15 мг-0,3 мг орготеина/мл дигерируют при температуре окружающей среды в течение 20 ч в присутствии протеолитических ферментов: нроназы, панкреатина , субтилизина, нептидазы, папаина, бромелапна (ананаза).

Анализ электрофорограммы (после диализа дл  удалени  разрушенных нротеинов и фильтрации ) превращенного энзимами поверхностного сло  жидкости показывает, что при примен емых количествах 200 мг проназы и 15 мг Панкреатина они удал ют большую часть белковых примесей, следующий по эффективности субтилизин после папаина и бромелаина . Самые плохие результаты получают со свиной -пептидазой. Белковые примеси, оставшиес  после переваривани  с панкреатином и бромелаином, наиболее легко удал ют ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе .

Пример 2. 408 г свежей печени смещивают с 816 мл 0,025М трис (тройной буфер),рН 7,5, в 0,3 сахарозы и 0,05М КС1.

Суспензию центрифугируют в течение 1 ч. Мутный верхний слой жидкости имеет объем 800 мл и рН-6,3.

100 мл порцию верхнего сло  жидкости, содержащую 15-30 мг орготеина, подвергают в течение 2 дней при 37°С дигерированию (перевариванию) с некоторым количеством протеолитического энзима, с добавлением азида натри  (0,1%) как предохран ющего средства с последующим диализом.

Лучший результат получают с панкреатином , проназой и субтилизином, остаточный протеин легко удал ют пз панкреатиновой выварки путем ионнобменной хроматографии с ДЕЛЕ-целлюлозой.

Пример 3. 300 г печени смешивают с 600 мл 0,025М тройного буфера 0,025М глизина в 0,01М Мп++, рН 7,5.

Смесь (шлам) центрифугируют. Остаток намного лучше уплотн етс  в этом буфере. Верхний слой жидкости (110 мг протеина) мл измер етс  в 570 мл. Порцию подвергают ферментному перевариванию с панкреатином или проназой и подвергают диализу с целью отделени  орготеина от деградированных протеинов .

У панкреатина приблизительно одинакова  эффективность при всех испытуемых концентраци х (3-150 мг/мл). Пропаза менее эффективпа , когда разведена от 2 мг/мл до 0,02 или 0,04 мг/мл.

Пример 4. 300 г бычьей печени смешивают с 0,025М тройного буфера, 0,025 мг лицина в 0,01М Мп++, рН 7,5 в соотношении 2 мл буфера на 1 г печени. Шлам центрифугируют в течение 1 ч (экстрагированные протеины, 60 г/л поверхностного сло  лсидкости; орготеин приблизительно 150 мг/л). Приготовл ют раствор панкреатина (100 мг/мл) в 0,05М тройной НС1 - буфер, рН-7,5.

Верхний слой жидкости экстракта бычьей печени (рН 6,7) титруют до 7,5 рП с помощью 1М тройного буфера. К каждым 100 мл экстракта бычьей печени добавл ют 6 мл (0,6 г) раствора панкреатина и 1 мл 10% азида натри . Смесь (рН-7,5) инкубируют при 37°С в течение 2 дней, в течение которых цвет смеси мен етс  от красного до коричневатого (остаточный протеин, около 3 г/л, орготеин приблизительно 150 мг/л). Выдержанную смесь подвергают диализу через деионизированную воду в течение ночи и наконец в 0,005М. фосфатного буфера рН 6,0. Диализат центрифугируют в течение 1 ч и затем отфильтровывают через микрофильтр.

Фильтрат имеет рП 6,3.

Содержание орготеина в протеинах оставшеес  в них, более чем 5% по сравнению с 0,2% в растворимых протеинах, экстрагированных из исходного шлама.

Чистый орготеин удал ют из фильтрата.

Диэтиламиноэтилцеллюлозную ионообменную колонку наполн ют до 8,5 мл объема сло . Уравновешивают 0,005М фосфатным буфером , рН 6,0. Скорость протока 20 мл в час. 253 мл фильтрата, эквивалентных 82 г печени , загружают в эту -колонку. Колонку потом промывают 30 мл 0,005М фосфатного буфера с рН-6,0. Орготеин подвергают элюированию с линейным градиентом от 0,005М фосфата, рН 6, до 0,005 фосфата в 0,075 рН 6,0, в общем объеме 170 мл.

Трубки, содержащие орготеин, без .примесей помещают в одну фракцию, а те, которые содержат орготеин вместе с некоторыми примес ми- в другую фракцию. Обе фракции, кажда  диализировалась, стабилизируют давлением сахарозы, если необходимо, фильтруют и лиофилизируют.

Выход чистого Орготеина 27,6 мл (0,034%) в расчете на исходное количество печени; 62% от теоретических. Выход чистого орготеина 10 мг, дава  общий выхход орготеина 84% от теории.

Чистый орготеин быть рециркулирован или .далее очищен путем воздействи  других протеолитических энзимов, например, про 1Г13Ы , или гелспон, или ионообменной хроматографией .

Пример 5. Чтобы определить эффект протзедени  стадии гаротеолитического дигерировани  на различных стади х отделени  орготеина , вс  бычь  тгечень, растворимые протеины из бычьей печени и растворимые протеины из бычьей печени, обработанные теплом, подвергают ферментной очистке панкреатином . Чтобы получить экстракт растворимых нротеинов из бычьей печеии, 500 г (150 г твердых веществ) бычьей нечени смешивают в смесителе с одним литром буферного раствора 0,25М тройного, 0,025М глицина и 0,01М Мп++, рН-7,5, чтобы получить 1380 г/мл смеси , 100 мл порции полученной смеси подвергают обработке по стади м

A.Смесь центрифугируют, в течение 1 ч, получа  78 мл поверхностного сло  жидкости, содержащей 100% растворимых протеинов и 100% орготеина в исходной печени.

Б. 78 МЛ поверхностного сло  жидкости из стадии А подвергают протеолитическому разрущепию с помощью 300 мг панкреатина, pi-i-7,5; 24-28 час. 100% орготеина и общих растворимых нротеипов исходной печени остаютс .

B.100 мл исходной печеночной смеси подвергают тепловой обработке при 65°С в течение 15 мин, охлаждают и цеитрифугируют, получа  78 мл верхнего сло  жидкости и 7,6 г/ (89,5%) осажденных нерастворимых протеинов .78 мл поверхностного сло  жидкости затем подвергают обработке энзимами стадии 100% орготеина и ;6% общих растворимых протеинов исходной печени остаютс .

Г. 78 мл поверхностного сло  жидкости стадии А подвергают тепловой обработке стадии В. Выход от центрифугировани  60 мл (2,70 г твердых веществ) поверхностного сло  жидкости и 2,05 г осадка. 60 мл поверхностного сло  жидкости затем подвергают обработке протеолитическими энзимами стадии Б. Остаетс  3-6% растворимых протеинов. Теплова  обработка перед стади ми энзимной обработки делает последнюю более эффективной , потому, что на стади х В и Г остаетс 

только 3-6% растворимых протеинов, тогда на стадии В остаетс  больще чем 6%.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  орготеина из экстрактов животных тканей путем хроматографического фракционировани , отличающийс  тем, что, с целью повыщени  степени чистоты целевого продукта, экстракт предварительно обрабатывают протеолитическим ферментом.