SU1138410A1

SU1138410A1 - Способ выделени термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

Info

Publication number: SU1138410A1
Application number: SU823491319A
Authority: SU
Inventors: Михаил Александрович Володин
Original assignee: Астраханский государственный медицинский институт им.А.В.Луначарского
Priority date: 1982-09-10
Filing date: 1982-09-10
Publication date: 1985-02-07

Abstract

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ , предусма;тривак ций экстрагирование ткани раствором хлористого натри , прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийс тем, что, с целью увеличени выхода . целевого продукта и упрощени способа , перед диализом провод т повторное прогревание в присутствии 0,14-0,18%-ного сернокислого кадми iпри 62-65 С в течение 1-5 мин. (О

Description

00

эо 4 Изобретение относитс к медицине а именно в биохимии, и может быть использовано дл выделени термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы .. Известен способ вьщелени щелочно фосфатазы, включающий обработку гомо гената ткани бутанолом, фракционирование ацетоном и сульфатом аммони , гельфильтращт и ионообменную хро- . матографию С Недостатками данного способа вл ютс его сложность, длительность И. низкий вь;ход целевого продукта. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту вл етс способ вьщеле ни термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование ткани 3 М раствором хлористого натри , прогревание экстракта в течение 10 мин при фракционирование хлористым цетилпи ридинием и сульфатом аммони , диализ-. и очистку целевого продукта электрофорезом в полиакриламидном геле t Недостатками известного способа вл ютс невысокий выход целевого продукта (72%), а также его сложност заключающа с в наличии двух стадий фракционировани . Цель изобретени - увеличение выходацелевого продукта и упрощение способа. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу выделени термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование ткани раствором хлористого натри , прогревание экстракта , диализ и электрофорез в полиакри ламидном геле, перед диализом провод т повторное прогревание в присутствии О,14-0,18%-ного сернокислого кадми при 62-65 С в течение 1-5 мин. Эффективность очистки при варьировании в предлагаемых интервалах концентраций сернокислого кадми , температуры и времени практически не измен етс . За пределами этих интервалов или не достигаетс очистки фермента, например прогревание при 45°С, или происходит его инактиваци (табл. 1). Прогревание без добавлени сернокислого каДми приводит к 4,3-кратному увеличению удельной активности целевого продукта. Добавление сернокислого кадми в концентрации 0,14-0,18% не приводит к значительному увеличению удельной активности: в этом случае выпадает в осадок около 30% балластных белков и удельна активность фермента возрастает в 13,5 раз. Однако одновременное проведение двух обработок сернокислым кадмием и нагреванием, приводит к 15-кратной очистке с очень высоким выходом более 90%. П р им ер 1.1 этап. Приготовление плацентарного тканевого экстракта: гомогенизаци при 8000 об./мин в течение 5 мин отмытой от крови плаценты в 3 М растворе хлористого кали (вес-объемное соотнощение 1:3-4); перемешивание на магнитной мешалке при в течение 12 ч; центрифугирование при 6000 об./мин в течение 30 мин. Дальнейшее иссле- дование провод т с надосадочной жид-: костью после диализа против дистиллированной воды (2 смены по 60 .мин) и 0,1 моль раствора хлористого натри (2 сме.ны по 60 мин) . 2этап. Полученньй плацентарный экстракт прогревают при 65С в течение 10 мин и центрифугируют при 8000 об./мин в.течение 20-30 мин. 3этап. К надосадочной жидкости добавл ют сульфат кадми из расчета 0,14%-ной концентрации в итоговом растворе и проводитс повторное прогревание при 65с в течение 3 мин. Осадок отдел ют путем центрифугировани при 8000 об./мин в течение 2030 мин. 4этап. Надосадочную жидкость диализуют в течение 10-12 ч против ацетатного буфера (рН 4,5). 5этап. Дрочищение препарата проводитс методом препаративного диск-электрофореза в 7%-ном полиак-г риламидном геле с последующим извлечением из гел термостабильной щелочной фосфатазы электрофоретически. Гель, содержащий фермент, вырез-ают под визуальным контролем после окрашивани методом азосочетани (субстрат - нафтол - As - BS - фосфат, краситель - прочный синий соль В). Количество очищенной термостабильной щелочной фосфатазы определ ют меГодом Лоури. Результаты очистки термостабильной щелочной фосфатазы плаценты даны в табл. 2. 3 Пример 2. Выделение провод аналогично примеру 1, но используют 0,18%-ный раствор сульфата кадми . Выход на этой стадии составл ет 93% против 93,1% ПОпримеру 1. Зависимость активности щелочной фосфатаэы от условий выделени (тем пературы ц концентрации сульфата кадми ) дана в табл. 1. Прогревание при в течение 1 или 5 мин привод т к тем же результатам (табл. 1). При введении вместо сульфата кадми 0,28%-ного сульфата натри 04 при последующем прогревании не наблюдаетс увеличение выпадани в осадок балластных белков по сравнению с контрольным опытом, в котором не добавл ют никаких солей. Таким образом, использование предлагаемого способа позвол ет значительно увеличить выход целевого продукта с 72% до 92,9%, а также значительно упростить выделение фермента за счет замены стадий фракционировани хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммони простейшей стадией термообработки. Таблица 1

Прогревание при

Добавление сульфа кадми при прогревании

: 0,14% 0,18%

: 0,14% 0,18

80С : 0,14 0,18

0,26%

6850

2,3

100,0 9,8

15-20 93,8

. Экстракт после обрабохки хлористым

Таблица 2

Claims

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода . целевого продукта и упрощения способа, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии Ό,14-0,18%-ного сернокислого кадмия /при 62-65⁴С в течение 1-5 мин.