SU1082811A1

SU1082811A1 - Способ выделени термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

Info

Publication number: SU1082811A1
Application number: SU823406130A
Authority: SU
Inventors: Аркадий Михайлович Голубев; Олег Владимирович Морозкин; Павел Павлович Кулагин; Михаил Александрович Володин
Original assignee: Астраханский государственный медицинский институт им.А.В.Луначарского
Priority date: 1982-03-04
Filing date: 1982-03-04
Publication date: 1984-03-30

Abstract

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕННЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ , предусматривающий экстрагирование фермента из сырь , термообработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммони ,отличающийс тем, что, с целью повьшени сохранени активности фермента экстрагирование осуществл ют 3 М раствором хлористого кали при соотношении 1:

Description

00

IND

00 Изобретение относитс к биохимии и медицине и касаетс способов вьще лени ферментов, в частности щелочной плацентарной фосфатазы. Известно, что некоторые злокачественные опухоли обладают способнос тью к неосинтезу щелочной фосфатазы Значение, этого фермента весьма вели ко дл клинических наблюдений. Известен способ вьщелени термостабильной плацентарной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование фермента из сырь 30%-ным бутанолом фракционное осаждение ацетоном, кратковременную термообработку (обы но при ) , фракционирование белков сульфатом аммони (45-62%), хро матографию ферментсодержащего раствора на диэгиламиноэтилсефадексе А-50, гельфильтрацию на сефадексе G-100 и кристаллизацию С JОднако данный способ обеспечивает сохранение активности фермента л/52,3% (органические растворители вызывают денатурацию белка и увеличивают потери активности). Цель изобретени - повышение сохранени активности фермента. Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу вьщелени термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование фермента из сьфь , термо обработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммони , экстрагирование осуществл ют ЗМ раствором КС1 при соотношении 1:(3-4), дл фракционировани исполь зуют 1,0-1,5%-ный раствор хлористого цетилпиридини в 4-5-кратном избытке к обрабатываемому раствору и сульфат аммони в количестве 30-65% от степе ни насыщени . Способ обеспечивает сохранение активности фермента до 72%. Пример 1. Отмытую от крови человеческую плаценту (100,0 г) гомогенизируют при 8000 об/мин 5 мин. Добавл ют в соотношении 1:3 раствор 3 М КС1 и перемешивают на магнитной мешалке при 4с в течение 12 ч. Раст вор центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Осадок опбрасывают, иадосадочную жидкость диализируют против дистиллированной воды в 2 смены по 60 мин и против 0,1 н.раствора NaCl также в 2 смены по 60 мин. Экстракт прогревают при 10 мин.. К объему исходного гжстрпкт/ вл тт на магнитной мсчиллко раствор хлористого цетилпи1)ИЛ1)Н11Я в соотношении 1:4 и помещают и- :-:олод (-4°С) на 60 мин. Экстр к центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Падосадочную жидкость отбрасывают, а осадок раствор ют в 3,3%-ном pacTHOpe NaCl. Диализируют против дистиллированной воды 60 мин. На следующем этапе т-ихелени экстракт насыщают сернокислым аммонием (30%). Центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Осадок отбрасывают, а надоеадочкую жидкость насыщают 65%-нык сернокисл1.1м аммонием. Провод т диализ. Центрифугируют 6000 об/мин 30 мин, надосадочную жидкость отбрасывают , а осадок раствор ют в минимальном объеме трис-буфера (рН 8,6). После этих этапов пробы став т в препаративный электрофорез на 2 ч в полиакриламидном геле. Окрашивают на щелочную фосфатазу: субстрат нафтил Л8-Ол- 1)Осфат, краситель прочный синий ВВ-буфер веронал-мединаловый pf 8,6. Цод визуальным контролем выу резают фракции терм(5стабильной плацентарной щелочной фосфатазы I и II, т.е. получают в раздельном виде фракции изоэнзимов термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы I и II в чистом виде. Суммарное количество белка по Лоури 48 мг. Пример 2. Отмытую от крови плаценту (100,0) гомогенизируют 7000 об/мин 5 мин. Добавл ют 3 М КС1 в соотношении 1:4 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 14 ч. Раствор центрифугируют 5000 об/мин 25 мин. Осадок отбрасывают , а надосадочную жидкость диализируют в 2 смены против дистиллированной воды по 90 мин и в 2 смены по 90 мин против 1 н.раствора NaCl. Экстракт нагревают при 12 мин. Добавл ют 1,5%-ный цетшширидиний хлористый в соотношении 1:5 на магнитной мешалке, помещают на холод (-4 С) на 90 мин. Центрифугируют со скоростью 5000 об/мин 20 мин. Недостаточную жидкость отбрасывают, осадок раствор т н 4%-ном растворе NaCl. Диализируют против дистиллированной воды 90 мин. На следующем этапе насыщак-.-: сернокислым аммонием и интерпа.ги 3560% . Центрифугируют со скоростью 5000 об/мин 20 мин. ( p;uTiui inют в минимальном объеме трис-буфера (рН 8,6). Пробы став т в препаративный электрофорез в полиакриламидном геле. В результате осуществлени пред латаемого способа получены изоэнзимы термостабильной щелочной фосфатазы I и II в чистом виде. Суммарное коРезультаты выделени те плацентар-ной личество белка по Лоури 40 мг. Полученные фракции могут быть использованы дл получени моноспецифических сывороток дл использовани в медицине . Результаты выделени фермента приведены в табл. 1 и 2. Таблица 1 стабильной щелочной фатазы

Начальный Бутанольна 12970 12620 1,43 экстракци КС1-экстракци ( п1эедлагаемый способ) 12970 28600 Конечный выход Известный споПриме

Экстракт плаценты после об,работки 3 М хлористым калием

Конечный выход 2,2

100,0

68000

2,17 72,0 23,77 4,5 ча ние. Расчет производилс по количеству щелочной фосфатазы ( щ.ф.) в растворе бутанолового экстракта с учетом потерь в процессе выделени (прототип) и количеству выхода целевого продукта. Выделение плацентарной термостабильной щелочной 1,2 Таблица 2 фосфатазы

510828116

Предлагаемым способом достигает- ство реактивов, исключаетс применес сокращение времени исследовани ние высокоскоростных рефрижераторных

на 7-8 сут, увеличение выхода целе-центрифуг и дорогосто шей аппаратуры. вого продукта в чистом виде из состава тканевых мембран в 5-6 раз, а 5 Таким образом, способ обеспечиватакже при осуществпении предлагаемо-ет сохранение активности фермента

го способа требуетс меньшее количе-при выделении до 72%.

Claims

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммония,отличающийся тем, что, с целью повышения сохранения активности фермента экстрагирование осуществляют 3 М раствором хлористого калия при соотношении 1:(3-4), для фракционирования используют 1,0-1,5%-ный раствор хлористого цетилпиридиния в 4-5-кратном избытке к обрабатываемому раствору и сульфат аммония в количестве 3065% от степени насыщения.