DK146630B - Fremgangsmaade til fremstilling af gelatine ved forbehandling af collagenholdigt materiale med proteolytiske enzymer - Google Patents

Description

146630

Opfindelsen angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af gelatine, hvilken fremgangsmåde er af den i kravets indledning angivne art, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne.

5 Fra Chemical Abstracts 68—96816 y kendes en to-trins fremgangsmåde til fremstilling af gelatine omfattende en behandling af collagenholdigt materiale, kalveskind, med et proteolytisk enzym, pronase, under tilstedeværelse af CaCl^, og opvarmning til denaturering til β-kædemolekyler.

10 Fra Chemical Abstracts 73-78571 p kendes en tre trins fremgangsmåde til fremstilling af gelatine, omfattende en partiel hydrolyse af kalveskind i surt medium, enzymatisk hydrolyse ved pH 2,9 med et enzym frembragt af Aspergillus niger, og neutralisering af mediet og denatu-15 rering af collagenet ved opvarmning i 2,5 timer.

I Chemical Abstracts 78-160919 v sammenlignes de forskellige fremgangsmåder til fremstilling af gelatine fra svineskinds-collagen. Ved denne sammenligning giver pronase højere udbytter af gelatine end nogen 20 anden indtil da kendt enzymatisk fremgangsmåde, men denne oplysning refererer til fremstilling af gelatine ud fra collagenholdigt materiale ikke fra brusk eller kødaffald.

Fra Chemical Abstracts 79“122997 g kendes en behandling af kalveskind med proteaser fra Actinomyces fradiae 25 119.

Fra Chemical Abstracts 82-107985 v kendes virkningen af proteaser fra Actinomyces fradiae 119, der er blevet fraktionerede på carboxymethylcellulose, hvor de tre første fraktioner viste sig at besidde både elastolytiske, 30 proteolytiske og collagenolytiske egenskaber, hvorimod den fjerde fraktion kun havde proteolytiske og collagenolytiske egenskaber. En yderligere fraktionering af den første fraktion gav meget stærke proteaser, som hydrolyserer collagen og elastin til fire frie aminosyrer og små pepti-35 der. De andre enzymer, der er indeholdte i denne enzymblanding, har en peptidasisk aktivitet (enzymerne i den 2.

146630 2 og 3. fraktion hydrolyserer peptider med en molekylvægt mindre end 25.000). Brusk har imidlertid en molekylvægt på ca 130.000, og det er derfor usandsynligt, at disse enzymer kan have nogen virkning på brusk til fremstilling 5 af gelatine.

Fra tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.1^5.904 kendes en fremgangsmåde til forbedring af udbyttet af collagen, hvilken fremgangsmåde sammenlignes med fremgangsmåden, der er kendt fra fransk patentskrift nr. 1.1^9.555, hvor 10 kohud behandles med et proteolytisk enzym, såsom takadiasta-se eller pankreatin, efterfulgt af en opvarmning i surt medium. Det højere udbytte, der opnås ifølge det tyske fremlæggelsesskrift 1.1U5-90U opnås kun, når den proteo-lytiske behandling suppleres med en syrehydrolyse.

15 Fra tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.298.211 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af opløseligt collagen udfældet i form af fibre, og ved denne fremgangsmåde behandles ben med en enzymatisk opløsning, der er frembragt ved kultivering af stammen Aspergillus niger, og den resul-20 terende viskose opløsning gøres neutral, hvorefter det opløselige collagen udfældes. Denne fremgangsmåde omhandler altså ikke fremstilling af gelatine, men derimod opløselig collagen.

Ingen af disse kendte fremgangsmåder til fremstil-25 ling af gelatine anvender brusk, kødstykker og/eller kødaffald som udgangsmateriale, og ingen af disse kendte fremgangsmåder anvender en enzymatisk blanding, der er fremstillet ud fra næringsmedier af Streptomyces fradiae nr.

2019 eller Streptomyces fradiae nr. 1998 fra Museum d'Hi-30 stoire Uaturelle de Paris, og ingen af disse kendte fremgangsmåder gennemfører fremgangsmåden i et trin, men der kræves altid en yderligere behandling ud over den enzymatiske .

Enzymerne fra Streptomyces fradiae 1998 eller fra 35 Streptomyces fradiae nr. 2019 er kendte, men er hidtil kun blevet anvendt til terapeutiske formål, og det er der- 146630 3 for ikke nærliggende at anvende disse enzymprodukter til fremstilling af gelatine.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter således en hidtil ukendt et-trins-fremgangsmåde til fremstilling 5 af gelatine, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes en til fremstilling af gelatine hidtil ukendt og ikke nærliggende enzymblanding.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen medfører desuden den fordel, at man opnår gelatinen i et meget stort udbyt-10 te på ea 70 % i modsætning til de hidtil kendte fremgangsmåder, hvor man opnår gelatinen i et udbytte på ca 15 ? eller mindre, afhængigt af det udgangsmateriale der anvendes .

Uden at være bundet til nogle teoretiske betragtninger 15 må det antages, at de enzymatiske blandinger indeholdende Streptomyees fradiaenr. 1998 eller Streptomyces fradiaenr.

2019 angriber de glycoproteiner og de mucopolysaccharider, der er bundet til collagenet, og derved opnår man gelatinen i den mængde, der er langt større end den mængde, der 20 opnås ved de kendte fremgangsmåder.

Endvidere er den efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede gelatine af en meget fin kvalitet med et meget lavt indhold af mineralske stoffer på mindre end 1 %. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives nærmere i 25 det efterfølgende, hvor: den enzymatiske behandling udføres ved en temperatur mellem + 10°C og 50°C, fortrinsvis mellem 15 og 25°C, den enzymatiske behandling foretages i en tidsperiode på fra 30 min. til 25 timer afhængigt af det anvendte rå-30 materiale, fortrinsvis i fra 17 til 20 timer,

den enzymatiske behandling udføres ved en pH-værdi på fra 3 til 9, fortrinsvis fra ^ til 5S

isoleringen af gelatinen udføres ved filtrering eller centrifugering af reaktioneblandingen og ekstraktion af ge-35 latinen fra den uopløste rest med varmt vand. Temperaturen af det varme vand kan variere fra JO til 9°°c» it U6630 ekstraktionen af gelatinen fra den uopløste rest gennemføres ved kontakt mellem den uopløste rest og varmt vand i en tidsperiode på fra 30 min. til 90 min., isoleringen af gelatinen udføres ved inddampning af 5 den vandige ekstrakt til tørhed enten under reduceret tryk eller ved lyophilisering eller ved forstøvning, den enzymatiske blanding er fortrinsvis den, der opnås ved koncentrering af et næringsmedium indeholdende Streptomyces fradiae, stamme 2019.

10 Den således fremstillede gelatine kan anvendes i næ ringsmiddelindustrien som gelerende middel, f.eks. i dåsemad, desserter, konfekt, marmelade eller syltetøj. Den kan også anvendes i den pharmaceutiske industri til fremstilling af pharmaceutiske præparater indeholdende gela-15 tine, f.eks. injicerbare opløsninger af gelatine, og den kan endvidere anvendes som bindemateriale ved fremstillingen af tabletter eller mikrobedlets.

Endvidere indeholder den opløselige fraktion fra reaktionsblandingen sædvanligvis fra 10 til 20 % opløse-20 ligt materiale, som kan udvindes ved inddampning, forstøvningstørring eller lyophilisering af de vandige opløsninger til tørhed. Den således fremstillede tørre rest kan anvendes som dyrefoder, da den har et stort indhold af proteiner.

Den kan f.eks. blandes i foderblandinger.

25 Det følgende eksempel belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere.

Eksempel.

Trin A

Udgangsmaterialet kan være brusk, kødstumper eller 30 kødaffald. Dette råmateriale vaskes forud, men det er ikke obligatorisk. Råmaterialet moses ud og suspenderes derefter under omrøring i den vandige opløsning eller suspension af den enzymatiske blanding af Streptomyces fradiae nr. 2019.

35 Arten af det anvendte vand er uden betydning, der kan anvendes destilleret vand, afioniseret vand eller ledningsvand, uden at det har nogen indflydelse på gennemførel- 146630 5 sen af den enzymatiske reaktion.

Reaktionsblandingen holdes under omrøring, og pH-værdi-en indstilles på en værdi mellem k og 5, hvilken værdi synes at være optimal. Fra tid til anden kontrolleres pH-værdien 5 således, at den holdes inden for disse grænser.

Reaktionsblandingen holdes på en temperatur på 20°C - 5°C i 17 timer under fortsat omrøring. Herefter filtreres det uopløste materiale fra ved sugning og vaskes tre gange med koldt vand. Filtratet inddampes til tørhed og anvendes 10 som næringsmiddel eller som dyrefoder.

Den uopløste rest suspenderes under forsigtig omrøring i varmt vand, der forud er opvarmet til 80~90°C, til nedbrydning af den enzymatiske blanding og til opløsning af så meget gelatine som muligt hver gang. Efter en times kontakt 15 filtreres suspensionen ved sugning, det uopløste materiale tørres, og den vandige fase forenes med opløsningerne fra de forudgående gelatineudvindinger.

Disse vandige opløsninger klares og affarves ved tilsætning af små mængder trækul, filtreres og inddampes i va-20 kuum. Den tørre rest giver en meget ren gelatine.

Den uopløste rest fra filtreringen suspenderes derefter i varmt vand under de samme betingelser. Efter en times forløb skilles opløsningen fra, den uopløste rest vaskes igen med varmt vand og vaskevandet samles med filtratet. Den van-25 dige opløsning destilleres under reduceret tryk, og man får et andet udbytte af gelatine. Udbytte i alt JO %.

Trin B.

Til den fra trin A tilbageblivende uopløste rest sættes en ny vægtmængde brusk eller kødaffald. Hele blandingen 30 blandes med vand ved 20°C - 5°C og en yderligere mængde enzymatisk blanding tilsættes. Blandingen holdes under omrøring, og pH-værdien indstilles på mellem ^ og 5. Reaktionen udføres i 17 timer, som angivet i trin A, og den uopløste rest ekstraheres, som beskrevet i trin A.

35 På denne måde vil alt brusk blive omdannet til gela tine .

6 146630

Antallet af behandlinger kan gentages så mange gange som nødvendigt, indtil der ikke længere udvindes gelatine.

Den enzymatiske blanding fra Streptomyces fradiae har følgende analytiske specificationer: 5 Total proteolytisk aktivitet 7000 Ansonenheder/mg proteolystisk aktivitet, der ikke er inhiberet med aprotinin 5160 Ansonenheder/mg proteolytisk aktivitet, der ikke er inhiberet med trypsin- 1ø inhibitor fra sojabønner 5570 Ansonenheder/mg proteinindhold (Lowry's metode) ^5,7 % beregnet på det tørre materiale.

Elektroforese: hovedbestanddel komponent 2, som defi-neret af Morihara og coll. (Bio. Chim. Biophys. Acta 139 (1967) 382).