CN109371082B - 一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法 - Google Patents

一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫调节肽技术领域。本发明公开了一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其包括鱼鳞预处理、鱼鳞粉碎、鱼鳞脱钙、鱼鳞脱脂、鱼鳞酶解和后处理等步骤。本发明通过对加工过程中废弃的罗非鱼鱼鳞进行深加工高效地获得了一种具有显著免疫调控效果的免疫调节肽，其能够适用于慢性或预防性用途，也能够适用于广大人群，能够降低用药成本。

Description

一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫调节肽技术领域，尤其是涉及一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法。
背景技术
免疫系统对我们的生存至关重要，具有防御病原体的作用，但免疫系统易受到多种因素的影响，包括压力，不健康的生活习惯，病原体和抗原等。已发现的几种具有调节人体免疫应答的药物有环孢菌素，他克莫司，糖皮质激素，叶绿醇，马兜铃酸，白花丹素和左旋咪唑等。然而，由于这些药物的毒副作用和高成本限制了其在患者中的使用，并且大多数免疫调节药物不适用于慢性或预防性用途。研究表明，以食源性蛋白为原料，经商业化蛋白酶水解及分离纯化后得到的寡肽、多肽以及一些蛋白酶水解物混合肽在动物或细胞试验显示出显著免疫调控效果。罗非鱼加工过程中丟弃的鱼鳞中含丰富的胶原蛋白，是提取生物活性肽的优良原料。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用罗非鱼鱼鳞制备免疫调节肽的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.1～0.15mol/L的盐酸中浸泡1～2小时，之后沥干；
b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎至的鱼鳞浆；
c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入0.5～1.5mol/L的柠檬酸溶液并使液面没过鱼鳞浆，充分搅拌处理4～6小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗1～3次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1～1.5倍0.15～0.20mol/L的EDTA溶液，在35～40℃下搅拌处理1～2小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；
d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.5～0.8倍异丙醇，搅拌脱脂处理20～24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1～2mol/L的氢氧化钠溶液浸泡20～24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；
e）鱼鳞酶解：按蛋白酶的量为1500～2000U/g，料液比为1：（10～15）配制鱼鳞酶解液，在40～50℃下酶解5～7小时，制得酶解鱼鳞；
f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10～15min，冷却至室温后，在3～5℃，10000～14000rpm条件下离心处理15～20分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
鱼鳞中含有大量的钙质、重金属和灰分，这些杂质的存在会大大的影响酶解过程及酶解后产物的品质，因此在酶解前需要将这些杂质除去，但是在除去这些杂质的同时也要保护其中的蛋白质不会过多的流失。现有类似领域中，脱钙常采用酸法进行，但是酸法脱钙往往会造成蛋白质的大量流失，因此本发明中采用柠檬酸和EDTA组合的方式进行脱钙，利用这种方式在脱钙的同时也能实现灰分的去除，此外还可以减少EDTA的使用，降低处理成本。
虽然在脱钙过程中，柠檬酸和EDTA的浓度和添加量越高越有利于脱钙脱灰分的效果，但是在浓度和添加了增加到本发明中的范围后，效果增加不明显，因此为了结果成本实现最高效的脱钙，将柠檬酸的浓度设定为最高不超过1.5mol/L，EDTA溶液的浓度不超过0.20mol/L，并且对添加量进行了限定。
作为优选，步骤d）鱼鳞脱脂过程为，向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.7倍异丙醇，搅拌脱脂处理24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞。
作为优选，步骤e）鱼鳞酶解过程为，按蛋白酶的量为1500U/g，料液比为1：10配制鱼鳞酶解液，在45.5℃下酶解5.5小时，制得酶解鱼鳞。
作为优选，步骤f）后处理过程为，将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10min，冷却至室温后，在4℃，12000rpm条件下离心处理15分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
作为优选，步骤c）中，柠檬酸溶液加入后，液面高出鱼鳞浆的20～50%。
作为优选，步骤e）中采用中性蛋白酶，并将鱼鳞酶解液的pH值控制在7.0。
因此，本发明具有以下有益效果：本发明通过对加工过程中废弃的罗非鱼鱼鳞进行深加工高效地获得了一种具有显著免疫调控效果的免疫调节肽，其能够适用于慢性或预防性用途，也能够适用于广大人群，能够降低用药成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料均可从市场上购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.1mol/L的盐酸中浸泡1小时，之后沥干；
b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎至的鱼鳞浆；
c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入0.5mol/L的柠檬酸溶液并使液面没过鱼鳞浆并高出鱼鳞浆的20%，充分搅拌处理4小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗1次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1倍0.15mol/L的EDTA溶液，在35℃下搅拌处理1小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；
d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.5倍异丙醇，搅拌脱脂处理20小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡20小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；
e）鱼鳞酶解：按蛋白酶的量为1500U/g，料液比为1：10配制鱼鳞酶解液，在40℃下酶解5小时，制得酶解鱼鳞；
f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10min，冷却至室温后，在3℃，10000rpm条件下离心处理15分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
实施例2
一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.15mol/L的盐酸中浸泡2小时，之后沥干；
b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎至的鱼鳞浆；
c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入1.5mol/L的柠檬酸溶液并使液面没过鱼鳞浆并高出鱼鳞浆的50%，充分搅拌处理6小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗3次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1.5倍0.20mol/L的EDTA溶液，在40℃下搅拌处理2小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；
d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.8倍异丙醇，搅拌脱脂处理24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用2mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；
e）鱼鳞酶解：按蛋白酶的量为2000U/g，料液比为1：15配制鱼鳞酶解液，在50℃下酶解7小时，制得酶解鱼鳞；
f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶15min，冷却至室温后，在5℃， 14000rpm条件下离心处理20分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
实施例3
一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.125mol/L的盐酸中浸泡1.5小时，之后沥干；
b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎至的鱼鳞浆；
c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入1.0mol/L的柠檬酸溶液并使液面没过鱼鳞浆并高出鱼鳞浆的35%，充分搅拌处理5小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗2次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1.25倍0.175mol/L的EDTA溶液，在37℃下搅拌处理1.5小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；
d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.65倍异丙醇，搅拌脱脂处理22小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡22小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；
e）鱼鳞酶解：按蛋白酶的量为1700U/g，料液比为1：12配制鱼鳞酶解液，在45℃下酶解6小时，制得酶解鱼鳞；
f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶12min，冷却至室温后，在4℃，13000rpm条件下离心处理17分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
实施例4
一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.13mol/L的盐酸中浸泡1～2小时，之后沥干；
b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎至的鱼鳞浆；
c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入1.2mol/L的柠檬酸溶液使液面没过鱼鳞浆并高出鱼鳞浆的40%，充分搅拌处理6小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗3次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1.5倍0.18mol/L的EDTA溶液，在35℃下搅拌处理1小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；
d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.7倍异丙醇，搅拌脱脂处理24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；
e）鱼鳞酶解：按中性蛋白酶的量为1500U/g，料液比为1：10配制鱼鳞酶解液，鱼鳞酶解液pH值控制在7.0，在45.5℃下酶解5.5小时，制得酶解鱼鳞；
f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10min，冷却至室温后，在4℃，12000rpm条件下离心处理15分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
试验例1 最优酶种的选择
本试验例中采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对罗非鱼鱼鳞进行水解并采用MTT法检测各酶解产物对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响按照式（1）计算巨噬细胞 RAW264.7相对增殖率，并以其为指标，筛选最优酶种。
其中，酶解环境采用针对各酶种的最优酶解环境，胃蛋白酶的酶解pH为2.0，酶解温度为37℃，木瓜蛋白酶的酶解pH为6.0，酶解温度为60℃，中性蛋白酶的酶解pH为7.0，酶解温度为45℃，胰蛋白酶的酶解pH为8.0，酶解温度为37℃，酶解原料采用按实施例1-4步骤a）-d）制得的预处理鱼鳞。
其中相对增值率的计算公式如下：
相对增值率/%=（实验组OD490nm-空白对照组OD490nm）/（空白对照组OD490nm）×100
由试验可知，四种蛋白酶中，中性蛋白酶酶解产物作用下的RAW264.7细胞相对增殖率最高（42.48 %），其后依次是胃蛋白酶(24.62 %)、木瓜蛋白酶(12.35 %)和胰蛋白酶(9.24 %)。因此选择中性蛋白酶为最优酶种。
试验例2 酶解条件的优化
经单因素实验，采用软件 Design Expert V8.0.6 建立三因素三水平的Box-Behnken响应面实验， 探求罗非鱼鱼皮中性蛋白酶酶解最佳工艺条件。 以巨噬细胞RAW264.7相对增殖率（Y/%）为考察指标，酶解温度（A），酶解时间（B）及液料比（C）为自变量，通过响应面回归模型的分析，以相对增值率为评价指标，最适提取工艺参数为提取时间5.52 h，温度45.27 ℃，液料比为9.82:1 (mL/g)。在此条件下，模型预测相对增值率为57.80 %。考虑到实际应用过程中操作简便，将工艺条件修正为提取时间5.5 h，温度45.5℃，液料比为10:1 (mL/g)所得酶解产物作用下的RAW264.7细胞相对增殖率为57.47%。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.1～0.15mol/L的盐酸中浸泡1～2小时，之后沥干；
b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎制得 鱼鳞浆；
c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入0.5～1.5mol/L的柠檬酸溶液并使液面没过鱼鳞浆，充分搅拌处理4～6小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗1～3次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1～1.5倍0.15～0.20mol/L的EDTA溶液，在35～40℃下搅拌处理1～2小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；
d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.5～0.8倍异丙醇，搅拌脱脂处理20～24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1～2mol/L的氢氧化钠溶液浸泡20～24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；
e）鱼鳞酶解：按蛋白酶的量为1500～2000U/g，料液比为1：（10～15）配制鱼鳞酶解液，在40～50℃下酶解5～7小时，制得酶解鱼鳞，蛋白酶为中性蛋白酶，将鱼鳞酶解液的pH值控制在7.0；
f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10～15min，冷却至室温后，在3～5℃，10000～14000rpm条件下离心处理15～20分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
2.根据权利要求1所述的一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）鱼鳞脱脂过程为，向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.7倍异丙醇，搅拌脱脂处理24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞。
3.根据权利要求1所述的一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤e）鱼鳞酶解过程为，按蛋白酶的量为1500U/g，料液比为1：10配制鱼鳞酶解液，在45.5℃下酶解5.5小时，制得酶解鱼鳞。
4.根据权利要求1所述的一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤f）后处理过程为，将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10min，冷却至室温后，在4℃，12000rpm条件下离心处理15分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。
5.根据权利要求1所述的一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤c）中，柠檬酸溶液加入后，液面高出鱼鳞浆的20～50%。
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