CN105274171A - 一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，属于食品加工技术领域；以罗非鱼鱼皮为原料，经预处理、提取后，通过菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶酶解、离心、超滤、喷雾干燥，得到罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽；其酶解条件为：将罗非鱼皮蛋白预处理提取后，先添加菠萝蛋白酶，酶添加量为：1000-3000U/g，温度为30-50℃，pH值为3-5，酶解时间为1-3小时，之后添加碱性蛋白酶，酶添加量为：3000-4000U/g，温度为50-60℃，pH值为7-9，酶解时间为2-3小时；本发明制备的抗氧化活性肽抗氧化效果显著，其DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为1.23？mg/mL和1.68mg/mL，是一种极具潜力的生物活性肽原料。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，具体涉及一种抗氧化效果显著的罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽的制备方法，属于食品加工技术领域。
背景技术
近年来罗非鱼被视为传统白肉鱼种的替代品种，正日渐受到欧美市场的青睐，在欧美国家有“白色三文鱼”之美誉，目前美国已成为全球消费和进口罗非鱼的最大市场，而且其需求量每年都有增长，国际市场对罗非鱼的巨大需求，推动了罗非鱼养殖业和加工业在我国的迅速发展。据有关资料介绍，2005年全国罗非鱼年总产量为104万吨左右，是世界上罗非鱼最主要的生产地，出口罗非鱼片在创造巨大经济利润的同时，也产生了大量的鱼皮等加工废弃物，对这些废弃物的处理，大多数工厂采用掩埋丢弃或作为饲料的原料，这不仅造成资源的极大浪费，更严重的是直接导致环境的污染。
罗非鱼皮中存在大量胶原蛋白。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还存在具有生理活性的肽。这些特性使胶原蛋白及其水解产物在医疗、保健及美容方面具有良好的应用前景，从可食用的和摄影等用的明胶，到肠衣和功能食品添加剂，都有广泛的应用，可溶性胶原蛋白还可用于整容、化妆品及医药卫生方面。目前，我国的胶原蛋白产品通常从含有结缔组织的屠宰动物废料中制取，水产动物皮中的胶原蛋白的利用几乎是空白。从水产胶原中得到的活性肤具有许多独特的生理功能，如保护胃粘膜及抗溃疡作用、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗氧化、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等多种生理活性功能。目前国外关于活性肤的研究极为活跃。现代研究证明，人体内自由基过多，可使蛋白质、糖类、核酸和脂质发生氧化和破坏，是造成衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等的主要因素之一。因此，本专利选择鱼皮为研究对象，不仅可以回收利用鱼皮中的胶原蛋白，扩大胶原蛋白和抗氧化肤的资源，拓宽胶原蛋白的应用范围，还可以避免鱼皮等废弃物对环境的污染，具有重大的经济价值和良好的社会效益。针对此现象，中国专利CN101225104开发了罗非鱼鱼皮小分子肽螯合锌盐的制备方法，但没有涉及到抗氧化活性肽的制备方法。因此，目前罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽的研究是一个新的领域。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种具有显著抗氧化效果的罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽的制备方法，能充分满足市场上对抗氧化活性肽的需求，最大限度的为人类提供健康的食品原料，并在此基础上实现罗非鱼加工下脚料—鱼皮的高值化利用。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）预处理：清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.1-0.13mol/L的盐酸溶液和0.1-0.12mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1-2小时；
（2）水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45-50℃条件下，用1-2倍体积的蒸馏水恒温匀浆8-10小时后，抽滤提取上清液；
（3）菠萝蛋白酶酶解：酶添加量为：1000-3000U/g，温度为30-50℃，pH值为3-5，在该条件下酶解1-3小时；
（4）碱性蛋白酶酶解：酶添加量为：3000-4000U/g，温度为50-60℃，pH值为7-9，酶解时间为2-3小时；
（5）离心超滤：将上述酶解液5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
（6）喷雾干燥：将上述超滤液在120-160℃条件下喷雾干燥即得到罗非鱼雨皮抗氧化活性肽。
本发明的显著优点是：
（1）本发明制备的抗氧化活性肽抗氧化效果显著，其DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为1.23mg/mL和1.68mg/mL，是一种极具潜力的生物活性肽原料；
（2）生物活性肽由于其安全、易吸收、成本低等特点，具有良好的市场前景。本发明采用酶法水解米渣蛋白制备抗氧化活性肽，不仅原料成本低廉，而且所得到的活性肽具有氨基酸组成合理、低过敏性、安全可靠等特点，特别是具有较强的抗氧化性，是极具潜力的一种功能性食品基料；
（3）本发明是以罗非鱼加工下脚料—鱼皮为原料，提供一种利用复合酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，大大提高了罗非鱼下脚料的附加值，且生产成本低，工艺简便，绿色环保，实现了罗非鱼下脚料的高值化利用，具有很好的应用价值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）预处理：清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡2小时；
（2）水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45℃条件下，用2倍体积的蒸馏水恒温匀浆8小时后，抽滤提取上清液；
（3）菠萝蛋白酶酶解：酶添加量为：3000U/g，温度为30℃，pH值为5，在该条件下酶解3小时；
（4）碱性蛋白酶酶解：酶添加量为：3000U/g，温度为50℃，pH值为9，酶解时间为3小时；
（5）离心超滤：将上述酶解液5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
（6）喷雾干燥：将上述超滤液在160℃条件下喷雾干燥即得到罗非鱼雨皮抗氧化活性肽。
实施例2
一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）预处理：清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.13mol/L的盐酸溶液和0.12mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1小时；
（2）水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在50℃条件下，用1倍体积的蒸馏水恒温匀浆8小时后，抽滤提取上清液；
（3）菠萝蛋白酶酶解：酶添加量为：1000U/g，温度为50℃，pH值为3，在该条件下酶解1小时；
（4）碱性蛋白酶酶解：酶添加量为：4000U/g，温度为60℃，pH值为7，酶解时间为2小时；
（5）离心超滤：将上述酶解液5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
（6）喷雾干燥：将上述超滤液在120℃条件下喷雾干燥即得到罗非鱼雨皮抗氧化活性肽。
实施例3
称取900.8g冲洗干净的罗非鱼鱼皮，脱脂处理后依次用700ml的0.11mol/L的盐酸溶液和0.11mol/L的氢氧化钠溶液浸泡2小时，蒸馏水洗涤至中性后，在48℃条件下，用1500ml的蒸馏水恒温匀浆10小时，抽滤提取得到上清液；
在上清液中按照2500U/g的量添加菠萝蛋白酶，调整温度为45℃，pH值为4，在该条件下酶解2.5小时；
菠萝蛋白酶酶解结束后，按照3500U/g的量添加碱性蛋白酶酶解，调整温度为55℃，pH值为8.5，酶解时间为2.5小时；
将上述酶解液5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
将上述超滤液在150℃条件下喷雾干燥即得到罗非鱼雨皮抗氧化活性肽。
DPPH自由基清除活性的测定：清除稳定的DPPH自由基的能力已被广泛用来测试各种抗氧化物的抗氧化能力。不同浓度的罗非鱼鱼皮酶解产物的DPPH自由基清除能力随着浓度的增加而增长。经计算，当酶解产物的浓度达到8mg/mL时其DPPH自由基清除率可达99.88%，表现出与Vc相似的自由基清除能力。
用IC50值（清除率为50%时的抗氧化剂浓度）来评估清除能力，IC50值越低表示自由基清除能力越高。罗非鱼鱼皮酶解产物的IC50值为1.23mg/mL。
羟自由基清除活性测定：细胞中发生的许多生化反应均与羟自由基有关，它可导致DNA断裂、突变、脂质氧化、蛋白质变性等多种病理性变化，羟自由基是已知的最强氧化剂。罗非鱼鱼皮酶解产物的羟自由基清除能力随着酶解产物浓度的增加而增加。经计算当酶解产物浓度为9mg/mL时米渣蛋白酶解产物的羟自由基清除率为99.89%，表现出与Vc相似的自由基清除能力。罗非鱼鱼皮酶解产物的IC50值为1.68mg/mL。
Claims (1)
1.一种利用复合蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）预处理：清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.1-0.13mol/L的盐酸溶液和0.1-0.12mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1-2小时；
（2）水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45-50℃条件下，用1-2倍体积的蒸馏水恒温匀浆8-10小时后，抽滤提取上清液；
（3）菠萝蛋白酶酶解：酶添加量为：1000-3000U/g，温度为30-50℃，pH值为3-5，在该条件下酶解1-3小时；
（4）碱性蛋白酶酶解：酶添加量为：3000-4000U/g，温度为50-60℃，pH值为7-9，酶解时间为2-3小时；
（5）离心超滤：将上述酶解液5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
（6）喷雾干燥：将上述超滤液在120-160℃条件下喷雾干燥即得到罗非鱼雨皮抗氧化活性肽。
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