CN101570772A - 一种天然骨胶原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种天然骨胶原的制备方法,其采用从畜禽骨中提取和纯化,包括如下步骤:清洗;粉碎;脱脂、脱无机物;酸浸泡;酶水解;分离纯化;冷冻干燥。采用本发明方法制得的天然骨胶原,能保持完整的胶原三螺旋结构,从而保留了生物活性,并且纯度能达到90%以上,具有较高的提取率,可以广泛应用于食品、化妆品、生物医学等领域。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域,具体地说,涉及一种从畜禽骨中提取和纯化天然骨胶原的方法。
背景技术
我国是世界第一肉类生产大国,畜禽骨约占动物体重的20%-30%,每年能产生约近2000万吨的畜禽骨,多以初级形式加工为主,利用率不足10%,造成一定环境污染。目前,骨的深加工逐渐受到行业的重视,如何充分利用畜禽骨骼资源,是迫切需要解决的问题。
骨的营养价值丰富,骨中的粗蛋白、脂肪含量与肉十分接近,骨髓中的磷蛋白、磷脂质、胆碱、软骨素、骨胶原等,亦是无法从其他物质中获取。此外,骨中钙和磷的比例为2∶1,最适宜人体对钙磷的吸收。
在种类繁多的蛋白质中,胶原是一类重要的蛋白质,它是细胞外基质的一种结构蛋白质,含有一个或几个由α-链组成的三螺旋结构的区域。它广泛存在于从低等脊椎动物到哺乳动物机体的一切组织中,广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质,占体内蛋白质总量的25-30%,其中90%存在于皮肤和骨骼中。胶原亦是骨骼中含量最多的蛋白质,占骨骼中蛋白质总量的80%以上,胶原在骨质中呈网状结构,能够使骨的硬度和韧性增强。通常胶原蛋白是指具有的三螺旋结构没有改变,且保留生物活性的蛋白质;明胶则指三螺旋结构发生改变,且不具有生物活性的蛋白质。若它们被水解成小分子,则称为胶原多肽。胶原含有多种类型,不同类型提供的功能不同,主要有改善骨质疏松、保持皮肤弹性与湿润,防止老化、为骨骼、腱、角膜、皮肤、血管提供支架等重要功能。胶原蛋白可以成为重要的生物医学材料和工业材料,在美容、保健、食品和饲料工业也能发挥重要作用,如在手术缝合线、止血海绵、人工血管角膜、神经修复等的临床应用中。
涉及骨胶原方面的专利有一些,比如专利文献CN 1334302(发明名称为骨胶原的制备方法)、CN 1334026(发明名称为骨胶原复合调味料的制备方法)、CN 1033481(发明名称为从猪牛羊骨中提取骨胶原蛋白的制备工艺)、CN 1028379(发明名称为鹿骨胶原软胶囊及其制造方法)等,均公开的方法是采用将破碎后的骨块加热蒸煮,加入蛋白酶进行酶解等步骤进行生产,骨胶原进行了深度水解,转变成为骨胶原多肽。
专利文献CN 1385489(发明名称为从动物软骨中提取复合骨胶原的加工工艺),公开了一种从动物软骨中提取复合骨胶原的加工工艺,该工艺包括如下步骤:选料清洗→碱性水溶液水解→冷却加酸→过滤→浓缩→酒精沉淀→脱水→烘干包装。改变了原有物质的分子结构,胶原蛋白不存在生物活性。
专利文献CN 1473901(发明名称为酶降解骨胶原制备明胶的方法),公开的是一种获取明胶的制备方法。
专利文献CN 1763135(发明名称为一种骨胶原凝胶液的制备方法)涉及生物医学工程领域,是一种为进行双相接种法构建组织工程骨而制备骨胶原的方法,特别是一种骨胶原凝胶液的制备方法,偏重于骨架的构建。
本发明提供的天然骨胶原的制备方法,可以使胶原保持完整的三螺旋结构,从而保留了生物活性,并且通过提取,纯度可达到90%以上,具有较高的提取率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作相对简单、提取率高的从畜禽骨中提取和纯化天然骨胶原的方法。
本发明的天然骨胶原的制备方法,其采用低温处理工艺,包括如下步骤:
1)清洗:将新鲜畜禽骨进行水清洗;
2)粉碎:将清洗后的畜禽骨进行粉碎至粒度80~120目的骨泥;
3)脱脂、脱无机物:将骨泥与NaOH溶液或NaHCO3溶液进行混合,搅拌后分层,取底层,并用水进行洗涤,分离得蛋白质,再将其用石油醚或者丙酮浸提,浸提分离后的蛋白质中加入EDTA,搅拌均匀后,静置,然后用蒸馏水反复洗涤、过滤,得过滤物;再用盐酸胍-Tris-HCl混合搅拌,静置,然后用蒸馏水反复洗涤、过滤,得过滤物;
4)酸浸泡:将过滤物用酸浸泡;
5)酶水解:再加入蛋白酶进行酶解;
6)分离、纯化:然后离心分离,取上清液进行盐析,盐析的沉淀物用乙酸溶液溶解,再经盐析、膜透析处理得透析物;
7)冷冻干燥:最后将透析物离心处理,并经冷冻干燥而成。
其中,所述的畜禽骨为牛骨、猪骨、羊骨、鸡骨等畜禽骨。
所述低温为0~10℃,即脱脂、脱无机物、酸浸泡、酶水解、分离纯化均在0~10℃下进行,保持了胶原的生物活性。
步骤2)中所述粉碎可经过强力破骨、细粉碎两次粉碎处理。
所述强力破骨采用破骨机进行处理,粗粉碎后的粒度≤1mm。为了保证鲜骨的顺利出料,在粉碎时添加适量的冰水,冰水的添加量为鲜骨重量的30~40%。
所述细粉碎采用骨泥磨进行两道磨碎,第一道骨泥磨转子和定子的间隙大,第二道骨泥磨转子和定子的间隙小,细粉碎后得到80~120目的骨泥。
磨碎之前将冰屑与物料混合均匀,控制物料出口温度≤10℃,冰屑的添加量为鲜骨重量的30~40%。
步骤3)中NaOH溶液的质量百分浓度为0.4~0.8%,NaHCO3溶液的质量百分浓度0.8~1.6%,pH控制为9~12。
搅拌的速度为60~90rpm/min,时间为6~10小时,直至液面上没有脂肪凝聚。
搅拌脱脂后,脂肪聚集成团浮在液面,蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪,用热水洗涤,去除残留的碱,直至脂肪呈中性,得到骨油和脱脂骨泥,其进一步处理可得骨粉。
底层的蛋白质和无机物采用冷水搅拌洗涤,由于密度不同将其进行初步分离,初步分离的蛋白质再加入3~5倍重量份的石油醚或丙酮,浸提4~24小时,可采用多次浸提,优选浸提1~3次。
所述的EDTA溶液的浓度为0.01~3mol/l,用量为蛋白质重量的2~15倍。所述的盐酸胍-Tris-HCl浓度为0.5~5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl,用量为1~20倍蛋白质重量。
静置温度为10℃以下,时间为4~24hr。
蒸馏水反复洗涤的次数为3~6次。
步骤4)中所述酸浸泡的pH值控制在1.5~5之间,优选采用5~15倍所述过滤物重量的0.05~3mol/l的醋酸溶液、0.01~2mol/l的柠檬酸或0.01~0.1mol/l的盐酸溶液进行浸泡,时间为12~72hr。
步骤5)中所述蛋白酶为pH1.5~5的胃蛋白酶、pH6~8的木瓜蛋白酶或pH8~10的胰蛋白酶,用量为蛋白质量的0.1~5%,时间为24~96hr。
步骤6)中在离心分离时还可加入EDTA溶液,浓度为0.001~0.04mol/l,用量为分离液重量的0.1~15倍。
离心分离在离心机中进行,转速为5000~15000rpm,离心时间为10~50分钟。
取上清液进行盐析时,可采用氯化钠,浓度为0.5~3mol/l,一般静置12~48hr。然后用转速为7000~15000rpm离心机离心10~50分钟分离。
沉淀物用乙酸溶液(浓度为0.1~3mol/l)完全溶解,溶解后再加入氯化钠盐析,可进行1~6次。
所述膜透析处理是以蒸馏水为透析液,经过透析膜(MW>1000)透析24~96hr。可进行1~3次。
步骤7)中在0~10℃下,将透析物用转速为7000~15000rpm离心机,离心10~50分钟。不溶物置于冻干机,冷冻干燥12~48hr。
本发明从畜禽骨中提纯天然骨胶原的方法,采用于畜禽骨中低温提取胶原,得到的胶原具有完整的三螺旋结构,从而保留了生物活性,并且纯度能达到90%以上,具有较高的提取率,可以广泛应用于食品、化妆品、生物医学等领域。
附图说明
图1为紫外分光光度计测定本发明的天然牛骨胶原在228nm处的吸收图;
图2为傅立叶变换红外光谱仪测定的天然骨胶原的吸收图;
图3为SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
实施例1从牛骨中提纯天然牛骨胶原粉
天然胶原从动物皮中提取比较多见,但是从骨中提取很少见,它涉及到脂肪和无机物含量高,提取率和提纯率难等特点,尤其牛骨,
本实施例从牛棒骨中提纯天然牛骨胶原粉,由下述步骤制得:
(1)清洗:采用鲜牛棒骨1000g作为原料,经水清洗,确保原料骨符合卫生要求。
(2)强力破骨:将清洗后的牛棒骨用破骨机进行强力破骨。为了保证鲜骨的顺利出料,在粉碎时添力300g的冰水,粗粉碎后的粒度≤1mm。
(3)细粉碎:将强力破骨后的物料用骨泥磨进行两道磨碎,第一道间隙大,第二道间隙小,在磨碎之前将冰屑与物料混合均匀,控制物料出口温度≤10℃,冰屑的添加量为鲜骨重量的40%。细粉碎后得到粒度120目的骨泥。
(4)脱脂、脱无机物:采用化学方法进行脱脂。在室温下,选择0.4%的NaOH溶液,骨泥混合均匀,使pH达到10,在80rpm/min的搅拌速度下,脱脂10小时。脱脂后,脂肪聚集成团浮在液面,蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪,用热水洗涤,去除残留的碱,直至脂肪呈中性,得到骨油和脱脂骨泥;用冷水搅拌洗涤剩下的蛋白质和无机物,由于密度不同将其进行初步分离,初步分离的蛋白质再加入3倍重量份的石油醚,浸泡12小时,倒出浸提液,这样用石油醚浸提2次,分离出来的蛋白质加入10倍重量份的0.5mol/l的EDTA,搅拌均匀后,置于冰箱(4℃)静置24hr,用蒸馏水反复进行洗涤3次,过滤、去除滤液。分离出来的蛋白质加入1倍重量份的5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl,搅拌均匀后,置于冰箱(4℃)静置8hr,用蒸馏水反复进行洗涤6次,过滤、去除滤液。
(5)酸浸泡:在4℃下,加入5倍重量份的0.1mol/l的盐酸溶液,控制pH值为2.5,静置36hr。
(6)酶水解:在10℃下,加入蛋白质量2%的胃蛋白酶(pH值2.5),搅拌24hr。
(7)分离:加入5倍重量份的0.04mol/l的EDTA溶液,搅拌均匀,在4℃下,将混合液用转速为10000rpm的离心机,离心30分钟。
(8)纯化:取上清液进行盐析,氯化钠浓度为1.0mol/l,4℃下,静置24hr,将混合液用转速为10000rpm离心机,离心20分钟。沉淀物用200倍量的0.1mol/l的乙酸溶液,完全溶解,溶解后再加入氯化钠,浓度为1.0mol/l,如此反复进行盐析3次。再以蒸馏水为透析液,经过透析膜透析32hr,反复2次。
(9)冷冻干燥:在4℃下,将透析物用转速为7000rpm离心机,离心10分钟。不溶物置于冻干机,至其水分含量小于3%,制得天然、未变性的骨胶原粉。
经本实施例的方法提纯天然牛棒骨胶原粉颜色呈白色、无异味、无杂质,胶原含量达94%以上。
分别采用紫外分光光度计、傅立叶变换红外光谱仪、SDS-PAGE电泳图进行鉴别,结果见图1和2、3。
图1显示此天然牛棒骨胶原最大紫外光吸收波长在228nm处,形成一个较陡峭的峰,符合胶原蛋白特殊吸收峰波长位置,与文献报道(Nagal T,Food Chemistry,2002,76)的I型胶原特征相符。
图2中3327cm-1附近是N-H伸缩振动,1658cm-1附近是酰胺I带的C=O伸缩振动,1547cm-1附近是酰胺II带的N-H弯曲振动,1450cm-1~1230cm-1附近的吸收峰表明了胶原蛋白3股螺旋结构的完整性(Plepis A M G,International Symposium onElectrets,1999,10)。
图3是SDS-PAGE电泳图,从图中可以看出,两条分子量在130kDa处左右的链,以及一条分子量在120kDa处左右的链,从图看是胶原I型典型的电泳图,符合胶原I中3条肽链的结构类型,2条α1-肽链及1条α2-肽链(陆璐,I型胶原的提取及其组装和表征,东南大学学位论文,2006)。图中α-肽链以下没有多余的电泳带,说明所提取的胶原中没有小分子的水解胶原和多肽。
实施例2
本实施例从猪骨中提纯天然骨胶原粉,由下述步骤制得:
(1)清洗:采用鲜猪骨1000g作为原料,经水清洗,确保原料骨符合卫生要求。
(2)强力破骨:将清洗后的猪骨用破骨机进行强力破骨。为了保证鲜骨的顺利出料,在粉碎时添加400g的冰水,粗粉碎后的粒度≤1mm。
(3)细粉碎:将强力破骨后的物料用骨泥磨进行两道磨碎,第一道间隙大,第二道间隙小,在磨碎之前将冰屑与物料混合均匀,控制物料出口温度≤10℃,冰屑的添加量为鲜骨重量的30%。细粉碎后得到粒度80目的骨泥。
(4)脱脂、脱无机物:采用化学方法进行脱脂。在室温下,选择0.8%的NaOH溶液与骨泥混合均匀,使pH达到12,在90rpm/min的搅拌速度下,脱脂6小时。脱脂后,脂肪聚集成团浮在液面,蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪,用热水洗涤,去除残留的碱,直至脂肪呈中性,得到骨油和脱脂骨泥;用冷水搅拌洗涤剩下的蛋白质和无机物,由于密度不同将其进行初步分离,初步分离的蛋白质再加入4倍重量份的丙酮,浸泡12小时,倒出浸提液,这样用丙酮浸提1次,分离出来的蛋白质加入3倍重量份的3mol/l的EDTA,搅拌均匀后,置于冰箱(4℃)静置4hr,用蒸馏水反复进行洗涤4次,过滤、去除滤液。分离出来的蛋白质加入20倍重量份的0.5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl,搅拌均匀后,置于冰箱(4℃)静置4hr,用蒸馏水反复进行洗涤3次,过滤、去除滤液。
(5)酸浸泡:在1℃下,加入15倍重量份的0.1mol/l的醋酸溶液,控制pH值为1.5,静置12hr。
(6)酶水解:在1℃下,加入蛋白质量0.1%的木瓜蛋白酶(pH8),搅拌36hr。
(7)分离:加入15倍重量份的0.001mol/l的EDTA溶液,搅拌均匀,在8℃下,将混合液用转速为15000rpm的离心机,离心10分钟。
(8)纯化:取上清液进行盐析,氯化钠浓度为1.5mol/l,1℃下,静置12hr,将混合液用转速为7000rpm离心机,离心50分钟。沉淀物用200倍量的0.5mol/l的乙酸溶液,完全溶解,溶解后再加入氯化钠,浓度为1.5mol/l,如此反复进行盐析4次。再以蒸馏水为透析液,经过透析膜透析24hr,反复3次。
(9)冷冻干燥:在4℃下,将透析物用转速为10000rpm离心机,离心50分钟。不溶物置于冻干机,至其水分含量小于3%,制得天然、未变性的骨胶原粉。
经本实施例的方法提纯天然骨胶原粉颜色呈白色、无异味、无杂质,胶原含量达94%以上。
实施例3
本实施例从鸡骨中提纯天然骨胶原粉,由下述步骤制得:
(1)清洗:采用鸡骨1000g作为原料,经水清洗,确保原料骨符合卫生要求。
(2)强力破骨:将清洗后的鸡骨用破骨机进行强力破骨。为了保证鲜骨的顺利出料,在粉碎时添加350g的冰水,粗粉碎后的粒度≤1mm。
(3)细粉碎:将强力破骨后的物料用骨泥磨进行两道磨碎,第一道间隙大,第二道间隙小,在磨碎之前将冰屑与物料混合均匀,控制物料出口温度≤10℃,冰屑的添加量为鲜骨重量的35%。细粉碎后得到粒度100目的骨泥。
(4)脱脂、脱无机物:采用化学方法进行脱脂。在室温下,选择1.0%NaHCO3溶液,与骨泥混合均匀,使pH达到9,在60rpm/min的搅拌速度下,脱脂8小时。脱脂后,脂肪聚集成团浮在液面,蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪,用热水洗涤,去除残留的碱,直至脂肪呈中性,得到骨油和脱脂骨泥;用冷水搅拌洗涤剩下的蛋白质和无机物,由于密度不同将其进行初步分离,初步分离的蛋白质再加入5倍重量份的石油醚,浸泡12小时,倒出浸提液,这样用石油醚浸提3次,分离出来的蛋白质加入15倍重量份的0.01mol/l的EDTA,搅拌均匀后,置于冰箱(4℃)静置12hr,用蒸馏水反复进行洗涤6次,过滤、去除滤液。分离出来的蛋白质加入10倍重量份的1mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl,搅拌均匀后,置于冰箱(4℃)静置12hr,用蒸馏水反复进行洗涤4次,过滤、去除滤液。
(5)酸浸泡:在10℃下,加入10倍重量份的1mol/l的柠檬酸溶液,静置72hr。
(6)酶水解:在4℃下,加入蛋白质量的5%的胰蛋白酶(pH10),搅拌96hr。
(7)分离:加入10倍重量份的0.01mol/l的EDTA溶液,搅拌均匀,在0℃下,将混合液用转速为15000rpm的离心机,离心20分钟。
(8)纯化:取上清液进行盐析,氯化钠浓度为2.0mol/l,10℃下,静置48hr,将混合液用转速为10000rpm离心机,离心20分钟。沉淀物用100倍量的3mol/l的乙酸溶液,完全溶解,溶解后再加入氯化钠,浓度为2.0mol/l,如此反复进行盐析2次。再以蒸馏水为透析液,经过透析膜透析96hr。
(9)冷冻干燥:在10℃下,将透析物用转速为15000rpm离心机,离心15分钟。不溶物置于冻干机,至其水分含量小于3%,制得天然、未变性的骨胶原粉。
经本实施例的方法提纯天然骨胶原粉颜色呈白色、无异味、无杂质,胶原含量达94%以上。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1、一种天然骨胶原的制备方法,其特征在于,采用低温处理工艺,其包括如下步骤:
1)清洗:将新鲜畜禽骨进行水清洗;
2)粉碎:将清洗后的畜禽骨进行粉碎至粒度80~120目的骨泥;
3)脱脂、脱无机物:将骨泥与NaOH溶液或NaHCO3溶液进行混合,搅拌后分层,取底层,并用水进行洗涤,分离得蛋白质,再将其用石油醚或者丙酮浸提,浸提分离后的蛋白质中加入EDTA,搅拌均匀后,静置,然后用蒸馏水反复洗涤、过滤,得过滤物;再用盐酸胍-Tris-HCl混合搅拌,静置,然后用蒸馏水反复洗涤、过滤,得过滤物;
4)酸浸泡:将过滤物用酸浸泡;
5)酶水解:再加入蛋白酶进行酶解;
6)分离、纯化:然后离心分离,取上清液进行盐析,盐析的沉淀物用乙酸溶液溶解,再经盐析、膜透析处理得透析物;
7)冷冻干燥:最后将透析物离心处理,并经冷冻干燥而成。
2、如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述脱脂、脱无机物、酸浸泡、酶水解、分离纯化均在0~10℃下进行。
3、如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤2)中所述粉碎经过强力破骨、细粉碎两次粉碎处理。
4、如权利要求1-3任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中NaOH溶液的质量百分浓度为0.4~0.8%,NaHCO3溶液的质量百分浓度0.8~1.6%,pH控制为9~12,石油醚或者丙酮的浸提次数为1~3次。
5、如权利要求1-4任意一项所述的制备方法,其特征在于,所述EDTA溶液的浓度为0.01~3mol/l,用量为蛋白质重量的2~15倍;所述的盐酸胍-Tris-HCl浓度为0.5~5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl,用量为1~20倍蛋白质重量。
6、如权利要求1-5任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤4)中所述酸浸泡的pH值控制在1.5~5之间,优选采用5~15倍所述过滤物重量的0.05~3mol/l的醋酸溶液、0.01~2mol/l的柠檬酸或0.01~0.1mol/l的盐酸溶液进行浸泡,时间为12~72hr。
7、如权利要求1-6任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤5)中所述蛋白酶为pH1.5~5的胃蛋白酶、pH6~8的木瓜蛋白酶或pH8~10的胰蛋白酶,用量为蛋白质量的0.1~5%,时间为24~96hr。
8、如权利要求1-7任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤6)中在离心分离时先加入EDTA溶液,浓度为0.001~0.04mol/l,用量为分离液重量的0.1~15倍。
9、如权利要求1-8任意一项所述的制备方法,其特征在于,取上清液进行盐析时,采用氯化钠,浓度为0.5~3mol/l,静置12~48hr,所述乙酸溶液的浓度为0.1~3mol/l。
10、如权利要求1-9任意一项所述的制备方法,其特征在于,所述乙酸溶解后经1~6次盐析处理,所述膜透析处理1~3次。
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