CN102154421A - 鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法：主要步骤为：原料处理→菠萝蛋白酶水解去除非纤维蛋白→水洗→537酸性蛋白酶水解残渣胶原蛋白→常压过滤→冷冻干燥→干燥保存；其中重点在于酶解和胶原蛋白纯化。本发明提取的鱼下脚料胶原蛋白能得到纯度较高的制品，制品色泽洁白，无异味，平均提取率为38.9％，纯度为99.67％。

Description

鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法

技术领域：

本发明涉及一种胶原蛋白的提取方法，尤其是涉及一种从鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中提取胶原蛋白的方法。

背景技术：

我国水域广阔，水产资源丰富，随着水产加工业的发展，加工鱼产品的同时产生大量下脚料，其量占加工鱼总质量的50％～70％。然而，受技术和传统观念的制约，在较长的一段时间里，水产下脚料并没有被充分利用，而是当作垃圾被扔掉。据估计，我国每年鱼的废弃物总量就达到200万吨以上。目前，我国鱼下脚料主要用作：(1)加工成饲料鱼粉；(2)提取鱼胶原蛋白；(3)加工成鱼肚；(4)从鱼内脏中提取鱼油，提炼EPA、DHA制品。

胶原蛋白(Collagen)分子式为C4H6N203R2.(C7H9N202R)n：是一种细胞外蛋白质，它是由3条肽链拧成螺旋状的纤维蛋白质，由数十种氨基酸组成；是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白，是动物体内含量最多、分布最广、具有免疫学性质的蛋白质，可广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等领域。最近，国外研究表明，胶原水解所得的胶原多肽不仅具有很好的消化特性，而且还具有许多生理活性功能，已引起研究人员的广泛兴趣。长期以来，人们都是使用猪、牛的皮和骨，以及禽类组织提取胶原蛋白和明胶。其提取方法主要有碱法、酸法、酶法和热处理等方法。但因疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发，使人们对牲畜与禽类胶原制品安全性产生疑虑。另外，

由于宗教和习俗等原因，有些地区也不能使用牲畜胶原蛋白制品。因此，寻找胶原蛋白的新来源显得愈来愈迫切。水产动物尤其是其加工废弃物皮、骨、鳞中含有丰富的胶原蛋白，具有开发利用价值。一般的加工过程为去头去骨去内脏，然后分割取肉，部分鱼类由于鱼皮较为坚韧，分割后还需要除去鱼皮。鱼类分割加工后，剩余部分的废弃物有鱼头、鱼骨、鱼鳍、鱼皮、鱼鳞、内脏等。鱼类的废弃物中，鱼头、鱼骨含有丰富的钙质，而且还粘连着不少鱼肉，是较好的蛋白质资源；鱼皮、鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白；鱼内脏中存在大量的油脂，是可利用的营养物质，其中深海鱼油等还是高价值的功能食品原料。当前这些水产废弃物没有得到很好的利用，大部分直接排放到环境中去，产生环境污染问题。对此进行开发可以变废为宝，达到综合利用的目的，此开发具有重要的应用前景，也具有重要的社会与经济价值。

传统的提取方法为：将鱼类下脚料(包括鱼皮、鱼骨、鱼鳞)洗净后打碎，进行脱脂脱色，然后用盐酸(pH在4～5)浸泡进行脱钙处理，直到鳞片、鱼骨柔软透明，时间大约为2～3周；取出洗净后浸灰15～20d，主要是使得原料组织疏松。洗净后放在60～70℃夹层锅中加热2～3h熬胶2～5次，提尽为止。趁热转盘，凝固成胶冻，干燥后使含水量＜15％，即得成品。然而，传统的提取方法步骤繁多，耗时长且在提取过程中胶原蛋白流失较大，不适于大规模的生产。酸、碱法提取由于工艺生产较为复杂，且水解过程使氨基酸大多为螺旋式，还产生有毒物质，无生物利用价值，因此不宜采用。酶法提取，即利用各种不同的酶在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白，通常使用的酶有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。原料采用不同的前处理后，加入不同的酶提取得到酶促溶性胶原蛋白，其中以复合酶解的方法效果最佳。

发明内容：

本发明为了解决上述问题中鱼类下脚料浪费及传统提取方法的不足之处，提供了一种从鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中提取胶原蛋白的方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案是：一种鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法，主要步骤为：原料处理→菠萝蛋白酶水解去除非纤维蛋白→水洗→537酸性蛋白酶水解残渣胶原蛋白→常压过滤→冷冻干燥→干燥保存；其具体步骤为：

(1)原料预处理

将鱼类下脚料解冻洗净，用粉碎机粉碎成小块组织，放入2.5％NaCl溶液5℃浸泡10-20h进行脱脂后、6000r/min 5℃低温离心30min，去除废液；

(2)酶解

将预处理后的原料与去离子水按料液比1∶10混合，8000r/min进行匀浆)15min，按照15g/L加入菠萝蛋白酶，调pH至4.0～5.0，45℃酶解4h后过滤，滤液以8000r/min 5℃低温离心20min，取上清液；

去上清液后将残渣与去离子水仍按料液比1∶10混合，匀浆15min，按照10g/L加入537酸性蛋白酶，调pH至7.0～8.0，45℃-55℃酶解2h后过滤，滤液以8000r/min低温离心30min，取上清液；

将两次取得的上清液混合，在100℃高温下加热3min灭酶活，滤液以8000r/min 5℃低温离心50min，取上清液；

(3)胶原蛋白纯化

在胶原蛋白的粗提取液中按照每100ml提取液加入3-5g活性碳，后搅拌40min，活性炭吸附后的胶原蛋白初提液经过滤后用离心机以4500r/min离心2min，后倾出上清液，加NaCl至最终浓度为0.9mol/L盐析过夜后，用离心机以4500r/min离心20min收集沉淀，沉淀用0.5mol/L乙酸溶解即1g的沉淀中添加20ml乙酸，重复盐析和溶解操作1次，得到的胶原蛋白溶液移入透析袋，用蒸馏水透析3天，每天更换透析水2-3次；

(4)成品

较纯的胶原蛋白提取液冷冻干燥。

本发明可以从鱼类下脚料皮、骨、鳞充分提取合格的胶原蛋白，提取率高、污染少、方法简便实用可以进行大规模工业生产，避免了资源浪费。

本发明提取的鱼下脚料胶原蛋白能得到纯度较高的制品，制品色泽洁白，无异味，平均提取率为38.9％，纯度为99.67％。

具体实施方式：

本发明的具体工艺步骤如下：

1.复合酶提取工艺步骤：

主要步骤为：原料处理→菠萝蛋白酶水解去除非纤维蛋白→水洗→537酸性蛋白酶水解残渣胶原蛋白→常压过滤→冷冻干燥→干燥保存。

1.1原料预处理

将鱼类下脚料(包括鱼皮、鱼骨、鱼鳞)解冻洗净，用粉碎机粉碎成小块组织，进行脱脂(用2.5％NaCl溶液5℃浸泡10-20h)、离心(6000r/min 5℃低温离心30min)，去除废液，得到预处理后的下脚料，作为胶原蛋白提取的原料。

1.2酶解

影响酶解效果的因素主要有：酶的种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值及料水比。

将预处理后的原料与去离子水按料液比1∶10混合，匀浆(匀浆机8000r/min进行匀浆)15min，按照15g/L加入菠萝蛋白酶(菠萝蛋白酶为：30万酶活)，调pH至4.0～5.0，45℃酶解4h后过滤，滤液以8000r/min 5℃低温离心20min，取上清液。

去上清液后将残渣与去离子水仍按料液比1∶10混合，匀浆15min，按照10g/L加入537酸性蛋白酶，调pH至7.0～8.0，45℃-55℃酶解2h后过滤，滤液以8000r/min低温离心30min，取上清液。

将两次取得的上清液混合(两次取得的上清液混合无比例，所得上清液全部混合)，在100℃高温下加热3min灭酶活，滤液以8000r/min 5℃低温离心50min，取上清液待用。

1.3胶原蛋白纯化

由于步骤1.2中最终取得的上清液为胶原蛋白初提液，由于胶原蛋白初提液的颜色比较深，而且还有较大的腥味。在胶原蛋白的粗提取液中按照每100ml提取液加入3-5g活性碳，后搅拌(用磁力搅拌器搅拌)40min，以达到除色、除异味的目的。

活性炭吸附后的胶原蛋白初提液经过滤(用抽滤机进行抽滤)后用离心机以4500r/min离心2min，后倾出上清液，加NaCl至最终浓度为0.9mol/L(即1L的胶原蛋白提取液中添加53g的氯化钠，使其浓度达到0.9mol/L)，盐析过夜(上述添加氯化钠的步骤即为盐析)后，用离心机以4500r/min离心(离心机为：CR22G高速冷冻离心机)20min收集沉淀，沉淀用0.5mol/L乙酸溶解(沉淀物和乙酸的比例为：1∶20即1g的沉淀中添加20ml乙酸)，重复盐析和溶解操作1次，得到的胶原蛋白溶液移入透析袋(半透膜自制透析袋，半透膜市场均有售，可根据不同和需要自制大小尺寸)，用蒸馏水透析3天(将半透膜制成袋状，将胶原蛋白提取液置入袋内，将此透析袋浸入蒸馏水中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。)，每天更换透析水(蒸馏水)2-3次。以除去胶原蛋白中的无机离子，得到较纯的胶原蛋白。

1.4成品

将步骤1.3中最终得到的较纯的胶原蛋白提取液冷冻干燥，即可得到鱼类胶原蛋白。

采用酶法提取鱼类废弃物胶原蛋白的最佳处理条件为：菠萝蛋白酶质量分数(菠萝蛋白酶占鱼体下脚料的质量分数)1.5％，料液(下脚料与去离子水体积比)比1∶10，酶解时间4h，酶解温度45℃；质量分数(质量分数为：步骤1.2中537酸性蛋白酶与去上清液后将残渣与去离子水按料液比1∶10混合后的混合物的比例)1％的537酸性蛋白酶(537酸性蛋白酶：由黑曲霉经发酵提炼而成的固体酶制剂，有较强的水解能力，能将大分子的蛋白质水解成氨基酝酿等产物，)，料液比1∶10，酶解时间2h，其中用此方法进行提取，鮰鱼提取率为40.2％，纯度为99.78％；安康鱼、鮰鱼提取率为38.9％，纯度为99.63％；鳕鱼、鮰鱼提取率为37.8％，纯度为99.58％，平均提取率为38.9％，纯度为99.67％。

胶原蛋白含量的测定(以羟脯氨酸含量计)及纯度、提取率计算，按照ISO3496：1978(E)方法，测定羟脯氨酸含量。胶原蛋白含量等于羟脯氨酸含量乘以系数11.1。

胶原纯度＝11.1ml/m2×100％

其中：M1-测定的羟脯氨酸质量(g)，M2-测定羟脯氨酸时称取的胶原质量(g)。

胶原蛋白提取率＝(胶原纯度×M1/M2)×100％

其中：M1-成品胶原的质量(g)，M2-水产下脚料的质量(g)。

鱼体下脚料胶原蛋白含量高，杂蛋白含量低，故采用复合酶法提取鱼下脚料胶原蛋白能得到纯度较高的制品，制品色泽洁白，无异味。

Claims (1)

1.一种鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法，其特征在于：主要步骤为：原料处理→菠萝蛋白酶水解去除非纤维蛋白→水洗→537酸性蛋白酶水解残渣胶原蛋白→常压过滤→冷冻干燥→干燥保存；其具体步骤为：

(1)、原料预处理

将鱼类下脚料解冻洗净，用粉碎机粉碎成小块组织，放入2.5％NaCl溶液5℃浸泡10-20h进行脱脂后、6000r/min 5℃低温离心30min，去除废液；

(2)酶解

将预处理后的原料与去离子水按料液比1∶10混合，8000r/min进行匀浆)15min，按照15g/L加入菠萝蛋白酶，调pH至4.0～5.0，45℃酶解4h后过滤，滤液以8000r/min 5℃低温离心20min，取上清液；

去上清液后将残渣与去离子水仍按料液比1∶10混合，匀浆15min，按照10g/L加入537酸性蛋白酶，调pH至7.0～8.0，45℃-55℃酶解2h后过滤，滤液以8000r/min低温离心30min，取上清液；

将两次取得的上清液混合，在100℃高温下加热3min灭酶活，滤液以8000r/min 5℃低温离心50min，取上清液；

(3)胶原蛋白纯化

在胶原蛋白的粗提取液中按照每100ml提取液加入3-5g活性碳，后搅拌40min，活性炭吸附后的胶原蛋白初提液经过滤后用离心机以4500r/min离心2min，后倾出上清液，加NaCl至最终浓度为0.9mol/L盐析过夜后，用离心机以4500r/min离心20min收集沉淀，沉淀用0.5mol/L乙酸溶解即1g的沉淀中添加20ml乙酸，重复盐析和溶解操作1次，得到的胶原蛋白溶液移入透析袋，用蒸馏水透析3天，每天更换透析水2-3次；

(4)成品

较纯的胶原蛋白提取液冷冻干燥。