CN115028707A - 一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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张建阳
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Abstract

本申请涉及医学生物技术领域，具体涉及一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白及其制备方法和应用。区别于现有技术，本申请通过胃蛋白酶酶法水解胶原蛋白，可以有效的去除化学键内、键间的交联效应，能够最大限度的提取溶解胶原蛋白；通过对鱼皮胶原蛋白粗提物进行多次盐析处理和透析，可以有效纯化胶原蛋白产物，同时不损伤胶原蛋白的结构及生物活性；采用大黄鱼为原料，取材容易，安全无副作用，可以提供可替代哺乳动物来源的海产品优质胶原蛋白资源。采用本申请制备方法得到的大黄鱼鱼皮胶原蛋白纯度高、蛋白结构完整，且具有镇痛消炎、口腔创面修复作用。

Description

一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及医学生物技术领域，具体涉及一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白又称胶原，是由三条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，是一种糖蛋白，含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸及糖，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，是机体含量最多的一类蛋白质。现已发现的胶原种类为19种，其中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和Ⅲ型胶原是构成胶原纤维的主要成分，主要存在于动物的结缔组织中，起支持器官、保护机体的功能，是重要的结构蛋白质。
我国拥有极为丰富的水产资源，近几年水产品加工业尤其是淡水鱼的加工迅猛发展，但是也产生了大量加工剩余的废弃物，这些废弃物一方面造成了环境的污染，另一方面也照成了资源的浪费。随着胶原需求量的越来越大及食品安全等因素,传统的从牛、猪等哺乳类动物获取的胶原已经不能满足人们的需要,近年来,对水产动物胶原的研究越来越引起人们的关注，综合这些因素，水产动物类胶原蛋白的研究和开发将成为未来发展的必要选择。
现有技术中，胶原蛋白的提取技术，仍存在诸多不足之处，如原料使用量大而胶原提取率低，提取率高而胶原分子结构破坏严重，或者对实验设备条件(例如色谱柱体系)的要求较高，实验操作复杂，易对环境造成不同程度的污染等。因此，寻求一种简单、方便，同时不损伤胶原蛋白的结构及生物活性的提取方法具有极大的实际意义。
发明内容
鉴于上述问题，本申请提供了一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白及其制备方法和应用，所获得产物纯度高、蛋白结构完整，且具有镇痛消炎、口腔创面修复作用。
为实现上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供了一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮胶原蛋白的提取：
对大黄鱼鱼皮进行预处理后，加入含0.01～0.5重量％胃蛋白酶的0.4～0.7mol/L醋酸溶液中进行酶法提取，得到鱼皮胶原蛋白粗提物；
(2)鱼皮胶原蛋白的纯化：
在所述鱼皮胶原蛋白粗提物中加入无机盐进行盐析，至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，静置12h后，离心收集沉淀，盐析次数为2～3次；盐析结束后，将得到的盐析物溶于浓度为0.005～0.5mol/L醋酸中，以浓度为0.005～0.5mol/L的醋酸溶液进行透析，再于蒸馏水中透析，冻干，得到大黄鱼鱼皮胶原蛋白。
进一步的，在步骤(1)中，所述预处理包括：
采用新鲜大黄鱼鱼皮为原料，去除鱼鳞、残肉和脂肪，清洗沥干，绞碎；
将绞碎的鱼皮和0.01～0.1mol/L氢氧化钠溶液按照料液比1:10～1:20g/mL混合，再加入质量分数为30％的过氧化氢溶液，于15℃～25℃下浸泡18～36h；
将浸泡后的鱼皮用体积浓度为10％的正丁醇清洗数次，再依次用自来水、蒸馏水清洗鱼皮至中性，沥干，得到预处理后的鱼皮，备用。
进一步的，在步骤(1)中，所述预处理后的大黄鱼鱼皮和所述醋酸溶液的料液比为1:20～1:60g/mL。
进一步的，在步骤(1)中，所述酶法提取分两步进行，具体包括：
在预处理后的鱼皮中，按照料液比1:20～1:60g/mL，加入含0.01～0.5重量％胃蛋白酶的0.4～0.7mol/L醋酸溶液中进行酶法提取；而后，用2～3层纱布过滤得到第一残渣和第一胶状液；将所述第一胶状液于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，得到第二残渣和第一上清液；
将所述第一残渣和所述第二残渣合并，按照料液比1:20～1:60g/mL，加入含0.01～0.5重量％胃蛋白酶的0.4～0.7mol/L醋酸溶液中进行酶法提取；而后，用2～3层纱布过滤得到第二残渣和第二胶状液；将所述第二胶状液于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，得到第三残渣和第二上清液；
将所述第一上清液和所述第二上清液合并，得到所述鱼皮胶原蛋白粗提物。
进一步的，在步骤(1)中，所述酶法提取的反应温度为1℃～4℃，反应pH值控制在1～3，反应时间为24h。
进一步的，在步骤(1)中，在酶法提取结束后，将温度升至80℃～95℃，进行灭酶处理。
进一步的，在步骤(2)中，所述无机盐为硫酸铵、氯化钠或磷酸氢二钠，所述盐析的温度为1℃～4℃。
进一步的，所述无机盐为氯化钠，其盐析浓度为0.9～2.5mol/L。
进一步的，所述无机盐为磷酸氢二钠，其盐析浓度为0.01～0.1mol/L。
进一步的，在步骤(2)中，所述盐析的次数为3次，具体包括：
在所述鱼皮胶原蛋白粗提物中加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第一盐析物；
将所述第一盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第二盐析物；
将所述第二盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第三盐析物。
进一步的，在步骤(2)中，所述盐析的次数为3次，具体包括：
在所述鱼皮胶原蛋白粗提物中加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为第一浓度，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第一盐析物；
将所述第一盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为第二浓度，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第二盐析物；
将所述第二盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为第三浓度，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第三盐析物；
其中，所述第一浓度、所述第二浓度和所述第三浓度为0.01～2.5mol/L，且所述第三浓度>所述第二浓度>所述第一浓度。
进一步的，所述无机盐为氯化钠，所述第一浓度为0.9mol/L，所述第二浓度为1.8mol/L，所述第三浓度为2.5mol/L。
进一步的，所述无机盐为磷酸氢二钠，所述第一浓度为0.01mol/L，所述第二浓度为0.05mol/L，所述第三浓度为0.10mol/L。
第二方面，本发明提供了一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白，由本发明第一方面所述的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的大黄鱼鱼皮胶原蛋白在制备口腔清洁护理用品中的应用。其中，口腔清洁护理用品包括牙膏、牙粉、漱口水、牙用凝胶、口腔喷雾剂等不同剂型，这些剂型均可按照常规生产方法制备。也可使其大黄鱼鱼皮胶原蛋白与一种或多种载体或其他活性成分或药物混合，制成所需剂型。相应的载体可以根据常法进行适当地使用，具体成分和用量可以根据需要通过试验确定，在此并无特别限定。
区别于现有技术，上述技术方案通过胃蛋白酶酶法水解胶原蛋白，可以有效的去除化学键内、键间的交联效应，能够最大限度的提取溶解胶原蛋白；通过对鱼皮胶原蛋白粗提物进行多次盐析处理和透析，可以有效纯化胶原蛋白产物，同时不损伤胶原蛋白的结构及生物活性；采用大黄鱼为原料，取材容易，安全无副作用，可以提供可替代哺乳动物来源的海产品优质胶原蛋白资源。
上述发明内容相关记载仅是本申请技术方案的概述，为了让本领域普通技术人员能够更清楚地了解本申请的技术方案，进而可以依据说明书的文字及附图记载的内容予以实施，并且为了让本申请的上述目的及其它目的、特征和优点能够更易于理解，以下结合本申请的具体实施方式及附图进行说明。
附图说明
附图仅用于示出本发明具体实施方式以及其他相关内容的原理、实现方式、应用、特点以及效果等，并不能认为是对本申请的限制。
在说明书附图中：
图1为小鼠溃疡愈合时间结果图；
图2为小鼠溃疡愈合速度结果图。
具体实施方式
为详细说明本申请可能的应用场景，技术原理，可实施的具体方案，能实现目的与效果等，以下结合所列举的具体实施例并配合附图详予说明。本文所记载的实施例仅用于更加清楚地说明本申请的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本申请的保护范围。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中各个位置出现的“实施例”一词并不一定指代相同的实施例，亦不特别限定其与其它实施例之间的独立性或关联性。原则上，在本申请中，只要不存在技术矛盾或冲突，各实施例中所提到的各项技术特征均可以以任意方式进行组合，以形成相应的可实施的技术方案。
除非另有定义，本文所使用的技术术语的含义与本申请所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中对相关术语的使用只是为了描述具体的实施例，而不是旨在限制本申请。
在本申请的描述中，用语“和/或”是一种用于描述对象之间逻辑关系的表述，表示可以存在三种关系，例如A和/或B，表示：存在A，存在B，以及同时存在A和B这三种情况。另外，本文中字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的逻辑关系。
在本申请的描述中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B以及该范围内所有数值的范围。
在本申请中，诸如“第一”和“第二”之类的用语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何实际的数量、主次或顺序等关系。
在没有更多限制的情况下，在本申请中，语句中所使用的“包括”、“包含”、“具有”或者其他类似的开放式表述，意在涵盖非排他性的包含，这些表述并不排除在包括所述要素的过程、方法或者产品中还可以存在另外的要素，从而使得包括一系列要素的过程、方法或者产品中不仅可以包括那些限定的要素，而且还可以包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法或者产品所固有的要素。
与《审查指南》中的理解相同，在本申请中，“大于”、“小于”、“超过”等表述理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等表述理解为包括本数。此外，在本申请实施例的描述中“多个”的含义是两个以上(包括两个)，与之类似的与“多”相关的表述亦做此类理解，例如“多组”、“多次”等，除非另有明确具体的限定。
在本申请实施例的描述中，所使用的与空间相关的表述，诸如“中心”“纵向”“横向”“长度”“宽度”“厚度”“上”“下”“前”“后”“左”“右”“竖直”“水平”“垂直”“顶”“底”“内”“外”“顺时针”“逆时针”“轴向”“径向”“周向”等，所指示的方位或位置关系是基于具体实施例或附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请的具体实施例或便于读者理解，而不是指示或暗示所指的装置或部件必须具有特定的位置、特定的方位、或以特定的方位构造或操作，因此不能理解为对本申请实施例的限制。
除非另有明确的规定或限定，在本申请实施例的描述中，所使用的“安装”“相连”“连接”“固定”“设置”等用语应做广义理解。例如，所述“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体设置；其可以是机械连接，也可以是电连接，也可以是通信连接；其可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连；其可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本申请所属技术领域的技术人员而言，可以根据具体情况理解上述用语在本申请实施例中的具体含义。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
(1)大黄鱼鱼皮的预处理：
采用新鲜大黄鱼鱼皮为原料，去除鱼鳞、残肉和脂肪，清洗沥干，绞碎；
取10g绞碎的鱼皮，加入200mL 0.01mol/L氢氧化钠溶液，再加入质量分数为30％的过氧化氢溶液，于20℃下浸泡24h；浸泡后，可以用食物搅拌机搅拌上述溶液2min，双层纱布过滤；
将浸泡后的鱼皮用体积浓度为10％的正丁醇清洗3次，再依次用自来水、蒸馏水清洗鱼皮至中性，沥干，得到预处理后的鱼皮，备用。
(2)鱼皮胶原蛋白的提取：
对大黄鱼鱼皮进行预处理后，按照料液比1：50g/mL加入含0.5重量％胃蛋白酶的0.5mol/L醋酸溶液中进行酶法提取，反应温度为4℃，反应pH值控制在2，反应时间为24h；而后，用2层纱布过滤得到第一残渣和第一胶状液；将第一胶状液于4℃下12000rpm离心30min，得到第二残渣和第一上清液。
将第一残渣和第二残渣合并，按照料液比1：50g/mL，加入含0.5重量％胃蛋白酶的0.5mol/L醋酸溶液中进行酶法提取，反应温度为4℃，反应pH值控制在2，反应时间为24h；酶法提取结束后，将温度升至85℃进行灭酶处理；而后，用2层纱布过滤得到第二残渣和第二胶状液；将第二胶状液于4℃下12000rpm离心30min，得到第三残渣和第二上清液。
将第一上清液和第二上清液合并，得到鱼皮胶原蛋白粗提物。
(3)鱼皮胶原蛋白的纯化：
第一次盐析：在鱼皮胶原蛋白粗提物中加入5mol/L氯化钠溶液，使溶液中氯化钠最终浓度为1.8mol/L，搅拌1min后，4℃静置12h以进行盐析；接着，于4℃下12000rpm离心30min，收集沉淀得到第一盐析物；
第二次盐析：将第一盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入5mol/L氯化钠溶液，使溶液中氯化钠最终浓度为1.8mol/L，搅拌1min后，4℃静置12h以进行盐析；接着，于4℃下12000rpm离心30min，收集沉淀得到第二盐析物；
第三次盐析：将第二盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，5mol/L氯化钠溶液，使溶液中氯化钠最终浓度为1.8mol/L，搅拌1min后，4℃静置12h以进行盐析；接着，于4℃下12000rpm离心30min，收集沉淀得到第三盐析物。
盐析结束后，将得到的第三盐析物溶于浓度为0.005mol/L醋酸中，再以浓度为0.005mol/L的醋酸溶液进行透析脱盐，再于蒸馏水中透析。
将透析后的产物进行冷冻干燥，得到大黄鱼鱼皮胶原蛋白冻干粉末。
实施例2
(1)大黄鱼鱼皮的预处理：
采用新鲜大黄鱼鱼皮为原料，去除鱼鳞、残肉和脂肪，清洗沥干，绞碎；
取10g绞碎的鱼皮，加入200mL 0.01mol/L氢氧化钠溶液，再加入质量分数为30％的过氧化氢溶液，于20℃下浸泡24h；浸泡后，可以用食物搅拌机搅拌上述溶液2min，双层纱布过滤；
将浸泡后的鱼皮用体积浓度为10％的正丁醇清洗3次，再依次用自来水、蒸馏水清洗鱼皮至中性，沥干，得到预处理后的鱼皮，备用。
(2)鱼皮胶原蛋白的提取：
对大黄鱼鱼皮进行预处理后，按照料液比1：50g/mL加入含0.5重量％胃蛋白酶的0.5mol/L醋酸溶液中进行酶法提取，反应温度为4℃，反应pH值控制在2，反应时间为24h；而后，用2层纱布过滤得到第一残渣和第一胶状液；将第一胶状液于4℃下12000rpm离心30min，得到第二残渣和第一上清液。
将第一残渣和第二残渣合并，按照料液比1：50g/mL，加入含0.5重量％胃蛋白酶的0.5mol/L醋酸溶液中进行酶法提取，反应温度为4℃，反应pH值控制在2，反应时间为24h；酶法提取结束后，将温度升至85℃进行灭酶处理；而后，用2层纱布过滤得到第二残渣和第二胶状液；将第二胶状液于4℃下12000rpm离心30min，得到第三残渣和第二上清液。
将第一上清液和第二上清液合并，得到鱼皮胶原蛋白粗提物。
(3)鱼皮胶原蛋白的纯化(梯度盐析)：
第一次盐析：在鱼皮胶原蛋白粗提物中加入5mol/L氯化钠溶液，使溶液中氯化钠最终浓度为0.9mol/L，搅拌1min后，4℃静置12h以进行盐析；接着，于4℃下12000rpm离心30min，收集沉淀得到第一盐析物。
第二次盐析：将第一盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入5mol/L氯化钠溶液，使溶液中氯化钠最终浓度为1.8mol/L，搅拌1min后，4℃静置12h以进行盐析；接着，于4℃下12000rpm离心30min，收集沉淀得到第二盐析物。
第三次盐析：将第二盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，5mol/L氯化钠溶液，使溶液中氯化钠最终浓度为2.5mol/L，搅拌1min后，4℃静置12h以进行盐析；接着，于4℃下12000rpm离心30min，收集沉淀得到第三盐析物。
盐析结束后，将得到的第三盐析物溶于浓度为0.005mol/L醋酸中，再以浓度为0.005mol/L的醋酸溶液进行透析脱盐，再于蒸馏水中透析。
将透析后的产物进行冷冻干燥，得到大黄鱼鱼皮胶原蛋白冻干粉末。
实施例3
本实施例的操作方法和步骤与实施例1基本相同，唯一不同之处在于：将氯化钠溶液替换为磷酸氢二钠溶液进行3次盐析；其中，第一次盐析至第三次盐析中，溶液中磷酸氢二钠最终浓度为0.05mol/L。但是，在酶法提取后不进行灭酶处理，利用磷酸氢二钠的弱碱性即可使胃蛋白酶失去活性，防止水解过度。
实施例4
本实施例的操作方法和步骤与实施例2基本相同，唯一不同之处在于，将氯化钠溶液替换为磷酸氢二钠溶液进行梯度盐析；其中，第一次盐析中，溶液中磷酸氢二钠最终浓度为0.01mol/L；第二次盐析中，溶液中磷酸氢二钠最终浓度为0.05mol/L；第三次盐析中，溶液中磷酸氢二钠最终浓度为0.10mol/L。但是，在酶法提取后不进行灭酶处理，利用磷酸氢二钠的弱碱性即可使胃蛋白酶失去活性，防止水解过度。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于，在步骤(3)中只进行了1次盐析，即直接将第一盐析物进行透析脱盐。
对比例2
本对比例与实施例3的不同之处在于，在步骤(3)中只进行了1次盐析，即直接将第一盐析物进行透析脱盐。
测试例1胶原蛋白提取得率测试
实施例1～4和对比例1～2的胶原蛋白提取得率的计算结果如表1所示。
表1胶原蛋白提取得率的测试结果表
Figure BDA0003730848440000111
由表1数据可知，实施例1～4的胶原蛋白得率可达51.8％～53.37％，相比于对比例1～2仅略微下降，可见在盐析脱盐纯化过程中，胶原蛋白损失较少。
测试例2胶原蛋白纯度测试
取20mg实施例1～4和对比例1～2的胶原蛋白，分别溶于100mL浓度为0.5mol/mL的醋酸中，分别配制成2.0×10-4g/mL的样品溶液，测定其羟脯氨酸含量和总蛋白质含量，并计算各个样品的纯度和杂蛋白百分含量，结果如表2所示。
表2胶原蛋白纯度测试结果表
Figure BDA0003730848440000112
Figure BDA0003730848440000121
由表2的计算结果可知，对比例1样品的蛋白质含量为94.1％(w/w)，胶原蛋白纯度为89.00％，杂蛋白含量占11.00％；在经过进一步盐溶和盐析后，获得的实施例1样品的蛋白质含量虽有所损失，为81.15％(w/w)，但是胶原蛋白纯度提高到94.58％，杂蛋白含量降低到5.42％，可见多次的盐溶和盐析可以有效得提高产品的胶原蛋白纯度，并降低杂蛋白的含量。实施例3和对比例2采用磷酸氢二钠进行盐溶和盐析，其提取效果和纯化效果与实施例1的氯化钠效果相当。实施例2和4通过设置梯度浓度进行盐析，胶原蛋白纯度提高到96％以上，可见梯度盐析法可以进一步提高胶原蛋白纯度。
测试例3胶原蛋白氨基酸组成成分分析
采用岛津L-8800型氨基酸自动分析仪测定实施例1～4和对比例1～2样品中氨基酸组成成分，并与文献所报告的鲶鱼鱼皮及牛皮所获得的胶原蛋白的氨基酸组成成分及含量进行对比，结果如表3所示。
表3大黄鱼鱼皮胶原蛋白的氨基酸组成(残基/1000残基)
Figure BDA0003730848440000122
Figure BDA0003730848440000131
1:Liu H,Li D,Guo S.Studies on collagen from the skin ofchannelcatfish(Ictaluruspunctaus)[J].Food Chem,2007,101(2):621-625
2:Ahmad M,Benjakul S,Nalinanon S.Compositional and physicochemicalcharacteristics of acid solubilized collagen extracted from the skin ofunicorn leatherjacket(Aluterus monoceros)[J].Food Hydrocolloids,2010,24(6-7):588-594.
脯氨酸的含量直接影响胶原蛋白的含量，而羟脯氨酸是维持胶原蛋白结构的重要亚氨酸。由表3的结果可知，大黄鱼鱼皮胶原的氨基酸组成中，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸含量较高，而芳香族氨基酸与含硫类氨基酸含量较低，这是海产品中胶原类蛋白的特征。与对比例1和2相比，实施例1～4的羟脯氨酸含量仅略微下降，但是胶原蛋白纯度显著提高，可见采用本申请方法可以有效提升胶原蛋白的纯度，同时不损伤胶原蛋白的结构及生物活性。与实施例1和2相比，实施例3和4中，羟脯氨酸含量较高，可见采用磷酸氢二钠进行盐溶和盐析，可以更大程度地保留胶原蛋白的完整结构及生物活性。与哺乳类动物皮胶原相比，大黄鱼及鲶鱼鱼皮胶原的脯氨酸及羟脯氨酸量较低，而这两种亚氨酸与蛋白质分子的交联程度存在近似的正相关，故大黄鱼鱼皮胶原的变性温度及胶凝强度可能比哺乳类动物胶原稍有逊色，但与同类的海洋生物鲶鱼相仿。另外，易受碱处理破坏的精氨酸含量在1～4和对比例1～2样品中无明显变化，由于本申请的提取纯化过程采用盐溶和盐析等步骤，未采用碱处理，因而精氨酸没有受到破坏。
应用例大黄鱼鱼皮胶原蛋白在制备口腔清洁护理用品中的应用及效果验证
口腔溃疡属于一种口腔粘膜上的表浅性溃疡。从外形大小来看，口腔溃疡多为米粒或者黄豆大小，呈现为卵圆形。溃疡面会下凹，且周围会出现充血症状。常见的疾病症状有口腔疼痛、口干舌燥等，由于疼痛不适，患者往往饮食会遇到困难。
1、实验动物：
选取健康、体型大小等生理状况相似的活泼小鼠24只，体重30～35g，周龄4～5，雌雄各半，在相同环境下进行人工饲养。将所有小鼠分为3组，分别是空白对照组、阳性药物对照组、实验组，随机平均8只小鼠为一组，每一组小鼠雌雄比1：1。
空白组处理溃疡所用试剂：0.9％生理盐水；
阳性药物组处理溃疡所用试剂：西瓜霜喷剂；
实验组处理溃疡所用试剂：实施例1制备的大黄鱼鱼皮胶原蛋白冻干粉末。
2、口腔溃疡造模：
使用化学灼烧法造模。把三组小鼠用0.1％戊巴比妥钠注射麻醉，剪圆纸片若干张，将其置于冰醋酸溶液中充分浸泡，将圆纸片放置于小鼠舌尖，用镊子按压纸片，确保与舌尖紧密贴合，动作持续1min。三组小鼠24h内禁食禁水，并处于相对疲劳状态，可见纸片放置处有白色伪膜存在，揭开存在溃疡，周围粘膜红肿，即造模成功。
3、口腔溃疡治疗实验
每天定时对空白组、阳性药物组、实验组分别用棉签蘸取生理盐水、西瓜霜喷剂、大黄鱼鱼皮胶原蛋白粉剂，以溃疡面积为准均匀涂抹于溃疡处。每天用药前记录溃疡面积大小，粘膜情况及损伤程度，精神状态、活动度。因口腔溃疡有一定自愈性，故将观察时间限定为2周内，若愈合时间超过观察限期，则记为无效数据。每组小鼠的数据结果取8只小鼠数据的平均值。
4、实验结果
三组小鼠溃疡愈合时间和愈合速度如图1和图2所示。由图1和图2的结果可知，空白对照组的口腔溃疡愈合所用时间最长，且个别小鼠有感染症状；实验组所用愈合时间虽然要长于阳性组，但两者的差异并不明显。由此可以证明，大黄鱼鱼皮胶原蛋白治疗口腔溃疡类口腔创面的愈合速度快，具有镇痛消炎、口腔创面修复、减少口腔疾病等作用，可用于制备牙膏、牙粉、漱口水、牙用凝胶、口腔喷雾剂等口腔清洁护理用品。
最后需要说明的是，尽管本文已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围，其中未尽详细描述的技术参数在本发明列举的参数范围内变化时，仍能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍属与本发明的保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其它相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鱼皮胶原蛋白的提取：
对大黄鱼鱼皮进行预处理后，加入含0.01～0.5重量％胃蛋白酶的0.4～0.7mol/L醋酸溶液中进行酶法提取，得到鱼皮胶原蛋白粗提物；
(2)鱼皮胶原蛋白的纯化：
在所述鱼皮胶原蛋白粗提物中加入无机盐进行盐析，至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，静置12h后，离心收集沉淀，盐析次数为2～3次；盐析结束后，将得到的盐析物溶于浓度为0.005～0.5mol/L醋酸中，以浓度为0.005～0.5mol/L的醋酸溶液进行透析，再于蒸馏水中透析，冻干，得到大黄鱼鱼皮胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述预处理包括：
采用新鲜大黄鱼鱼皮为原料，去除鱼鳞、残肉和脂肪，清洗沥干，绞碎；
将绞碎的鱼皮和0.01～0.1mol/L氢氧化钠溶液按照料液比1:10～1:20g/mL混合，再加入质量分数为30％的过氧化氢溶液，于15℃～25℃下浸泡18～36h；
将浸泡后的鱼皮用体积浓度为10％的正丁醇清洗数次，再依次用自来水、蒸馏水清洗鱼皮至中性，沥干，得到预处理后的鱼皮，备用。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述预处理后的大黄鱼鱼皮和所述醋酸溶液的料液比为1:20～1:60g/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述酶法提取分两步进行，具体包括：
在预处理后的鱼皮中，按照料液比1:20～1:60g/mL，加入含0.01～0.5重量％胃蛋白酶的0.4～0.7mol/L醋酸溶液中进行酶法提取；而后，用2～3层纱布过滤得到第一残渣和第一胶状液；将所述第一胶状液于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，得到第二残渣和第一上清液；
将所述第一残渣和所述第二残渣合并，按照料液比1:20～1:60g/mL，加入含0.01～0.5重量％胃蛋白酶的0.4～0.7mol/L醋酸溶液中进行酶法提取；而后，用2～3层纱布过滤得到第二残渣和第二胶状液；将所述第二胶状液于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，得到第三残渣和第二上清液；
将所述第一上清液和所述第二上清液合并，得到所述鱼皮胶原蛋白粗提物。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述酶法提取的反应温度为1℃～4℃，反应pH值控制在1～3，反应时间为24h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述盐析的次数为3次，具体包括：
在所述鱼皮胶原蛋白粗提物中加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第一盐析物；
将所述第一盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第二盐析物；
将所述第二盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为0.01～2.5mol/L，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第三盐析物。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述盐析的次数为3次，具体包括：
在所述鱼皮胶原蛋白粗提物中加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为第一浓度，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第一盐析物；
将所述第一盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为第二浓度，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第二盐析物；
将所述第二盐析物溶于0.05mol/L Tris-HCl溶液中，加入无机盐至溶液中无机盐最终浓度为第三浓度，搅拌后静置12h以进行盐析，于4℃下9000～15000rpm离心20～30min，收集沉淀得到第三盐析物；
其中，所述第一浓度、所述第二浓度和所述第三浓度为0.01～2.5mol/L，且所述第三浓度>所述第二浓度>所述第一浓度。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述无机盐为硫酸铵、氯化钠或磷酸氢二钠，所述盐析的温度为1℃～4℃。
9.一种大黄鱼鱼皮胶原蛋白，其特征在于，所述大黄鱼鱼皮胶原蛋白由权利要求1至8中任意一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述大黄鱼鱼皮胶原蛋白在制备口腔清洁护理用品中的应用。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001200000A (ja) * 2000-01-24 2001-07-24 Air Water Inc 海洋生物由来コラーゲンの製造方法
CN102154421A (zh) * 2010-12-15 2011-08-17 南通市优普保鲜技术有限公司 鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法
CN102276716A (zh) * 2011-08-08 2011-12-14 四川大学 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法
CN102676620A (zh) * 2011-12-20 2012-09-19 浙江省海洋开发研究院 一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法
CN105131109A (zh) * 2015-09-30 2015-12-09 陕西艾尔肤组织工程有限公司 一种胶原蛋白的提取方法
CN108642115A (zh) * 2018-06-28 2018-10-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法
CN112760351A (zh) * 2021-03-17 2021-05-07 华中农业大学 一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用
CN113372436A (zh) * 2021-07-08 2021-09-10 中国海洋大学 一种鱼皮源外层致密内层疏松的医用胶原膜及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001200000A (ja) * 2000-01-24 2001-07-24 Air Water Inc 海洋生物由来コラーゲンの製造方法
CN102154421A (zh) * 2010-12-15 2011-08-17 南通市优普保鲜技术有限公司 鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法
CN102276716A (zh) * 2011-08-08 2011-12-14 四川大学 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法
CN102676620A (zh) * 2011-12-20 2012-09-19 浙江省海洋开发研究院 一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法
CN105131109A (zh) * 2015-09-30 2015-12-09 陕西艾尔肤组织工程有限公司 一种胶原蛋白的提取方法
CN108642115A (zh) * 2018-06-28 2018-10-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法
CN112760351A (zh) * 2021-03-17 2021-05-07 华中农业大学 一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用
CN113372436A (zh) * 2021-07-08 2021-09-10 中国海洋大学 一种鱼皮源外层致密内层疏松的医用胶原膜及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
廖伟: "尖吻鲈鱼鳞和鱼皮胶原蛋白的提取及其理化特性分析", 食品科学, vol. 39, no. 1, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 37 - 41 *

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