CN107630061A - 牦牛骨ⅰ型胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，将牦牛骨通过预处理、酸溶酶提、离心分离、冻干等工艺制备得到纯度较高的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白产品。由于本发明中通过实验对脱钙脱脂条件、提取酶浓度进行了优选，并采用UV、FT‑IR、SEM等手段对牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白进行了结构验证，明确了所制备牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白特征结构完整，纯度高，能够极大提升可食性骨的综合利用价值。

Description

牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于骨加工技术领域，尤其涉及到一种牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法。

背景技术

我国的可食性骨资源丰富，目前我国畜禽骨年产量高达1200多万吨，占世界产量的 1/3，折合约200万吨动物蛋白，可满足7500万人的年蛋白需求。我国马上步入老龄化社会，骨质疏松症成为老年人面对最大的慢性威胁病症。在人口压力与养殖环境承载力有限的条件下，加强对骨资源的综合开发利用，具有重要的经济、社会与环境效益。

牦牛(Bos grunniens)是世界上的珍稀牛种，我国是世界上拥有牦牛最多的国家，约1400 万头，数量占肉牛总存栏数16.67％。2015年牦牛屠宰量约300万头，产生牦牛骨约10万吨。而且由于牦牛是季节性屠宰，短时间会产生大量的牛骨，大部分以初级产品的形式出售或直接废弃，对高原环境造成巨大压力。牦牛骨中含有丰富的营养元素，对人体健康有着很好的营养增强和治疗效果。加深对牦牛骨的研究，对于提高牧民收入、保护高原地区环境，有重要意义。

目前利用牦牛骨所开发的产品只是局限于以传统中药、藏药理论为基础进行简单加工的粗放产品，例如牦牛骨粉、牦牛骨髓酱、牦牛骨雕等，深层次的利用和高附加值加工很少。牛骨中含有几乎人体所需的全部矿物质成分,包括人体必须的微量元素，而且其中所含蛋白、油脂、多糖等营养成分丰富。因此，全方位的针对牛骨中所含矿物质、蛋白质、脂肪等营养组分进行分析评价，对于综合利用牛骨资源，开发出新的高附加值产品，具有重要意义。2015年牦牛屠宰量约300万头，牦牛胴体重平均为123.0kg/头，胴体产量约为40万吨，牛肉产量接近30万吨，牛骨约10万吨。近年来，对于牦牛的肉、乳、皮、骨的综合利用也有了不少研究。牦牛骨中含有丰富的矿物质元素，对儿童和青少年骨骼的生长发育中老年骨质疏松症预防有着重要的营养学和治疗意义，开发前景广阔。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明提供一种牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一：将冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后通过硬质骨破碎机破碎制得牦牛骨破碎料；

步骤二：将所述牦牛骨破碎料进行清洗去杂；

步骤三：将经过清洗去杂的所述牦牛骨破碎料采用乙醚脱脂处理后，再使用EDTA或 HCl的方法进行脱钙处理得到脱脂脱钙牦牛骨；

步骤四：将脱脂脱钙牦牛骨使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶进行酶解处理；

步骤五：将酶解后所得上清液加入NaCl溶液进行盐析；

步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物；

步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品。

优选的是，所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，所述步骤一中，

所述冷冻牦牛骨原料的冷冻温度为-18℃；

所述牦牛骨破碎料的粒径为10-20mm。

优选的是，所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，所述步骤三中，

所述乙醚脱脂处理为采用乙醚低温回流4～5h进行脱脂；

所述脱钙处理为采用0.25～0.50mol/L EDTA或浓度为0.5～1.0mol/L的HCl。

优选的是，所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，所述步骤四中，

所述乙酸溶液与所述脱脂脱钙牦牛骨的重量份比例为1：8-10；

所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.3-0.5mol/L；

所述胃蛋白酶与所述乙酸溶液的重量份比例为1-1.8：100；

所述酶解处理为进行震摇浸提，时间为24h-120h。

优选的是，所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，所述步骤五中，所述NaCl溶液的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L。

优选的是，所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，所述步骤六中，离心温度为4℃，离心转速为10000rmp，离心时间为30min。

优选的是，所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，所述步骤七中，冻干温度为-40℃ --47℃，冻干时间为12h-24h，真空度为-0.08Mpa--0.09Mpa。

通过以上步骤将牦牛骨通过预处理、酸溶酶提、离心分离、冻干等工艺制备得到纯度较高的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白产品。由于本专利中通过实验对脱钙脱脂条件、提取酶浓度进行了优选，并采用UV、FT-IR、SEM等手段对牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白进行了结构验证，明确了所制备牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白特征结构完整，纯度高，能够极大提升可食性骨的综合利用价值。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明采用酸溶酶提的方法，得到在所制备的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白中Gly比例最高。

牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的紫外吸收峰234nm与黄牛骨胶原蛋白一致，符合牛骨胶原蛋白的吸收特征。

所制备牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白都具备较好的二级结构，在酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带区的a-螺旋比例高，所提取的胶原蛋白结构完整性更好。通过SEM和SDS-PAGE检测，牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白与其他研究者提取的牛骨胶原蛋白所呈现的特征一致。

牦牛骨所制备的胶原蛋白符合Ⅰ型牛骨胶原蛋白的结构特征，只是在某些氨基酸含量和DSC结果当中有所不同，但是差异性不显著。

本发明的制备方法简单、生产效率高、经济效益突出，所生产牦牛骨胶原可用于生物制品、组织工程、功能性食品等方面。

由于对胶原蛋白提取工艺优化，并对其结构进行了结构验证。

本发明工艺操作简便，为规模化生产提供可靠指导。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的流程图；

图2为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中的不同脱脂方法效果对比图；

图3为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中的不同盐浓度对胶原蛋白得率的影响对比图；

图4为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中的不同胃蛋白酶浓度对胶原蛋白得率的影响对比图；

图5为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的紫外光谱图；

图6为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的傅里叶红外光谱图；

图7为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的热流分析图；

图8为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的电泳结果图；

图9为本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法的一个实施例中牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的微观结构图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本发明提供的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法包括：

步骤一：冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后，通过硬质骨破碎机破碎；

步骤二：预处理的目的主要是清洗并去除粉碎后产生的血液、碎渣、附着物作用；

步骤三：将粉碎后的碎骨先经过乙醚脱脂后，再使用EDTA或HCl对碎骨进行脱钙处理；

步骤四：将脱脂脱钙后产物使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶酶解；

步骤五：将酶解后所得上清液加入一定浓度NaCl溶液进行盐析；

步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物；

步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品。

上述步骤一中所述的预破碎处理包含：所使用原料为-18℃的冷冻状态，牦牛骨需要通过硬质骨破碎机破碎将经过粉碎，粉碎粒度控制在10～20mm；

上述步骤二所述的预处理步骤包含：冲洗、清理去杂、去除附着物；

上述步骤三所述的脱脂、脱钙步骤包含：在清洗后的碎骨采用乙醚低温回流4～5h进行脱脂；采用0.25～0.50mol/L EDTA或浓度为0.5～1.0mol/L的HCl进行脱钙处理；

上述步骤四所述的溶解、提取步骤包含：经过脱脂脱钙后碎骨，加入0.3～0.5mol/L的乙酸溶液，再加入1～1.8％的胃蛋白酶进行酶解提取，料液比1:8～10震摇浸提24h～5d；

上述步骤五所述的盐析步骤包含：向上清液中加入0.5～1.0mol/L的NaCl溶液进行盐析；

上述步骤六所述的离心步骤包含：在4℃时，离心转速为10000rmp离心30min离心后获得沉淀；

上述步骤七所述的冻干步骤包含：在真空度-0.08～-0.09MPa条件下，-40～-47℃时冻干 12～24h得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白。

实施例一

1、选取-18℃冷冻骨原料10公斤，首先用清水将其杂质冲洗干净后，通过硬质骨破碎机破碎将经过粉碎，粉碎粒度控制在10mm；

2、将粉碎后的骨使用清水冲洗、清理去杂、去除附着物；

3、在清洗后的碎骨采用乙醚低温回流4h进行脱脂；采用0.25mol/L EDTA或浓度为0.5mol/L的HCl进行脱钙处理；

4、经过脱脂脱钙后碎骨，加入0.5mol/L的乙酸溶液，再加入1％的胃蛋白酶进行酶解提取，料液比1:8震摇浸提24h；

5、上述步骤五所述的盐析步骤包含：向上清液中加入0.5mol/L的NaCl溶液进行盐析；

6、上述步骤六所述的离心步骤包含：在4℃时，离心转速为10000rmp离心30min 离心后获得沉淀；

7、上述步骤七所述的冻干步骤包含：在真空度-0.08MPa条件下，-40℃时冻干12h得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白。

实施例二

1、使用原料为-18℃的冷冻状态，牦牛骨需要通过硬质骨破碎机破碎将经过粉碎，粉碎粒度控制在20mm；

2、将粉碎后的骨使用清水冲洗、清理去杂、去除附着物；

3、在清洗后的碎骨采用乙醚低温回流5h进行脱脂；采用0.50mol/L EDTA或浓度为1.0mol/L的HCl进行脱钙处理；

4、经过脱脂脱钙后碎骨，加入0.5mol/L的乙酸溶液，再加入1.8％的胃蛋白酶进行酶解提取，料液比1:10震摇浸提5d；

5、向上清液中加入1.0mol/L的NaCl溶液进行盐析；

6、在4℃时，离心转速为10000rmp离心30min离心后获得沉淀；

7、在真空度-0.09MPa条件下，-47℃时冻干24h得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白。

检测试验验证：

1、脱脂条件选择

由图2可知，在不同处理条件下，乙醚低温回流表现出最佳的脱脂效果，与其他研究者实验验结果类似，选择此条件作为牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白提取的脱脂剂。

2、脱钙条件选择

表1-1不同脱钙剂对胶原蛋白得率的影响

经过脱脂后的骨料所含无机物高达68％以上，需要脱除后才能获得较纯的胶原蛋白，由于无机矿物的主要成分是磷酸钙与碳酸钙，生产中常常采用盐酸或磷酸作为脱钙剂。由表1-1可知，在同等浓度条件下EDTA的脱钙效果均优于HCl，由于HCl与骨钙反应速度受HCl浓度影响较大，而EDTA作为二价金属螯合剂能够与骨钙形成稳定的螯合物。0.50 mol/LEDTA作为脱钙剂时，胶原蛋白的得率最高，0.25mol/L EDTA的得率略低于0.50 mol/L EDTA组，本试验选择0.25mol/L EDTA或者选择1.0mol/L的HCl作为牛骨胶原蛋白提取的脱钙剂。

3、盐析浓度选择

采用2.6mol/L的NaCl浓度，通过冷冻干燥获得牛骨Ⅰ型胶原蛋白。由图3可知，随着NaCl浓度的增大，胶原蛋白得率呈现先增大后降低，在NaCl浓度>0.9mol/L后又出现增大趋势；当NaCl浓度为0.9mol/L时，胶原蛋白得率显著高于其他各组(P<0.05)。因此本试验选择0.9mol/L NaCl作为牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白提取的盐析浓度。

4、酶添加量的优化

采用酶法提取胶原蛋白时，须严格控制提取条件，如酶的种类、酶解时间及温度等。一般提取动物蛋白时，胃蛋白酶较为常用，其条件温和，易于控制。有学者对4种常用蛋白酶对牛骨蛋白的酶解动力学研究结果也表明胃蛋白酶与胰蛋白酶对牛骨蛋白的亲和力较大，碱性蛋白酶与胃蛋白酶的Vmax较大。因此，本发明亦选用胃蛋白酶辅助提取牛骨胶原蛋白。由图4可知，当胃蛋白酶添加量为1.6％时，胶原蛋白的率显著高于其他各组 (p<0.05)。因此本试验选择胃蛋白酶添加量为1.6％。

5、氨基酸组成与含量

由表1-2可知，牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白具有典型的Ⅰ型胶原蛋白的组成特点。其中，TAA分别为652.4mg/g，EAA所占的比例为20.1％；Gly含量最多，占TAA的25.9％，其次为 Pro、Glu、Ala、Arg、Asp；胶原蛋白特征性氨基酸(Gly、Lys、Pro)总量达到273mg/g；不含有Trp，Cys、Met和Tyr是牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白中含量最低的3种氨基酸。

表1-2牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白氨基酸含量(mg/g)

Table 6-3 Amino acid concentration of collagen from Gannan yak bone(mg/g)

6、UV光谱分析结果

由于牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白中不含有Trp，Tyr含量也较低，所以胶原蛋白溶液在240nm 以下具有较强吸收峰而在240nm以上基本没有吸收峰。

如图5所示，牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白在234nm处达到最大吸收，与相关文献所报道的胶原蛋白在230nm左右处具有最大吸收值相吻合。但是与研究当中的牛骨Ⅰ型胶原蛋白在228nm处的最大吸收峰还是略有差距，原因是由于提取方式的不同造成氨基酸组成和结构造成。

7、FT-IR分析结果

大量研究报道利用FT-IR分析蛋白质二级结构，在IR谱带中(酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带)，蛋白均会产生特征吸收，酰胺Ⅰ带(1700～1600cm^-1)由于其成熟的谱峰指认技术成为最有力的研究蛋白结构的谱带区域。

由图6可知，牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白在3400cm^-1附近为酰胺A带，为蛋白质的特征吸收峰；酰胺Ⅰ带均出现在1651.01cm^-1处，是由胶原蛋白多肽骨架中的C-O伸缩振动引起，与胶原蛋白的二级结构有关；1450～1600cm^-1是酰胺Ⅱ带的特征吸收频率，牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白仅在1579.65cm^-1出现最大吸收峰；胶原蛋白中的Gly、Pro、Hyp含量相对较高，因此牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白在1200～1400cm^-1处具有其他蛋白质所没有的吸收峰，由C-N伸缩振动和N-H弯曲振动引起，是归属于Gly骨架和Pro侧链的的CH₂摇摆振动峰的体现；胶原蛋白红外光谱特征综合表明牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白中保留了大量三螺旋结构。

8、DSC分析

牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的Td分别是40.12℃和40.94℃(图7)，相较于猪皮胶原高4℃左右，而与其他学者提取牛骨胶原蛋白数据相差3℃，与牛皮的胶原蛋白数据相近。这可能与胶原蛋白中亚氨基的含量相关，胶原蛋白的Td与其羟脯氨酸和脯氨酸的含量相关，二者含量越高，胶原蛋白的稳定性越高。

9、SDS-PAGE结果

对牦牛骨中提取的胶原蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

如图8所示。牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白在高于250kDa处是Ⅰ型胶原蛋白α链的三聚体，即γ链，约200kDa处有一条β条带；在约110kDa处有α₁、α₂两条电泳条带；牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白(YBC)的α链条带相对浅细且没有70kDa以下的小分子蛋白条带，表明牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的蛋白结构相对更完整，没有小分水解胶原及多肽。因此，推断所提取的胶原蛋白基本保持了完整的三股螺旋结构。

10、微观结构

利用扫描电镜对牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白微观结构观察如图9所示。胶原蛋白的俯视图与剖面图均呈现出相对统一规则、光滑的多孔网状结构，其孔径的大小与在制备过程中的含水量有关；含有纤维状细丝，在放大1000倍后，细丝状结构明显，这是胶原蛋白分子发生聚集所形成的胶原纤维，其形成与胶原蛋白分子的三螺旋结构有关。牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白结构分布均匀，说明在提取过程中基本保持了胶原蛋白原有的纤维结。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后通过硬质骨破碎机破碎制得牦牛骨破碎料；

步骤二：将所述牦牛骨破碎料进行清洗去杂；

步骤三：将经过清洗去杂的所述牦牛骨破碎料采用乙醚脱脂处理后，再使用EDTA或HCl的方法进行脱钙处理得到脱脂脱钙牦牛骨；

步骤四：将脱脂脱钙牦牛骨使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶进行酶解处理；

步骤五：将酶解后所得上清液加入NaCl溶液进行盐析；

步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物；

步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品。

2.如权利要求1所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，

所述冷冻牦牛骨原料的冷冻温度为-18℃；

所述牦牛骨破碎料的粒径为10-20mm。

3.如权利要求1所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，

所述乙醚脱脂处理为采用乙醚低温回流4～5h进行脱脂；

所述脱钙处理为采用0.25～0.50mol/L EDTA或浓度为0.5～1.0mol/L的HCl。

4.如权利要求1所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，

所述乙酸溶液与所述脱脂脱钙牦牛骨的重量份比例为1：8-10；

所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.3-0.5mol/L；

所述胃蛋白酶与所述乙酸溶液的重量份比例为1-1.8：100；

所述酶解处理为进行震摇浸提，时间为24h-120h。

5.如权利要求1所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤五中，所述NaCl溶液的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L。

6.如权利要求1所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤六中，离心温度为4℃，离心转速为10000rmp，离心时间为30min。

7.如权利要求1所述的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤七中，冻干温度为-40℃--47℃，冻干时间为12h-24h，真空度为-0.08Mpa--0.09Mpa。