CN105112481A - 从鱿鱼软骨中提取非变性ii型胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，包括：冷冻干燥鱿鱼软骨；粉碎冷冻干燥后的所述鱿鱼软骨，过筛网，得软骨粉；所述软骨粉先后用HCl溶液、EDTA溶液和NaOH溶液混悬，得到沉淀物；所述沉淀物加入乙酸溶液和蛋白酶中，搅拌，离心，取上清液；在该上清液中加饱和NaCl溶液至NaCl浓度为1～1.5M，静置16～24h，离心，去上清液，得到第一沉淀物；用酸溶解所述第一沉淀物，然后进行透析，之后冷冻干燥，即得非变性II型胶原蛋白。该提取得到的II型胶原蛋白的纯度≥95％。
Description
技术领域
本发明涉及II型胶原蛋白的提取技术领域，特别是指一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法。
背景技术
II型胶原蛋白(collagentypeII，CII)是构成软骨的主要成分之一，其具有的三条α1链以三股螺旋的形式结合，通过共价键交联，形成特殊的三维立体网状结构，对保持软骨结构的完整性有着重要作用。II型胶原蛋白是一种与多糖紧密结合的蛋白，能促进钙、磷等无机矿物质在骨骼上的沉积，修复组织，与蛋白多糖在组织中相互作用，使软骨及韧带组织富有弹性。
II型胶原是类风湿性关节炎(RA)的一种自身抗原、抗胶原抗体和胶原特异T细胞，在关节炎的发生和发展中起重要作用。RA是一种常见的关节慢性炎症疾病，我国RA的患病率为0.24-0.5％，女性多于男性。RA的发生很可能是由于机体内的T细胞因子引起关节组织内部对特异性隐蔽抗原进行的自身免疫反应，造成软骨组织破坏，产生关节滑膜炎症。有研究认为，主要的免疫原就是Ⅱ型胶原，Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎的关键是T细胞对Ⅱ型胶原分子中特定肽段的识别作用。已有报道非变性Ⅱ型胶原蛋白可以产生免疫耐受使类风湿性关节炎的发病受到抑制，并且通过口服方法改善症状。
关节软骨的功能主要是支持和分散力量，保持关节表面润滑，利于关节运动。因其独特的结构和功能性，关节软骨易受到磨损而产生关节缺损病症。关节软骨细胞增值能力极低，缺损软骨自身无法修复，组织工程技术已渐成为新的软骨缺损修复手段。非变性II型胶原具有促进软骨细胞分化的作用，并可为软骨细胞的黏附提供基础。以高纯度的非变性II型胶原蛋白与透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖等交联制备的软骨组织工程支架材料，具有低抗原性和良好的生物相容性，在软骨缺损修复中极具开发应用价值。
鱿鱼是一种海洋软体动物，身体分为头部、很短的颈部和躯干部。鱿鱼软骨位于鱿鱼颈部，约占鱿鱼体重的2％左右，鱿鱼软骨中含有丰富的II型胶原蛋白。我国鱿鱼捕获量巨大，每年可达50-60万吨，大量的鱿鱼软骨多以副产物处理，其高值化应用未得到重视。鱿鱼软骨中含有63.8％(干基)粗蛋白、14.2％(干基)灰分和14.6％(干基)多糖。由于软骨中含有的多糖即硫酸软骨素是一种可以有效改善关节疼痛的保健食品，因此在提取多糖时而未能很好利用II型胶原蛋白。
发明内容
本发明提出一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，包括：
冷冻干燥鱿鱼软骨；
粉碎冷冻干燥后的所述鱿鱼软骨，过筛网，得软骨粉；
所述软骨粉先后用HCl溶液、EDTA溶液和NaOH溶液混悬，得到沉淀物；
所述沉淀物加入乙酸溶液和蛋白酶中，搅拌，离心，取上清液；在该上清液中加饱和NaCl溶液至NaCl浓度为1～1.5M，静置16～24h，离心，去上清液，得到第一沉淀物；
用酸溶解所述第一沉淀物，然后进行透析，之后冷冻干燥，即得非变性II型胶原蛋白。
作为优选的技术方案，所述筛网的目数为≥100目。筛网目数小时软骨粉颗粒较粗，软骨粉与混悬液接触不够充分，会造成软骨前处理中脱灰、除多糖不完全，在胶原提取时II型胶原难以溶出。
作为优选的技术方案，所述混悬的具体过程为：
HCl溶液混悬，4～6℃缓慢搅拌12～24h，离心，去上清液，得到第二沉淀，用4～6℃去离子水清洗所述第二沉淀；
所述第二沉淀再用EDTA溶液混悬，4～6℃缓慢搅拌12～24h，离心，去上清液，得到第三沉淀，用4～6℃去离子水清洗所述第三沉淀；
所述第三沉淀用NaOH溶液混悬，4～6℃缓慢搅拌24～48h，离心，去上清液，得到第四沉淀，用4～6℃去离子水清洗所述第四沉淀。
作为优选的技术方案，所述HCl溶液的pH为2.0～3.0；EDTA溶液的pH为8.0，浓度为0.5～1M；所述NaOH溶液浓度为0.1M～0.5M。
作为优选的技术方案，所述软骨粉与HCl溶液料液比(w/v)为1：30～50；软骨粉与EDTA溶液料液比(w/v)为1：30～50；软骨粉与NaOH溶液料液比(w/v)为1：30～50。
作为优选的技术方案，所述软骨粉与乙酸溶液料液比(w/v)为1：50～80。
作为优选的技术方案，所述乙酸溶液的浓度为0.5～1M。
作为优选的技术方案，所述蛋白酶为胃蛋白酶。
作为优选的技术方案，所述胃蛋白酶与沉淀物的比(w/w)为0.2～0.5％。高于该料液比时，提取时间会比较长，同时蛋白分子量会变小。
作为优选的技术方案，所述沉淀物加入乙酸溶液和蛋白酶中，搅拌，离心，可以进行1-3次，合并上清液，进行下一步反应。
作为优选的技术方案，溶解所述第一沉淀物的酸为乙酸，其浓度为0.2-0.5M。
作为优选的技术方案，所述非变性II型胶原蛋白的分子量300～330kDa，具有完整的三维螺旋结构。
有益效果
(1)本发明选用鱿鱼软骨作为原料，其中的冷冻干燥可以防止胶原蛋白变性，方便后续工艺的操作，提高提取效率。同时软骨前处理、胶原提取和纯化等过程均在低温条件下进行，避免了因温度过高而造成II型胶原蛋白的变性。
(2)鱿鱼软骨中灰分和多糖含量较高，且与胶原结合在一起；本发明在鱿鱼软骨前处理过程中，采用HCl溶液和EDTA溶液对软骨粉进行脱灰处理，脱灰效果完全，利于后续操作，提高了提取纯度；用NaOH溶液去除软骨中的硫酸软骨素；这些前处理操作，有利于II型胶原分离。
(3)本发明的提取得到的II型胶原蛋白的纯度≥95％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制备的非变性II型胶原蛋白SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，包括：
(1)取新鲜鱿鱼剥离出软骨，去除其上附着的筋肉，-40℃真空冷冻干燥；
(2)将冻干的鱿鱼软骨粉碎成100目粒径软骨粉；
(3)称取100g鱿鱼软骨粉，用3000mLpH2.0HCl溶液混悬，4℃缓慢搅拌24h，4℃、10000r/min离心30分钟，去上清液；
(4)沉淀用4℃去离子水充分清洗，4℃、10000r/min离心，保留沉淀；
(5)沉淀用3000mL0.5MEDTA溶液(pH8.0)混悬，4℃缓慢搅拌24h，4℃、10000r/min离心30分钟，去上清液；
(6)沉淀用4℃去离子水充分清洗，4℃、10000r/min离心，保留沉淀；
(7)沉淀用5000mL0.1MNaOH溶液混悬，4℃缓慢搅拌48h，4℃、10000r/min离心30分钟，去上清液；
(8)沉淀用4℃去离子水充分清洗，4℃、10000r/min离心，保留沉淀；
(9)将沉淀置于5000mL0.5M乙酸溶液，加入0.2g胃蛋白酶，4℃缓慢搅拌72h，4℃、10000r/min离心30分钟，取上清液，保留沉淀；
(10)沉淀再重复(9)的过程1次，合并2次上清液，加饱和NaCl溶液至NaCl浓度为1.5M，4℃静置24h，4℃、10000r/min离心30分钟，去除上清液，保留沉淀；
(11)将沉淀用0.2M乙酸溶液完全溶解，装入截留分子量100000道尔顿的透析袋中，用超纯水充分透析；
(12)将透析好的液体真空冷冻干燥，得到的非变性II型胶原蛋白，呈疏松纤维状，白色有光泽，不溶于水，可溶于稀醋酸溶液。
本实施例中得到的非变性II型胶原蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量300～330kDa，具有完整的三维螺旋结构，其胶原纯度≥95％。
实施例2
一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，包括：
(1)取新鲜鱿鱼剥离出软骨，去除其上附着的筋肉，-20℃真空冷冻干燥；
(2)将冻干的鱿鱼软骨粉碎成200目粒径软骨粉；
(3)称取100g鱿鱼软骨粉，用5000mLpH3.0HCl溶液混悬，4℃缓慢搅拌24h，4℃、10000r/min离心30分钟，去上清液；
(4)沉淀用4℃去离子水充分清洗，4℃、10000r/min离心，保留沉淀；
(5)沉淀用5000mL1.0MEDTA溶液(pH8.0)混悬，4℃缓慢搅拌24h，4℃、10000r/min离心30分钟，去上清液；
(6)沉淀用4℃去离子水充分清洗，4℃、10000r/min离心，保留沉淀；
(7)沉淀用3000mL0.5MNaOH溶液混悬，4℃缓慢搅拌48h，4℃、10000r/min离心30分钟，去上清液；
(8)沉淀用4℃去离子水充分清洗，4℃、10000r/min离心，保留沉淀；
(9)将沉淀置于8000mL1.0M乙酸溶液，加入0.5g胃蛋白酶，4℃缓慢搅拌72h，4℃、10000r/min离心30分钟，取上清液，保留沉淀；
(10)沉淀再重复(9)的过程1次，合并2次上清液，加饱和NaCl溶液至NaCl浓度为1.5M，4℃静置16h，4℃、10000r/min离心30分钟，去除上清液，保留沉淀；
(11)将沉淀用0.5M乙酸溶液完全溶解，装入截留分子量100000道尔顿的透析袋中，用超纯水充分透析；
(12)将透析好的液体真空冷冻干燥，得到的非变性II型胶原蛋白，呈疏松纤维状，白色有光泽，不溶于水，可溶于稀醋酸溶液。
本实施例中得到的非变性II型胶原蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量300～330kDa，具有完整的三维螺旋结构，其胶原纯度≥95％。
参见图1所示：1-条带1、2-条带2、3-条带3。样品条带分子量分别为条带1：300kDa，条带2：190kDa，条带3：112kDa。
条带1为未解螺旋的II型胶原，即(α1)3，含量为8.30％；条带2为两条α1链组成的β二聚体，含量为13.88％；条带3为单条II型胶原α1链，含量为74.72％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括：
冷冻干燥鱿鱼软骨；
粉碎冷冻干燥后的所述鱿鱼软骨，过筛网，得软骨粉；
所述软骨粉先后用HCl溶液、EDTA溶液和NaOH溶液混悬，得到沉淀物；
所述沉淀物加入乙酸溶液和蛋白酶中，搅拌，离心，取上清液；在该上清液中加饱和NaCl溶液至NaCl浓度为1～1.5M，静置16～24h，离心，去上清液，得到第一沉淀物；
用酸溶解所述第一沉淀物，然后进行透析，之后冷冻干燥，即得非变性II型胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述筛网的目数为≥100目。
3.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述混悬的具体过程为：
HCl溶液混悬，4～6℃缓慢搅拌12～24h，离心，去上清液，得到第二沉淀，用4～6℃去离子水清洗所述第二沉淀；
所述第二沉淀再用EDTA溶液混悬，4～6℃缓慢搅拌12～24h，离心，去上清液，得到第三沉淀，用4～6℃去离子水清洗所述第三沉淀；
所述第三沉淀用NaOH溶液混悬，4～6℃缓慢搅拌24～48h，离心，去上清液，得到第四沉淀，用4～6℃去离子水清洗所述第四沉淀。
4.根据权利要求3所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述HCl溶液的pH为2.0～3.0；EDTA溶液的pH为8.0，浓度为0.5～1M；所述NaOH溶液浓度为0.1M～0.5M。
5.根据权利要求3所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述软骨粉与HCl溶液料液比w/v为1：30～50；软骨粉与EDTA溶液料液比w/v为1：30～50；软骨粉与NaOH溶液料液比w/v为1：30～50。
6.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述软骨粉与乙酸溶液料液比w/v为1：50～80。
7.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述乙酸溶液的浓度为0.5～1M。
8.根据权利要求1所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白酶为胃蛋白酶。
9.根据权利要求8所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述胃蛋白酶与沉淀物的比w/w为0.2～0.5％。
10.根据权利要求8所述的一种从鱿鱼软骨中提取非变性II型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述非变性II型胶原蛋白的分子量300～330kDa，具有完整的三维螺旋结构。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151202 |