CN109354600B - 一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法 - Google Patents

一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽，该多功能肽包含：氨基酸序列为SEQ ID NO.1的天然多肽，以及结合在多肽上、为进行修饰而导入的取代基，该取代基为牛磺酸；该多肽制备方法包括制备保护性肽片段、微波缩合反应、脱氨基保护反应，其中制备保护性肽片段步骤为：将天然多肽溶于碳酸钠溶液中，加入含氨基端保护基团和促进剂的丙酮溶液，搅拌反应，萃取并析出沉淀即得；上述促进剂包括邻氨基苯磺酸和异烟酰胺。本发明提供的新型多肽活性高，稳定性好，无螺旋结构，流动性好和溶胀率高，具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等生物活性；制备中反应转化率和产率高，合成耗时短，副产物产量低，产物易纯化，生产成本低。

Description

一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法。
背景技术
鳕鱼，又名鳘鱼，是主要食用鱼类之一。鳕鱼原产于从北欧至加拿大及美国东部的北大西洋寒冷水域。目前鳕鱼主要出产国是加拿大、冰岛、挪威及俄罗斯，日本产地主要在北海道。我国产于黄海和东海北部。主要渔场在黄海北部、山东高角东南偏东和海洋岛南部及东南海区。鳕鱼是全世界年捕捞量最大的鱼类之一，具有重要的经济价值。鳕鱼是生产鱼糜制品的重要经济鱼类，其产业发展面临很多全球性问题。在加工鱼类食品中，会产生大量下脚料，鱼皮、鱼头和鳕鱼骨通常只有少部分被加工成饲料，大部分直接丢弃，在浪费资源的同时造成环境污染。
胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼等，起着支撑器官、保护机体的功能，是决定结缔组织韧性的主要因素。由于其天然的低毒性、低免疫原性、生物降解性、营养性、保湿性而广泛地应用于食品、化妆品、生物医学材料等领域。来源于水产动物的胶原蛋白在许多方面明显优于牛、猪皮胶原蛋白，如低过敏性、低抗原性、低热变性、分子结构较脆弱导致酶解较容易等。而胶原水解物除具有良好的生物活性外，还具有多种功能特性，如高吸水性、保水性、溶解性，低吸油性、起泡性和泡沫稳定性等，这些性能在不同行业中具有广阔的应用前景。Jae在2004年从阿拉斯加鳕鱼的骨架蛋白中分离得为自来分子量为672u，序列为Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr的多肽，具有较好的抗氧化性和很高的自由基清除能力。
牛磺酸，即2–氨基乙磺酸最早于1827年从雄牛的胆汁中分离得到，它与天然氨基酸不同。天然氨基酸是α位氨基，而牛磺酸为β位氨基，牛磺酸带有磺基而非羧基，所以牛磺酸是生物体内一种特殊的氨基酸。在动物包括人体内，牛磺酸对于心血管、脑神经、肌肉运动、免疫和视觉等系统都起着良好的调节作用，尤其是对婴儿的大脑和视神经发育有促进作用。牛磺酸则是调节机体正常生理活动的活性物质，具有广泛的生理功能，如促进婴幼儿脑组织和智力发育、增强细胞抗氧化能力，在临床上已被广泛应用于心血管疾病、糖尿病、消化道疾病、神经系统疾病、眼部疾病等一系列疾病的治疗。牛磺酸的分布十分广泛，海洋生物，特别是海鱼、贝类，如墨鱼、章鱼、虾、牡蛎、海螺、蛤蜊等牛磺酸含量最为丰富。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性高，稳定性好，无螺旋结构，流动性好和溶胀率高，兼具抗氧化、清除自由基、促进大脑发育的生物活性功能的牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽。
本发明的目的还在于提供一种反应转化率和产率高，合成耗时短，副产物产量低，产物易纯化，生产成本低的牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽，该多功能肽包含：
a，天然多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；
b，结合在a限定的多肽上的、为进行修饰而导入的取代基；上述取代基为牛磺酸。牛磺酸是一种多功能活性物质，利用牛磺酸对单一抗氧化活性的阿拉斯加鳕鱼多肽进行修饰，可获得同时具备牛磺酸生物活性和阿拉斯加鳕鱼多肽抗氧化活性的新型多功能肽，具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等多种生物活性功能。
作为优选，天然多肽为阿拉斯加鳕鱼水解蛋白产物。该天然多肽是从阿拉斯加鳕鱼的骨架蛋白中分离所得，其分子量为672u，序列为Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr，具有较好的抗氧化性和很高的自由基清除能力。
本发明还公开了一种上述牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，包括制备保护性肽片段、微波缩合反应、脱氨基保护反应，其中制备保护性肽片段的步骤如下：将天然多肽溶于碳酸钠溶液中，然后加入含有氨基端保护基团和促进剂的丙酮溶液，搅拌反应，然后用乙醚萃取，用浓盐酸调节pH至析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥后，再用石油醚析出沉淀，即得；上述促进剂包括邻氨基苯磺酸和异烟酰胺。多肽的合成离不开氨基酸保护基团，氨基酸保护基在反应中对需要保护的基团有选择性的保护，且保护后的氨基酸有较好的稳定性，同时能在接肽反应后高收率地选择性脱去，且不影响生成的肽键。
作为优选，氨基端保护基团为芴甲基羰基，其在丙酮溶液中的重量占比为25～35％；上述促进剂中的邻氨基苯磺酸和异烟酰胺在丙酮溶液中的重量占比分别为0.05～0.1％和0.1～0.15％。芴甲基羰基为碱敏感保护基，可与大范围的溶剂、试剂相兼容，机械稳定性高，可用多种载体和多种活化方式。在反应体系中加入促进剂，体系中的电荷数发生改变，促进剂与多肽中氨基酸侧链上活性官能团的电荷相互中和，使得多肽之间由侧链形成联结，而将氨基端和羧基端暴露出来，从而增加了氨基端保护基团与氨基端接触的机会，加快反应进程，同时由于侧链间相互联结，一方面使得肽链结构中的自由聚集体空间减少，对侧链上的官能团起到了钝化作用，降低了缩合反应中副反应发生的几率，有效减少了副产物的形成，提高反应转化效率，另一方面侧链联结使得侧链分子间氢键无法形成，抑制了分子聚集生成螺旋结构，改变了肽链的空间结构，进而使得产物流动性和溶胀率增强，有助于机体吸收。
作为优选，搅拌反应为分段反应，其中先于-4～0℃下反应25～35min后，再于20～30℃下反应1.5～2.5h。
进一步优选，制备保护性肽片段的具体步骤如下：取天然多肽溶解于10～15倍量、浓度为10～15％的碳酸钠溶液中，然后加入多肽10～12倍量、含有芴甲基羰基酰氯和促进剂的丙酮溶液，于-4～0℃冰浴中搅拌25～35min，然后于20～30℃下搅拌反应1.5～2.5h，再用乙醚萃取2～3次后，用浓盐酸调节pH至2～3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取2～3次，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀即得。
作为优选，微波缩合反应步骤如下：取保护性肽片段和缩合剂，加入二甲基甲酰胺溶解后，再加入牛磺酸，置于微波中反应，反应完成后，抽滤除去滤液，用二氯甲烷清洗1～2次，即得多肽粗品。在缩合反应中，牛磺酸中含有的能提供孤对电子的氨基，与多肽中C端的羧基或羧基残基结合，从而形成一种牛磺酸修饰的新型多功能肽。微波技术通过加热方式，促成化学物质的有机合成反应，并且在加热作用下，降低合成反应中的物质活化能，加快反应速度，合成反应所需的时间较短，且反应转化率也相对较高。
进一步优选，保护性肽片段和缩合剂的重量比为1:0.8～1.2；牛磺酸添加量为保护性肽片段重量的1～1.5倍；微波反应温度为20～70，℃时间为10～15min。
进一步优选，缩合剂选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑、N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和二异丙基乙基胺中的至少一种。
作为优选，脱氨基保护反应步骤如下：向多肽粗品中加入4～5倍量、含20～30％哌啶的二氯甲烷溶液，然后置于30～60℃的微波中反应5～15min，反应完成后，向反应液中加入冰乙醚进行沉淀，然后离心除去上清液，即得新型多功能肽。芴甲氧羰基对酸稳定，较易通过简单的胺脱保护，被保护的胺以游离碱释出。
本发明的有益效果为：
1)本发明中利用牛磺酸修饰阿拉斯加鳕鱼多肽，形成新型多功能肽，该活性生物肽具备牛磺酸生物活性和阿拉斯加鳕鱼多肽抗氧化活性，具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等多种生物活性功能；
2)本发明中利用微波协助缩合反应，将牛磺酸中含有的能提供孤对电子的氨基，与多肽中C端的羧基或羧基残基结合，反应转化率和产率高，副产物产量低，且产物中无螺旋结构，其流动性和溶胀率增加，生物活性得到提高，利于机体吸收；
3)本发明中新型多功能肽的制备方法，其反应效率高，合成耗时短，产物易纯化，降低了生产成本，预处理过的生物原料活性不受破坏，且产物活性能得到提升。
本发明采用了上述技术方案提供一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为新型多功能肽的X-射线衍射图；
图2为新型多功能肽对DPPH自由基清除能力的测定结果；
图3为新型多功能肽对金属离子螯合能力的测试结果；
图4为新型多功能肽对脂质氧化抑制力的测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
天然多肽的氨基酸序列SEQ ID NO.1为：
Leu Pro His Ser Gly Tyr
实施例1：
一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽，该多功能肽包含：
a，天然多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；
b，结合在a限定的多肽上的、为进行修饰而导入的取代基；上述取代基为牛磺酸。牛磺酸是一种多功能活性物质，利用牛磺酸对单一抗氧化活性的阿拉斯加鳕鱼多肽进行修饰，可获得同时具备牛磺酸生物活性和阿拉斯加鳕鱼多肽抗氧化活性的新型多功能肽，具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等多种生物活性功能。
天然多肽为阿拉斯加鳕鱼水解蛋白产物。该天然多肽是从阿拉斯加鳕鱼的骨架蛋白中分离所得，其分子量为672u，序列为Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr，具有较好的抗氧化性和很高的自由基清除能力。
一种上述牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，包括制备保护性肽片段、微波缩合反应、脱氨基保护反应，其中制备保护性肽片段的步骤如下：将天然多肽溶于碳酸钠溶液中，然后加入含有氨基端保护基团和促进剂的丙酮溶液，搅拌反应，然后用乙醚萃取，用浓盐酸调节pH至析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥后，再用石油醚析出沉淀，即得；上述促进剂包括邻氨基苯磺酸和异烟酰胺。多肽的合成离不开氨基酸保护基团，氨基酸保护基在反应中对需要保护的基团有选择性的保护，且保护后的氨基酸有较好的稳定性，同时能在接肽反应后高收率地选择性脱去，且不影响生成的肽键。
氨基端保护基团为芴甲基羰基，其在丙酮溶液中的重量占比为25％；上述促进剂中的邻氨基苯磺酸和异烟酰胺在丙酮溶液中的重量占比分别为0.05％和0.11％。芴甲基羰基为碱敏感保护基，可与大范围的溶剂、试剂相兼容，机械稳定性高，可用多种载体和多种活化方式。在反应体系中加入促进剂，体系中的电荷数发生改变，促进剂与多肽中氨基酸侧链上活性官能团的电荷相互中和，使得多肽之间由侧链形成联结，而将氨基端和羧基端暴露出来，从而增加了氨基端保护基团与氨基端接触的机会，加快反应进程，同时由于侧链间相互联结，一方面使得肽链结构中的自由聚集体空间减少，对侧链上的官能团起到了钝化作用，降低了缩合反应中副反应发生的几率，有效减少了副产物的形成，提高反应转化效率，另一方面侧链联结使得侧链分子间氢键无法形成，抑制了分子聚集生成螺旋结构，改变了肽链的空间结构，进而使得产物流动性和溶胀率增强，有助于机体吸收。
搅拌反应为分段反应，其中先于-4℃下反应35min后，再于30℃下反应1.5h。
上述制备保护性肽片段的具体步骤如下：取天然多肽溶解于10倍量、浓度为10％的碳酸钠溶液中，然后加入多肽10倍量、含有芴甲基羰基酰氯和促进剂的丙酮溶液，于-4℃冰浴中搅拌35min，然后于30℃下搅拌反应1.5h，再用乙醚萃取2次后，用浓盐酸调节pH至2，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀即得。
微波缩合反应步骤如下：取保护性肽片段和缩合剂，加入二甲基甲酰胺溶解后，再加入牛磺酸，置于微波中反应，反应完成后，抽滤除去滤液，用二氯甲烷清洗1次，即得多肽粗品。在缩合反应中，牛磺酸中含有的能提供孤对电子的氨基，与多肽中C端的羧基或羧基残基结合，从而形成一种牛磺酸修饰的新型多功能肽。微波技术通过加热方式，促成化学物质的有机合成反应，并且在加热作用下，降低合成反应中的物质活化能，加快反应速度，合成反应所需的时间较短，且反应转化率也相对较高。
保护性肽片段和缩合剂的重量比为1:0.8；牛磺酸添加量为保护性肽片段重量的1.1倍；微波反应温度为30，℃时间为15min。
缩合剂选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑、N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和二异丙基乙基胺中的至少一种。本实施例中选用1-羟基苯并三氮唑。
脱氨基保护反应步骤如下：向多肽粗品中加入4倍量、含20％哌啶的二氯甲烷溶液，然后置于30℃的微波中反应15min，反应完成后，向反应液中加入冰乙醚进行沉淀，然后离心除去上清液，即得新型多功能肽。芴甲氧羰基对酸稳定，较易通过简单的胺脱保护，被保护的胺以游离碱释出。
实施例2：
一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，具体制备步骤如下：
1)取天然多肽溶解于15倍量、浓度为15％的碳酸钠溶液中，然后加入多肽12倍量、含有芴甲基羰基酰氯和促进剂的丙酮溶液，于-2℃冰浴中搅拌25min，然后于20℃下搅拌反应2h，再用乙醚萃取3次后，用浓盐酸调节pH至3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀即得保护性肽片段，上述芴甲基羰基酰氯在丙酮溶液中的重量占比为33％，促进剂中的邻氨基苯磺酸和异烟酰胺在丙酮溶液中的重量占比分别为0.1％和0.15％；
2)按重量比为1:1.2取保护性肽片段和1-羟基苯并三氮唑，加入二甲基甲酰胺溶解后，再加入保护性肽片段重量1.5倍的牛磺酸，置于65℃微波中反应10min，反应完成后，抽滤除去滤液，用二氯甲烷清洗2次，即得多肽粗品；
3)向多肽粗品中加入5倍量、含30％哌啶的二氯甲烷溶液，然后置于60℃的微波中反应5min，反应完成后，向反应液中加入冰乙醚进行沉淀，然后离心除去上清液，即得新型多功能肽。
实施例3：
一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，具体制备步骤如下：
1)取天然多肽溶解于13倍量、浓度为12％的碳酸钠溶液中，然后加入多肽11倍量、含有芴甲基羰基酰氯和促进剂的丙酮溶液，于0℃冰浴中搅拌30min，然后于25℃下搅拌反应2.25h，再用乙醚萃取2次后，用浓盐酸调节pH至3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀即得保护性肽片段，上述芴甲基羰基酰氯在丙酮溶液中的重量占比为28％，促进剂中的邻氨基苯磺酸和异烟酰胺在丙酮溶液中的重量占比分别为0.085％和0.13％；
2)按重量比为1:1.1取保护性肽片段和1-羟基苯并三氮唑，加入二甲基甲酰胺溶解后，再加入保护性肽片段重量1.25倍的牛磺酸，置于55℃微波中反应15min，反应完成后，抽滤除去滤液，用二氯甲烷清洗2次，即得多肽粗品；
3)向多肽粗品中加入4倍量、含25％哌啶的二氯甲烷溶液，然后置于45℃的微波中反应10min，反应完成后，向反应液中加入冰乙醚进行沉淀，然后离心除去上清液，即得新型多功能肽。
实施例4：
一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，其中保护性肽片段的制备如下：取天然多肽溶解于13倍量、浓度为12％的碳酸钠溶液中，然后加入多肽11倍量、含有芴甲基羰基酰氯的丙酮溶液，于0℃冰浴中搅拌30min，然后于25℃下搅拌反应2.25h，再用乙醚萃取2次后，用浓盐酸调节pH至3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀即得保护性肽片段，上述芴甲基羰基酰氯在丙酮溶液中的重量占比为28％，上述反应过程中未添加包括邻氨基苯磺酸和异烟酰胺的促进剂。
本实施例是在实施例3的基础上进行对比试验，其他步骤与实施例3一致，制得新型多功能肽。
实施例5：
牛磺酸修饰的新型多功能肽活性检测
分别取实施例3和实施例4中所制多功能肽设为试验组1和试验组2，取氨基酸序列为SEQ ID NO.1的天然多肽设为对比例1。
1)X-射线衍射测定
采用X-Ray射线对试验组1和对比例1的多肽样品的螺旋结构的进行分析。
将干燥的多肽样品置于铜Ka上，在40kV和35mA下进行测试。扫描区间从5°到50°(2θ)，速率为0.05°(2θ)。
测定结果见附图1。
由测定结果可知，对比例1中的从鳕鱼中提取的天然多肽具有两个衍射峰值，而试验组1中的多肽的两个峰变得宽而平坦，表明加入的促进剂阻碍了分子中螺旋结构的生成，从而影响了新型多功能肽流动性和溶胀率的改善。
2)清除DPPH自由基能力测定
分别取上述三种样品加1.5mL水溶解，配制成浓度为500μg/mL的溶液，然后添加1.5mL含0.1mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合、振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测吸光值，用维生素C作阳性对照组。吸光值越小，表明自由基清除能力越强。
清除率(％)＝[1－(Ai－Aj)/Ac]×100
式中，Ac为1.5mL蒸馏水加1.5mL含0.1mmol/L DPPH的95％乙醇后吸光值，Ai为1.5mL样品液加1.5mL含0.1mmol/L DPPH的95％乙醇后吸光值，Aj为1.5mL样品液加1.5mL95％乙醇后吸光值。
测定结果见附图2。
由测定结果可知，在60h的试验期内，维生素C的自由基清除能力最强，达到92％，对比例1中的天然多肽清除自由基能力最差，仅为60％，试验组1和2的多肽经牛磺酸修饰后，其对自由基的清除能力有所增加，分别为84％和78％，而试验组1较试验组2效果更好，是由于试验组1在制备保护性肽片段的过程中添加的含有邻氨基苯磺酸和异烟酰胺的促进剂对产物的增益作用。
3)金属离子螯合能力测定
取现配的一定体积的1mmol/L FeCl2溶液，分别加至250μL1mg/mL上述三种样品溶液中，加水至总体积达500μL，混合均匀，使体系最终FeCl2为50μmol/L。反应2min后，加入1mL500μmol/L亚铁嗪，室温放置10min，于562n处比色测定，即可得A样品。总浓度为10μmol/L的EDTA作阳性对照组。
螯合率(％)＝[1－(A样品－A样品对照)/A空白]×100
其中，A空白：未加样品液的亚铁嗪溶液的吸光值，A样品对照：样品液未加亚铁嗪溶液的吸光值。
测定结果见附图3。
由测定结果可知，在试验期内，EDTA螯合金属离子能力最强，达到95％，对比例1中的多肽螯合金属离子能力最差，仅为58％，试验组1和2的多肽经牛磺酸修饰后，其对金属离子的螯合能力有所增加，分别为82％和73％，而试验组1较试验组2效果更好，是由于试验组1在制备保护性肽片段的过程中添加的含有邻氨基苯磺酸和异烟酰胺的促进剂对产物的增益作用。
4)脂质氧化抑制力测定
取三种样品分别溶解于1.5mL0.1mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，并与1.0mL50mmol/L亚油酸的99.5％乙醇溶液混合均匀，密封，铝箔包裹，置于60℃烘箱恒温贮藏。定期取样，用硫氰酸铵法检测其氧化程度。
具体测定方法为：取50μL反应液，分别加入2350μL质量分数为75％的乙醇、50μL质量分数为30％的硫氰酸铵、50μLFeCl2(浓度为20μmol/L，溶于3.5％HCl溶液)。室温反应30min，500nm比色。以α-生育酚作阳性对照组。
测定结果见附图4。
由测定结果可知，在140h的试验期内，尤其是对照组的吸光值急剧增加，说明亚油酸的自动氧化作用明显，α-生育酚的抑制作用明显减弱，而对比例1中、试验组1和2的吸光值仍维持在较低的水平，过氧化作用仍然受到明显的抑制。
经上述三项试验，说明经牛磺酸修饰过的新型多功能肽的抗氧化能力有大幅度的提升，该活性生物肽同时具备牛磺酸生物活性和阿拉斯加鳕鱼多肽抗氧化活性，具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等多种生物活性功能，有极大潜力和多种用途。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<120> 一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 阿拉斯加鳕鱼( Theragra chalcogramma)
<400> 1
Leu Pro His Ser Gly Thr
1 5

Claims (6)

1.一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，包括制备保护性肽片段，微波缩合反应，脱氨基保护反应；
所述制备保护性肽片段的步骤如下：将天然多肽溶于碳酸钠溶液中，然后加入含有氨基端保护基团和促进剂的丙酮溶液，搅拌反应，然后用乙醚萃取，用浓盐酸调节pH至析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥后，再用石油醚析出沉淀，即得；所述天然多肽的氨基酸序列为Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr，分子量为672u；所述氨基端保护基团为芴甲基羰基，其在丙酮溶液中的重量占比为25~35%；所述促进剂包括邻氨基苯磺酸和异烟酰胺，所述促进剂中的邻氨基苯磺酸和异烟酰胺在丙酮溶液中的重量占比分别为0.05~0.1%和0.1~0.15%；
所述微波缩合反应步骤如下：取保护性肽片段和缩合剂，加入二甲基甲酰胺溶解后，再加入牛磺酸，置于微波中反应，反应完成后，抽滤除去滤液，用二氯甲烷清洗1~2次，即得多肽粗品。
2.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，其特征在于：所述天然多肽为阿拉斯加鳕鱼水解蛋白产物。
3.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，其特征在于：所述搅拌反应为分段反应，其中先于-4~0℃下反应25~35min后，再于20~30℃下反应1.5~2.5h。
4.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，其特征在于：所述保护性肽片段和缩合剂的重量比为1:0.8~1.2；所述牛磺酸添加量为保护性肽片段重量的1~1.5倍；所述微波反应温度为20~70℃，时间为10~15min。
5.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，其特征在于：所述缩合剂选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑、N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和二异丙基乙基胺中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法，其特征在于：所述脱氨基保护反应步骤如下：向多肽粗品中加入4~5倍量、含20~30%哌啶的二氯甲烷溶液，然后置于30~60℃的微波中反应5~15min，反应完成后，向反应液中加入冰乙醚进行沉淀，然后离心除去上清液，即得新型多功能肽。
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