CN110483633A - 一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法 - Google Patents

一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，以东海乌参胶原蛋白为原料，通过酶解、浓缩，得到高浓度胶原蛋白水解产物，加入一定量的磺基丙氨酸，在适宜条件下进行类蛋白反应获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。本发明新型多功能肽的制备方法，其反应效率高，合成耗时短，产物易纯化，降低了生产成本，预处理过的生物原料活性不受破坏，且产物活性能得到提升。

Description

一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗氧化肽技术领域，具体涉及一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
非蛋白氨基酸具有与常见的二十种天然氨基酸不同的结构特征，如非α位氨基取代、氮甲基化、烷基取代、含卤素、羟基或磺基等取代基等等。这些结构上的差异导致了部分非蛋白氨基酸具有独特的生理活性。运用非蛋白氨基酸进行生物活性肽的结构修饰是一种非常有潜力和前景的修饰方法，已经发展出了许多有效的肽激动剂和拮抗剂。用L-噻唑烷-4-羧酸(Thp)和环己基丙氨酸(Cha)对多肽Ac-Asp-Glu-Glu-Thr-Gly-Glu-Phe-OH进行非蛋白氨基酸修饰，新的多肽Ac-Asp-Thp-Glu-Thr-Gly-Glu-Cha-OH抗氧化活性显著增强。非蛋白氨基酸也是进行构效关系研究的有效手段。含有非蛋白氨基酸的肽类似物与母体肽在高级结构、生理活性等方面的比较，使人们对受体-配体相互作用、分子识别、信息传递等方面的认识逐步深入。可以说运用非蛋白氨基酸对生物活性多肽进行化学修饰，研究其构效关系，进一步发展高效的肽类似物，已经成为多肽化学研究的重要手段和方向之一。然而，目前抗氧化肽的非蛋白氨基酸修饰相关的研究较少，不利于新型抗氧化肽的开发利用。
发明内容
本发明提供一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法，其目的在于，提供一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，利用磺基丙氨酸修饰东海乌参胶原蛋白水解产物，形成胶原蛋白抗氧化肽，该活性生物肽具备磺基丙氨酸生物活性和东海乌参胶原蛋白的抗氧化活性，具有抗氧化、清除自由基、降血糖、抗肿瘤等多种生物活性功能。
本发明提供一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，包括：
A.天然多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；
B.结合在A限定的多肽上的、为进行修饰而导入的取代基；所述取代基为非蛋白氨基酸。
作为本发明进一步的改进，所述天然多肽为东海乌参胶原蛋白水解蛋白产物。
作为本发明进一步的改进，所述非蛋白氨基酸为磺基丙氨酸。
本发明进一步保护一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，以东海乌参胶原蛋白为原料，通过酶解、浓缩，得到高浓度胶原蛋白水解产物，加入一定量的磺基丙氨酸，在适宜条件下进行类蛋白反应获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
作为本发明进一步的改进，所述东海乌参胶原蛋白的制备方法如下：选用东海乌参作为原料，切碎，经过酸、碱和柠檬酸的浸泡，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白。
作为本发明进一步的改进，所述东海乌参胶原蛋白的酶解方法如下：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至3-5，加入胃蛋白酶，适宜温度下酶解1-5h，灭活，离心，收集上清液。
作为本发明进一步的改进，所述浓缩的方法包括：冷冻干燥、喷雾干燥和减压水分蒸发，得到的高浓度胶原蛋白水解产物密度为2-3.5g/cm3。
作为本发明进一步的改进，所述类蛋白反应的方法如下：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入5-10重量份磺基丙氨酸，在温度90-120℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至37-45℃，用NaOH溶液调节pH为7.8-8.4，加入胰蛋白酶，酶解2-4h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
作为本发明进一步的改进，所述体系中胰蛋白酶的酶活力为120U/g。
本发明进一步保护一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于所述的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽作为药品、保健品以及食品的原料，具有很高的抗氧化活性、抗肿瘤活性和降血糖活性，安全无毒，可用于临床相关疾病治疗及辅助治疗。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明中利用磺基丙氨酸修饰东海乌参胶原蛋白水解产物，形成胶原蛋白抗氧化肽，该活性生物肽具备磺基丙氨酸生物活性和东海乌参胶原蛋白的抗氧化活性，具有抗氧化、清除自由基、降血糖、抗肿瘤等多种生物活性功能；
2)本发明中利用缩合反应，将磺基丙氨酸与水解肽中氨基酸活性基团进行反应结合，或者利用磺基丙氨酸中含有的能提供孤对电子的氨基，与多肽中C端的羧基或羧基残基结合，或者利用磺基丙氨酸中的羧基与多肽中N端的氨基结合，反应转化率和产率高，副产物产量低，反应产物未消旋，具有较好的生物活性，利于机体吸收；
3)本发明中利用类蛋白反应，形成的一种类似于蛋白质的混合物，消除蛋白质水解物中带有的苦味，并提高蛋白质的营养价值和功效，使得其在抗氧化、清除自由基、降血糖、提高免疫力等多种方面具体生物活性，反应以后类蛋白溶液的黏度明显增加，形触变胶体，流变学性质提高；
4)本发明中新型多功能肽的制备方法，其反应效率高，合成耗时短，产物易纯化，降低了生产成本，预处理过的生物原料活性不受破坏，且产物活性能得到提升；
5)本发明采用了上述技术方案提供一种磺基丙氨酸修饰的新型抗氧化肽的制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例1中小鼠血清溶血功能的影响对比图；
图2为本发明测试例1中对小鼠非特异性免疫的影响对比图；
图3为本发明测试例1中对小鼠免疫器官指数的影响对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，包括：天然多肽，所述天然多肽为东海乌参胶原蛋白水解蛋白产物，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；和结合在天然多肽上的、为进行修饰而导入的取代基；所述取代基为磺基丙氨酸。
实施例2
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白；
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至3，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解1h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液经过冷冻干燥，-10℃冷冻30min，-40℃冷冻10h，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为2g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入5重量份磺基丙氨酸，在温度90℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至37℃，用NaOH溶液调节pH为7.8，加入胰蛋白酶,酶活力为120U/g，酶解2h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
实施例3
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至5，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解5h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液经过喷雾干燥，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为3.5g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入10重量份磺基丙氨酸，在温度120℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至45℃，用NaOH溶液调节pH为8.4，加入胰蛋白酶,酶活力为120U/g，酶解4h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
实施例4
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白；
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至4，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解3h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液在-0.01MPa下50℃水分蒸发，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为2.8g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入7重量份磺基丙氨酸，在温度105℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至40℃，用NaOH溶液调节pH为8，加入胰蛋白酶,酶活力为120U/g，酶解3h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
对比例1
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白；
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至4，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解3h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液在-0.01MPa下50℃水分蒸发，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为2.8g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入7重量份磺基丙氨酸，在温度105℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至40℃，用NaOH溶液调节pH为8，加入胰蛋白酶,酶活力为50U/g，酶解3h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
对比例2
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白；
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至4，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解3h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液在-0.01MPa下50℃水分蒸发，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为2.8g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入20重量份磺基丙氨酸，在温度105℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至40℃，用NaOH溶液调节pH为8，加入胰蛋白酶,酶活力为120U/g，酶解3h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
对比例3
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白；
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至2，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解3h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液在-0.01MPa下50℃水分蒸发，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为2.8g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入7重量份磺基丙氨酸，在温度105℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至40℃，用NaOH溶液调节pH为8，加入胰蛋白酶,酶活力为120U/g，酶解3h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
对比例4
一种上述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.东海乌参胶原蛋白的制备：选用东海乌参作为原料，切碎，依次经过1mol/LHCl溶液浸泡1h、1mol/L NaOH溶液浸泡1h和0.5mol/L柠檬酸浸泡2h，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入2mol/L氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白；
S2.东海乌参胶原蛋白的酶解：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至4，加入胃蛋白酶，酶活力为200U/g，37℃温度下酶解3h，100℃灭活10min，10000r/min离心10min，收集上清液；
S3.以东海乌参胶原蛋白酶解产物的浓缩：将上清液在-0.01MPa下50℃水分蒸发，得到高浓度胶原蛋白水解产物，密度为2.8g/cm3，得到高浓度胶原蛋白水解产物。
S4.类蛋白反应：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入7重量份磺基丙氨酸，在温度105℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至40℃，用NaOH溶液调节pH为13，加入胰蛋白酶,酶活力为120U/g，酶解3h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
测试例1抗氧化肽的免疫活性研究
1.实验材料
1.1试验材料
1.2动物
SPF级昆明种小鼠，单一性别，体重18-22g，由海南省药物研究所提供，许可证号：SCXK(琼)2019-0005；豚鼠：健康豚鼠。
2.实验方法
以非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽为研究对象，根据卫生部《免疫-保健食品检验与评价技术规范》的药理方法，研究其对小鼠体液免疫和非特异性免疫的影响考察免疫活性。
2.1非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备：按上述实施例2-4和对比例1-4方法制备。
2.2分组及给药方式
SPF级昆明种小鼠90只，19-22g，单一性别。每个实验随机分为9组(空白对照组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组和阳性对照组)，每组10只，实验前，将所有小鼠适应性饲养2天，自由饮水和取食。实施例2-4和对比例1-4组的给药量为20mg/kg制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，阳性对照组饲喂20mg/kg的维生素C，空白对照组给予超纯水，每日1次，按小鼠体重给药，连续灌胃30天。
2.3非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽对小鼠体液免疫的影响
采集5只豚鼠血，分离出血清，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常震荡，离心取上清，制备补体，用时以SA液按1:8稀释。按照2.2项下分组、给药，制备2％的SRBC细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血、离心，用SA缓冲液稀释200倍。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC 0.5mL，补体1mL。另设不加血清的对照管。置37℃恒温水浴中保温20min后，冰浴终止反应，离心。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。血清溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式公式计算：
2.4非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽对小鼠非特异性免疫的影响
2.4.1吞噬功能测定
按照2.2项下分组、给药，制备20％的鸡红细胞悬液，每只鼠腹腔注射该悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移至37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，用瑞氏染液染色1min，再用蒸馏水漂洗晾干。
用显微镜计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
2.4.2脏器指数测定
解剖取脾脏、胸腺称重，计算脏器指数。
脏器指数＝脏器重量(mg)/小鼠体重(g)。
2.5数据处理
采用spss 22.0软件进行数据处理、统计和分析，分析结果以表示，组与组间比较采用方差分析和t检验。
3.实验结果
3.1非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽对小鼠体液免疫的影响
结果见图1。
注：与空白对照组比较，**P<0.01；与阳性对照组比较，#P＜0.05。
由图1可知，实施例2-4制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽有较大程度的促进小鼠的血清溶血素生成，与空白对照组相比，有极显著性差异(P<0.01)，与阳性对照组相比，有显著性差异(P<0.05)。对比例1-4与空白组相比，虽有一定的促进小鼠的血清溶血素的生成，但程度不大，有显著差异(P<0.05)。
3.2非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽对小鼠非特异性免疫的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量组比较，#P＜0.05。
由图2可知，与空白对照组和阳性对照组相比，实施例2-4制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽能明显提高吞噬率，有极显著性差异(P<0.01)，对比例1-4与阳性对照组相比，吞噬百分率和吞噬指数稍有提升，弱于阳性对照组，有显著差异(P<0.05)。表明本发明实施例2-4制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，可增强小鼠的非特异性免疫。
3.3非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽对小鼠免疫器官指数的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量组比较，#P＜0.05。
由图3可知，与空白对照组和阳性对照组相比，实施例2制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽能明显提高小鼠的胸腺指数，有显著性差异(P<0.05)，实施例3-4具有极显著性差异(P<0.01)，而体重和脾脏指数则没有明显差异。对比例1-4与空白对照组相比，小鼠的胸腺指数稍有提升，弱于阳性对照组，有显著差异(P<0.05)。表明本发明实施例2-4制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽能明显提高小鼠的胸腺指数，可增强小鼠的非特异性免疫。
4.结论
本发明实施例2-4制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽能明显促进小鼠的血清溶血素生成，提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，明显提高小鼠的胸腺指数，可增强小鼠的非特异性免疫。对比例1中高浓度胶原蛋白水解产物与牛磺酸与实施例3不同，在该配比下制得的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽活性不强，提高免疫力效果不大；对比例2中类蛋白反应的酶活力较低，反应较差，生成的促进小鼠的血清溶血素生成活性不高；对比例3中东海乌参胶原蛋白的酶解pH值调节为2，影响胃蛋白酶的活性，得到的酶解产物不完全，影响后续类蛋白反应，得到的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽活性不强，提高免疫力效果不大；对比例4类蛋白反应的pH值调节为13，反应中酶活性不强，导致其制备的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽活性不强，提高免疫力效果不大；表明在本发明方法下制得的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽具有更明显的提高非特异性免疫的效果，优于阳性对照组。
与现有技术相比，本发明中利用磺基丙氨酸修饰东海乌参胶原蛋白水解产物，形成胶原蛋白抗氧化肽，该活性生物肽具备磺基丙氨酸生物活性和东海乌参胶原蛋白的抗氧化活性，具有抗氧化、清除自由基、降血糖、抗肿瘤等多种生物活性功能；
本发明中利用缩合反应，将磺基丙氨酸与水解肽中氨基酸活性基团进行反应结合，或者利用磺基丙氨酸中含有的能提供孤对电子的氨基，与多肽中C端的羧基或羧基残基结合，或者利用磺基丙氨酸中的羧基与多肽中N端的氨基结合，反应转化率和产率高，副产物产量低，反应产物未消旋，具有较好的生物活性，利于机体吸收；
本发明中利用类蛋白反应，形成的一种类似于蛋白质的混合物，消除蛋白质水解物中带有的苦味，并提高蛋白质的营养价值和功效，使得其在抗氧化、清除自由基、降血糖、提高免疫力等多种方面具体生物活性，反应以后类蛋白溶液的黏度明显增加，形触变胶体，流变学性质提高；
本发明中新型多功能肽的制备方法，其反应效率高，合成耗时短，产物易纯化，降低了生产成本，预处理过的生物原料活性不受破坏，且产物活性能得到提升；
本发明采用了上述技术方案提供一种磺基丙氨酸修饰的新型抗氧化肽的制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于，包括：
天然多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；
结合在A限定的多肽上的、为进行修饰而导入的取代基；所述取代基为非蛋白氨基酸。
2.根据权利要求1所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于，所述天然多肽为东海乌参胶原蛋白水解蛋白产物。
3.根据权利要求2所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于，所述非蛋白氨基酸为磺基丙氨酸。
4.一种如权利要求3所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，以东海乌参胶原蛋白为原料，通过酶解、浓缩，得到高浓度胶原蛋白水解产物，加入一定量的磺基丙氨酸，在适宜条件下进行类蛋白反应获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
5.根据权利要求4所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述东海乌参胶原蛋白的制备方法如下：选用东海乌参作为原料，切碎，经过酸、碱和柠檬酸的浸泡，去除重金属和杂蛋白，得到粗胶原蛋白，向粗胶原蛋白溶液中加入氯化钠，离心，弃除上清液，固体经透析、冷冻干燥得到东海乌参胶原蛋白。
6.根据权利要求4所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述东海乌参胶原蛋白的酶解方法如下：向东海乌参胶原蛋白溶液中加入HCl溶液，调节pH至3-5，加入胃蛋白酶，适宜温度下酶解1-5h，灭活，离心，收集上清液。
7.根据权利要求4所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述浓缩的方法包括：冷冻干燥、喷雾干燥和减压水分蒸发，得到的高浓度胶原蛋白水解产物密度为2-3.5g/cm3。
8.根据权利要求4所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述类蛋白反应的方法如下：向100重量份高浓度胶原蛋白水解产物中加入5-10重量份磺基丙氨酸，在温度90-120℃的条件下进行缩合反应获得磺基丙氨酸化蛋白肽，然后降至37-45℃，用NaOH溶液调节pH为7.8-8.4，加入胰蛋白酶，酶解2-4h，灭活，离心，收集上清液，透析，冷冻干燥，获得非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽。
9.根据权利要求8所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述体系中胰蛋白酶的酶活力为120U/g。
10.一种如权利要求1-9任一项权利要求所述非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于所述的非蛋白氨基酸修饰的胶原蛋白抗氧化肽作为药品、保健品以及食品的原料，具有很高的抗氧化活性、抗肿瘤活性和降血糖活性，安全无毒，可用于临床相关疾病治疗及辅助治疗。
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