CN110317848A - 一种胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种胶原蛋白肽的制备方法，所述制备方法包括超声辅助溶剂萃取、超声辅助碱性脂肪酶酶解以及多步酶解，本发明具有脱脂和脱杂蛋白效率高、蛋白利用率超过82％的优点，产品具有滋补性并可提升食品的咸味和鲜味。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
肽是氨基酸通过肽键连接起来的一种物质，是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是使蛋白质具有数以千万种功能的基础。蛋白质在人体消化系统中通过多种蛋白酶水解形成多肽，不像之前被人们认为仅是以氨基酸的形式被人体吸收，更多的是以低聚肽的形式被吸收。
胶原蛋白中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸的27％，脯氨酸和羟脯氨酸的含量也特别高，占14％，这两种是胶原蛋白的特有氨基酸，而色氨酸、酪氨酸以及蛋氨酸等必需氨基酸含量低，因此，胶原蛋白属不完全蛋白质。胶原蛋白呈白色，是一种多糖蛋白，含有少量的半乳糖和葡萄糖。胶原蛋白具有很强的延伸力，不溶于水，能溶于微温的稀酸中。
胶原蛋白是动物皮肤、骨骼、软骨、牙齿、血管等的主要组成成分，有着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％-30％。胶原蛋白与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递，以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系，在医学材料、化妆品、食品工业等均有着广泛应用。
胶原蛋白是人体的一种非常重要的蛋白质，主要存在于结缔组织中，是人体皮肤的主要成分，占皮肤干重70％-80％。皮肤的生长、修复和营养都离不开胶原蛋白。胶原蛋白使细胞变得丰满，从而使肌肤充盈，保持皮肤弹性与润泽，维持皮肤细腻光滑，皮肤健康的两大关键——抗皱与保湿都与胶原蛋白有关。医学研究提示：胶原蛋白中的羟脯氨酸是人体皮肤形成的关键物。骨骼中有机物的70％-80％是胶原蛋白，骨骼生成时，首先必须合成充足的胶原蛋白纤维来组成骨骼的框架，因此，有人称胶原蛋白为骨骼中的骨骼。胶原蛋白亦是眼睛角膜的主要成分，但以结晶形式组成。但是，大约25岁以后，人体内的胶原蛋白流失的速度就开始加快，供给不及耗损，再加上紫外线照射以及体内的氧化作用，都可能破坏胶原蛋白的结构，让它失去原有的弹力，这就是皱纹和脸部皮肤松弛提早出现的原因。因此，及时补充流失的胶原蛋白对人体的健康至关重要。
但是，胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，直接食用利用率较低；如果将胶原蛋白水解为多肽后，消化吸收率几乎达到100％，而其营养剂生理功能也会显著提高。
胶原蛋白资源丰富，通常分布在海洋生物和动物皮肤骨骼中，从胶原蛋白中提取的胶原蛋白肽因其分子量小，易被人体吸收利用及其具有众多生物功能性等特点越来越受到人们的关注。使用蛋白酶将胶原蛋白水解获得的胶原蛋白肽，不仅利于体内吸收，而且具有多种生物活性，如抗氧化，降血压，抑制肿瘤，促进皮肤胶原代谢等。因此探究胶原蛋白的水解方法至关重要。
在胶原蛋白的水解过程中，脂肪和杂蛋白的脱除是非常重要的一步。目前，脱脂和脱除杂蛋白的方法主要有溶剂萃取法、脂肪酶法、酸或碱化法等。单独使用酸或碱法处理易导致胶原蛋白化学变性；单独采用酶法处理，尽管制备条件温和，但脱脂率较低；单独使用溶剂萃取法可脱除油脂但很难脱除杂蛋白，而且产物中可能会有溶剂的残留。
中国专利申请CN 104561206A公开了一种易吸收的胶原蛋白肽，其制备过程中以罗非鱼骨为原料，利用氯仿和乙醇进行脱脂，再选择胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在酸性条件下通过三步酶法进行酶解，获得的胶原蛋白肽分子量较低，易于吸收，但是脱脂率和蛋白利用率有待提高。
因此，利用开发一种能解决上述技术问题的胶原蛋白肽的制备方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种脱脂和脱杂蛋白效率高、蛋白利用率高的胶原蛋白肽的制备方法。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将动物皮肤或骨骼用清水洗净，粉碎，得物质A；
(2)将物质A和有机溶剂混合，超声辅助萃取，过滤，得物质B；
(3)将物质B与碱性脂肪酶溶液混合，超声辅助酶解，过滤，将过滤物洗涤至中性，得物质C；
(4)将物质C和水混合，在所得混合溶液中依次加入木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶进行酶解，灭酶，离心，取上清液，干燥，即得。
上述方法步骤(3)中所述物质C的脱脂率为80-99.5％，羟脯氨酸的含量为8-14mg/g，羟脯氨酸占总氨基酸的质量分数为9-12％。所述物质C为蛋白质，羟脯氨酸作为胶原蛋白的代表性氨基酸，如果羟脯氨酸的含量较高，则所述物质C中胶原蛋白的含量较高，杂蛋白的含量较低，说明脱杂蛋白的效果较好。通过测量物质C的脱脂率和羟脯氨酸的含量，可以作为质量指标指示步骤(1)-(3)脱杂蛋白和脱脂的效果，实现产品的质量控制。
上述方法步骤(4)中所述木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶购买于广西庞博生物科技公司或诺维信公司。
优选地，步骤(1)中所述动物皮肤或骨骼为去除指尖的鸡脚。鸡脚皮及骨骼中含有丰富的胶原蛋白。
更优选地，所述去除指尖的鸡脚切段3-5cm。
更优选地，所述步骤(1)包括如下步骤：将去除指尖的鸡脚切段3-5cm，用清水洗净，粉碎成糜状，得物质A。
优选地，步骤(2)中所述有机溶剂为石油醚和无水乙醇的混合溶剂。
更优选地，所述石油醚和无水乙醇体积比为1:0.5-2。
优选地，步骤(2)中所述有机溶剂和物质A按照质量比1-10:1混合。
优选地，步骤(2)中所述物质A和有机溶剂在10-50℃条件下混合。
优选地，步骤(2)中所述超声的功率为100-500w。
优选地，步骤(2)中所述超声时间5-60min。
更优选地，所述步骤(2)包括如下步骤：将石油醚/无水乙醇(体积比1:0.5-2)的混合溶剂和物质A按照质量比1-10:1，在10-50℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为100-500w，超声时间5-60min，过滤，去除溶剂，得物质B。
优选地，所述步骤(2)还包括过滤后将过滤物和有机溶剂混合，超声辅助，过滤，重复1-5次，得产物B。
更优选地，所述步骤(2)包括如下步骤：将石油醚/无水乙醇(体积比1:0.5-2)的混合溶剂和物质A按照质量比1-10:1，在10-50℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为100-500w，超声时间5-60min，过滤，去除溶剂，将过滤物按照上述步骤重复处理1-5次，得物质B。
优选地，步骤(3)所述碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为1-8％。
优选地，步骤(3)所述碱性脂肪酶溶液中的碱的浓度以氢氧根离子计为0.01-1mol/L。
更优选地，所述碱为氢氧化钠。
优选地，步骤(3)中所述碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比1-10:1混合。
优选地，步骤(3)中所述超声的功率为100-500w。
优选地，步骤(3)中所述超声时间20-60min。
优选地，步骤(3)中所述洗涤至中性用水洗涤。
更优选地，所述步骤(3)包括如下步骤：将碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比1-10:1混合，碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为1-8％，碱的浓度以氢氧根离子计为0.01-1mol/L，超声辅助酶解，超声的功率为100-500w，超声时间20-60min，过滤，将过滤物用水洗涤至中性，得物质C。
优选地，步骤(4)中将所述水和物质C按照质量比1:1-10混合。
优选地，步骤(4)中将所述水和物质C在40-60℃条件下混合。
优选地，步骤(4)中所述木瓜蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-4h。
优选地，步骤(4)中所述复合蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-4h。
优选地，步骤(4)中所述碱性蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-2h。
更优选地，所述碱性蛋白酶酶解时的pH为5.0-8.0。
优选地，步骤(4)中所述胰蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.2-5h。
优选地，步骤(4)中所述风味蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-2.5％，酶解时间0.2-2h。
更优选地，步骤(4)中所述木瓜蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-4h；所述复合蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-4h；所述碱性蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-2h；所述胰蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.2-5h；所述风味蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-2.5％，酶解时间0.2-2h。
优选地，步骤(4)中所述灭酶温度为85-100℃，时间8-15min。
优选地，步骤(4)中所述干燥为冷冻干燥，温度为-70～-80℃，时间为10-24h。
更优选地，所述步骤(4)包括如下步骤：将水和物质C按照质量比1:1-10，在40-60℃条件下混合，在所得混合溶液中依次加入0.1-1.5％木瓜蛋白酶酶解0.5-4h、0.1-1.5％复合蛋白酶酶解0.5-4h、0.1-1.5％碱性蛋白酶酶解0.5-2h、0.1-1.5％胰蛋白酶酶解0.2-5h、0.1-2.5％风味蛋白酶酶解0.2-2h，85-100℃下灭酶8-15min，离心，取上清液，-70～-80℃下冷冻干燥10-24h，即得。
本发明还涉及上述制备方法制备得到的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽以重量份数计，分子量＞5000Da的组分0-4份，3000Da＜分子量≤5000Da的组分20-30份，1000Da≤分子量≤3000Da的组分40-50份，分子量＜1000Da的组分25-40份。
所述胶原蛋白肽的水解度为20-40％，蛋白利用率82-92％。
本发明还涉及上述制备方法制备得到的胶原蛋白肽在食品或化妆品中的应用。所述胶原蛋白肽除了具有一定滋补功能，还可提升食品的鲜味。
本发明的有益效果是：
本发明采用超声辅助溶剂萃取和超声辅助碱性脂肪酶酶解，两步进行脱脂和脱除杂蛋白处理，具有脱脂和脱除杂蛋白效率高的优点。尤其是采用石油醚和乙醇为溶剂时，并利用碱性脂肪酶进行酶解，脱脂和脱除杂蛋白的效果进一步提高。
本发明采用多步酶解技术，依次采用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，并限定酶的质量分数和酶解时间，具有蛋白利用率高的优点。最终得到的胶原蛋白肽分子量分布范围可控，并且可提升食品的咸味和鲜味，同时不具有苦味。
附图说明
图1为实施例3物质C氨基酸分析的HPLC色谱图。其中，1-天冬氨酸，2-谷氨酸，3-丝氨酸，4-组氨酸，5-甘氨酸，6-苏氨酸，7-精氨酸，8-丙氨酸，9-酪氨酸，10-胱氨酸，11-缬氨酸，12-甲硫氨酸，13-苯丙氨酸，14-异亮氨酸，15-氨酸，16-赖氨酸，17-羟脯氨酸，18-脯氨酸。
图2为实施例4胶原蛋白肽分子量测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去除指尖的鸡脚切段3-5cm，用清水洗净，研磨仪粉碎成糜状，得物质A；
(2)将石油醚/无水乙醇(体积比1:0.5)的混合溶剂和物质A按照质量比1:1，在10℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为100w，超声时间5min，过滤，去除溶剂，得物质B；
(3)将碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比1:1混合，碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为1％，碱的浓度以氢氧根离子计为0.01mol/L，超声辅助酶解，超声的功率为100w，超声时间20min，过滤，将过滤物用水洗涤至中性，得物质C；
(4)将水和物质C按照质量比1:1混合，在48℃条件下，在所得混合溶液中依次加入0.1％木瓜蛋白酶酶解0.5h、0.1％复合蛋白酶酶解0.5h、0.1％碱性蛋白酶酶解0.5h(调节pH为5.0)、0.1％胰蛋白酶酶解0.2h、0.1％风味蛋白酶酶解0.2h，85℃下灭酶8min，离心，取上清液，-70℃下冷冻干燥10h，即得。
实施例2
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去除指尖的鸡脚切段3-5cm，用清水洗净，研磨仪粉碎成糜状，得物质A；
(2)将石油醚/无水乙醇(体积比1:2)的混合溶剂和物质A按照质量比10:1，在50℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为500w，超声时间60min，过滤，去除溶剂，将过滤物按照上述步骤重复处理1次，得物质B；
(3)将碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比10:1混合，碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为8％，碱的浓度以氢氧根离子计为1mol/L，超声辅助酶解，超声的功率为500w，超声时间60min，过滤，将过滤物用水洗涤至中性，得物质C；
(4)将水和物质C按照质量比1:10，在50℃条件下混合，在所得混合溶液中依次加入1.5％木瓜蛋白酶酶解4h、1.5％复合蛋白酶酶解4h、1.5％碱性蛋白酶酶解2h(调节pH为8.0)、1.5％胰蛋白酶酶解5h、2.5％风味蛋白酶酶解2h，100℃下灭酶15min，离心，取上清液，-80℃下冷冻干燥24h，即得。
实施例3
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去除指尖的鸡脚切段3-5cm，用清水洗净，研磨仪粉碎成糜状，得物质A；
(2)将石油醚/无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂和物质A按照质量比5:1，在30℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为300w，超声时间30min，过滤，去除溶剂，将过滤物按照上述步骤重复处理5次，得物质B；
(3)将碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比5:1混合，碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为4％，碱的浓度以氢氧根离子计为0.5mol/L，超声辅助酶解，超声的功率为300w，超声时间40min，过滤，将过滤物用水洗涤至中性，得物质C；
(4)将水和物质C按照质量比1:5，在50℃条件下混合，在所得混合溶液中依次加入0.8％木瓜蛋白酶酶解2h、0.8％复合蛋白酶酶解2h、0.8％碱性蛋白酶酶解1h(调节pH为7.0)、0.8％胰蛋白酶酶解2.5h、1.3％风味蛋白酶酶解1h，90℃下灭酶12min，离心，取上清液，-75℃下冷冻干燥17h，即得。
实施例4
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去除指尖的鸡脚切段3-5cm，用清水洗净，研磨仪粉碎成糜状，得物质A；
(2)将石油醚/无水乙醇(体积比1:1.5)的混合溶剂和物质A按照质量比6:1，在25℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为400w，超声时间30min，过滤，去除溶剂，将过滤物按照上述步骤重复处理3次，得物质B；
(3)将碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比4:1混合，碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为5％，碱的浓度以氢氧根离子计为0.6mol/L，超声辅助酶解，超声的功率为400w，超声时间35min，过滤，将过滤物用水洗涤至中性，得物质C；
(4)将水和物质C按照质量比1:4，在45℃条件下混合，在所得混合溶液中依次加入1％木瓜蛋白酶酶解2h、1.2％复合蛋白酶酶解1.5h、0.8％碱性蛋白酶酶解1h(调节pH为7.5)、0.5％胰蛋白酶酶解3h、1.5％风味蛋白酶酶解1.5h，100℃下灭酶10min，离心，取上清液，-70℃下冷冻干燥12h，即得。
对比例1
一种胶原蛋白肽的制备方法，与实施例4的区别仅在于步骤(2)中所用有机溶剂不同，为无水乙醇，其余条件均相同。
对比例2
一种胶原蛋白肽的制备方法，与实施例4的区别仅在于步骤(2)中所用有机溶剂的配比，石油醚/无水乙醇的体积比4:1，其余条件均相同。
对比例3
一种胶原蛋白肽的制备方法，与实施例4的区别仅在于不采用步骤(3)，其余条件均相同，具体如下：
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去除指尖的鸡脚切段3-5cm，用清水洗净，研磨仪粉碎成糜状，得物质A；
(2)将石油醚/无水乙醇(体积比1:1.5)的混合溶剂和物质A按照质量比6:1，在25℃条件下混合，超声辅助萃取，超声的功率为400w，超声时间30min，过滤，去除溶剂，将过滤物按照上述步骤重复处理3次，得物质B；
(3)将水和物质B按照质量比1:4，在45℃条件下混合，在所得混合溶液中依次加入1％木瓜蛋白酶酶解2h、1.2％复合蛋白酶酶解1.5h、0.8％碱性蛋白酶酶解1h(调节pH为7.5)、0.5％胰蛋白酶酶解3h、1.5％风味蛋白酶酶解1.5h，100℃下灭酶10min，离心，取上清液，-70℃下冷冻干燥12h，即得。
对比例4
一种胶原蛋白肽的制备方法，与实施例4的区别仅在于步骤(4)中酶的添加顺序不同，其余条件均相同，具体如下：
(4)将水和物质C按照质量比1:4，在45℃条件下混合，在所得混合溶液中依次加入1.2％复合蛋白酶酶解1.5h、1％木瓜蛋白酶酶解2h、0.5％胰蛋白酶酶解3h、0.8％碱性蛋白酶酶解1h(调节pH为7.5)、1.5％风味蛋白酶酶解1.5h，100℃下灭酶10min，离心，取上清液，-70℃下冷冻干燥12h，即得。
测试例1
(1)实施例1-4和对比例1-4脱脂率的测定，具体如下：
M2—脱脂前100g物质A中脂肪的含量(g)；
M1—100g物质A脱脂后物质C中脂肪的含量(g)；
脂肪含量的测定：参考国标GB/T 5009.6-2016。
测试结果见表1。
(2)实施例1-4和对比例1-4胶原蛋白肽水解度(DH)的测定，具体如下：DH(％)＝(胶原蛋白肽游离氨基氮的含量/物质A总氮的含量)×100％。
游离氨基氮测定：测试前准确称取10g胶原蛋白肽，用40g水溶解胶原蛋白肽，所得水溶液作为待测样品。采用甲醛电位滴定法测定游离氨基氮含量。
测定方法：吸取5.0mL待测样品，加水定容至100.00mL，得溶液A。吸取20.00mL溶液A置于烧杯中，加水40.00mL，得溶液B。在搅拌作用下，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定溶液B至pH为8.2。再加入10.00mL 36％的甲醛溶液，混匀，再用0.05mol/L NaOH标准溶液继续滴定至pH为9.2，记下加入甲醛溶液后溶液pH滴定至9.2，氢氧化钠标准溶液消耗的体积V1。
同时取水60mL，和溶液B做对照，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至pH为8.2。再加入10.00mL 36％的甲醛溶液，混匀，再用0.05mol/L NaOH标准溶液继续滴定至pH为9.2，做空白试剂试验，记下加入甲醛溶液后溶液pH滴定至9.2，氢氧化钠标准溶液消耗的体积V2。按照公式(1)计算。
X—待测样品中游离氨基氮的含量(g/100mL)；
V1—待测样品加入甲醛溶液后氢氧化钠标准溶液消耗体积(mL)；
V2—空白试剂加入甲醛溶液后氢氧化钠标准溶液消耗体积(mL)；
V3—溶液A取用量(mL)；
C—氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L)；
0.014—1.0mL浓度为1.000mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量(g)。
总氮测定：凯氏定氮法，参考国标GB 5009.5-2016。
测试结果见表1。
(3)实施例1-4和对比例1-4蛋白利用率的测定，具体如下：
M1—物质A的质量(g)；
M2—物质A制备得到的胶原蛋白肽的质量(g)；
W1—物质A中蛋白质的含量(％)；
W2—物质A制备得到的胶原蛋白肽中蛋白质含量(％)。
蛋白质含量的测定：凯氏定氮法，参考国标GB/T 5009.5-2016。
测试结果见表1。
表1产品脱脂率、水解度和蛋白利用率测试结果
测试例2
物质A和物质C氨基酸组成及含量测试，称取0.2g样品，加入10mL 6mol/L HCl溶液，，在110℃下水解22h后，过0.22μm滤膜后分析。
色谱条件：PorosheLL HPH-C18氨基分析柱，4.6ⅹ100mm，粒径2.7μm，流动相(A)：pH 8.2的5mmol/L Na2HPO4-Na2B4O7缓冲液，流动相(B)：甲醇-乙腈-水(45:45:10)，衍生试剂：OPA试剂、FMOC试剂。
梯度洗脱:0-18min，B相从2％上升到100％再降到2％，流速：1mL/min，柱温40℃，检测波长：0-13min，波长338nm，10nm带宽，参比390nm，20nm带宽(一级氨基酸)；13-18min，波长262nm，16nm带宽，参比324nm，8nm带宽(二级氨基酸)。
包括羟脯氨酸在内的18种氨基酸利用6mol/L盐酸配制标混合准品溶液，浓度0.05-1.0mmol/mL范围，进样分析，绘制18种氨基酸的标准曲线，将所测样品中氨基酸的峰面积带入标准曲线中，得到样品中氨基酸的浓度(mmol/mL)。
实施例3物质C氨基酸组成及含量测试结果如表2所示，谱图如图1所示。
表2实施例3物质C氨基酸组成及含量测试结果
表3物质A、实施例1-4和对比例1-4物质C羟脯氨酸含量测试结果
测试例3
胶原蛋白肽分子量测定，方法如下：
高效液相凝胶色谱分析分子量:色谱柱条件：TSK geL G2000SWXL凝胶柱(7.8mm×300mm，5μm)，保护柱(6.0mm×4.0mm，5μm)；流动相为水:乙腈:三氟乙酸＝80:20:0.1(v/v/v)；流速：0.5mL/min；柱温25℃；进样量10μL；检测波长为220nm。运行时间为20min。
将5种不同分子量的标准品，从189Da至12500Da，分别是乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(189Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451Da)、杆菌酶(1450Da)、抑肽酶(6500Da)、细胞色素(12500Da)的标准品在同样条件下进样，做分子量分布的标准曲线。
色谱相对峰面积(百分数):计算分子量分布。
实施例4的谱图如图2所示。图2中不同分子量的胶原蛋白肽重量百分比如下：1，分子量＞5000Da的组分比例是2.81％；2，3000Da＜分子量≤5000Da的组分比例是22.15％；3，1000Da≤分子量≤3000Da的组分比例是44.87％；4，分子量＜1000Da的组分比例是30.18％。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将动物皮肤或骨骼用清水洗净，粉碎，得物质A；
(2)将物质A和有机溶剂混合，超声辅助萃取，过滤，得物质B；
(3)将物质B与碱性脂肪酶溶液混合，超声辅助酶解，过滤，将过滤物洗涤至中性，得物质C；
(4)将物质C和水混合，在所得混合溶液中依次加入木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶进行酶解，灭酶，离心，取上清液，干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述动物皮肤或骨骼为去除指尖的鸡脚。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述有机溶剂为石油醚和无水乙醇的混合溶剂；所述有机溶剂和物质A按照质量比1-10:1，在10-50℃条件下混合；所述超声的功率为100-500w，所述超声时间5-60min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述石油醚和无水乙醇体积比为1:0.5-2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)包括将物质A和有机溶剂混合，超声辅助，过滤，重复1-5次，得产物B。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述碱性脂肪酶溶液中的脂肪酶的质量分数为1-8％，碱的浓度以氢氧根离子计为0.01-1mol/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述碱性脂肪酶溶液与物质B按照质量比1-10:1混合；所述超声的功率为100-500w，所述超声时间20-60min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中将所述水和物质C按照质量比1:1-10，在40-60℃条件下混合；所述木瓜蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-4h；所述复合蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-4h；所述碱性蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.5-2h；所述胰蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-1.5％，酶解时间0.2-5h；所述风味蛋白酶在所述混合溶液中的质量分数为0.1-2.5％，酶解时间0.2-2h；所述灭酶温度为85-100℃，时间8-15min。
9.权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的胶原蛋白肽，其特征在于，以重量份数计，分子量＞5000Da的组分0-4份，3000Da＜分子量≤5000Da的组分20-30份，1000Da≤分子量≤3000Da的组分40-50份，分子量＜1000Da的组分25-40份。
10.权利要求9所述胶原蛋白肽在食品或化妆品中的应用。
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