CN105061563A

CN105061563A - 一种蚕丝蛋白多肽及其制备和应用

Info

Publication number: CN105061563A
Application number: CN201510450309.5A
Authority: CN
Inventors: 罗瑞雪
Original assignee: Suzhou Puluoda Biological Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Puluoda Biological Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明公开了一种蚕丝蛋白多肽，涉及生物技术多肽制备领域。其序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP。其制备步骤包括将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；煮沸、超声1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40℃反应30-60分钟；离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；将上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH5.5-6.0缓冲液中，采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。本发明可作为制备化妆品中的添加剂。抗原实验结果表明，该多肽没有抗原性。该多肽没有抗原性，体外抑制酪氨酸酶的实验证实其具有美白功能。

Description

一种蚕丝蛋白多肽及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术多肽制备领域，具体涉及蚕丝蛋白多肽制备领域。

技术背景

蚕丝蛋白(Fibroin)又名：丝素蛋白。丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％～80％，含有18种氨基酸，其中甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)和丝氨酸(ser)约占总组成的80％以上。

蚕丝蛋白质在化妆品领域被开发利用。由于蚕丝蛋白质与人体皮肤角朊蛋白质极相似，两者有极好的亲和性；由于蚕丝蛋白质分子特殊的化学结构，所以蚕丝蛋白质具有良好的吸湿性和散湿性能，能适应周围环境的变化，起天然调湿、改善人体皮肤营养、防止皮肤起皱、增强皮肤细胞活力和弹性、促进细胞新陈代谢及维持皮肤正常生理状态的作用；蚕丝蛋白质还具有吸收紫外线，防止日光辐射对人体皮肤损害的作用，所以蚕丝蛋白质已被广泛用于美容化妆品的优良添加剂。

然而，蚕丝蛋白是具有66个氨基酸的蛋白质，分子量较大，往往会引起过敏反应，导致皮肤瘙痒，从而无法起到应有的护肤作用。小分子蛋白质或多肽就不容易诱发免疫变态反应。但是，小分子蛋白质往往会失去原形蛋白质的功效。因此，如何才能让分解后的蚕丝蛋白小分子既有原蛋白质的功效，且不引起过敏，一直是一个难以协调的问题。

发明内容

发明目的

针对现有蚕丝蛋白化妆品的现状，发明一种蚕丝蛋白多肽及制备和应用，制备的蚕丝蛋白多肽，该多肽应用于化妆品，其既有原蚕丝蛋白的功效，而且不产生过敏反应。

技术方案

本发明为一种蚕丝蛋白多肽，其序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP。制备步骤包括(1)将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；(2)煮沸、超声1-2小时，同时缓慢搅拌；(3)待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40℃反应30-60分钟；(4)离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；(5)将上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；(6)将沉淀物复溶于pH5.5-6.0缓冲液中，采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。所述的水解酶，可以是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶、朝鲜蓟蛋白酶等。所述的蚕丝蛋白多肽，在制备化妆品中的应用。

本发明多肽也可委托上海吉尔合成，纯度为95％以上。

有益效果

本发明的制备得到的蚕丝蛋白多肽，经蛋白质序列测定，序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP，纯度大于80％。实验表明，该多肽能抗氧化的作用，作用与原蚕丝蛋白相当。抗原实验结果表明，该多肽没有抗原性，体外抑制酪氨酸酶的实验证实其具有美白功能。

具体实施方式

实施例1

将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；煮沸、超声1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入菠萝蛋白酶，在室温反应60分钟；离心2000rpm，5-10分钟，取上清；将上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH5.5-6.0缓冲液中，采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP，纯度为88.9％。

实施例2

将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；煮沸、超声1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入无花果蛋白酶，在37℃反应30分钟；离心3000rpm，5-10分钟，取上清；将上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH5.5-6.0缓冲液中，采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP，纯度为82.2％。

实施例3

将上海吉尔合成的多肽添加入乳膏基质中，进行免疫原性检测。BALB/c白鼠6只，雌雄各半，将小鼠背部脱毛，裸露皮肤。分别取不同浓度的蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0，2.0mg/ml)以1.25μL/cm2涂敷密度短期1次涂敷，每日涂敷1次，连续8周，于1-12周眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，-20℃低温保存备用。待室温溶解后，取0.1ml上清液间接ELISA检测血清中抗体滴度。以各样品实际A值(OD450)比阴性对照血清A值即得RA值，RA≥2.1即为阳性，将Bloodbio-samples样品作一系列稀释后进行检测，呈阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。测定结果显示。1-12周收集的血样，经ELISA间接法检测多肽诱导抗体均为阴性。由此可见，本发明得到的蚕丝蛋白多肽无免疫原性。

实施例4

将上海吉尔合成的多肽添加入乳膏基质中，采用1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)法测定蚕丝蛋白多肽清除自由基活性。分别取不同浓度的蚕丝蛋白2.0mg/ml、蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0，2.0mg/ml)1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(％)＝A₀-(A_s-A_c)/A₀×100％(公式中，A₀—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值；A_s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值；A_c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值)，将实验重复三次，2.0mg/ml蚕丝蛋白、0.5，1.0，2.0，mg/ml蚕丝蛋白多肽溶液的清除率分别为32.12、25.41、33.62、52.92％。可见，蚕丝蛋白多肽溶液具有抗氧化的作用，且与原型蚕丝蛋白相比，其抗氧化作用不变。

实施例5

抑制酪氨酸酶的实验

上海吉尔合成的多肽给药组反应混合物2mL：0.1MpH6.8PBS0.9mL加不同浓度的多肽1mL加0.03％酪氨酸0.1mL。37℃的恒温箱孵育10min,加0.1mL的酪氨酸酶(350u/mL)水溶液,将溶液混合均匀,置于37℃的恒温箱中反应25min后,用分光光度计于475mm测定吸光度值；阴性对照组以等体积的蒸馏水代替多肽用分光光度计于475mm测定吸光度值；阳性对照组用熊果苷代替多肽用分光光度计于475mm测定吸光度值；0.1MpH6.8PBS按照2005版《中国药典》配制。多肽分为1、5、10mg/mL。同时，以熊果苷(10mg/mL)作为阳性对照组。抑制率％＝(1-给药组/阴性组)*100％；每个浓度多肽实验均重复统计学处理试验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验，使用Excel软件做数据分析处理。

皮肤黑素形成是一个十分复杂的过程,在皮肤黑素的形成过程中由于受到紫外线、遗传、内分泌、炎症介质、饮食不当等因素的影响，色素代谢异常，皮肤黑素过快增长和分布不均，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，表现为黄褐斑、雀斑和炎症后色素沉着等。酪氨酸酶为含Cu离子的氧化酶，其普遍存在于哺乳动物、植物和微生物中，主要参与生物体内黑色素和其他多酚类物质的形成过程，是生物体合成黑色素的关键酶，酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成,因而可用来预防和治疗色素沉着等。本发明通过体外实验观察了多肽对酪氨酸酶活性的抑制作用，结果表明不同浓度的多肽液对酪氨酸酶活性均有抑制作用，且具有显著的量效关系，证实其具有确切的美白祛斑功效。

SEQUENCELISTING

<110>苏州普罗达生物科技有限公司

<120>一种蚕丝蛋白多肽1及其制备和应用

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

ArgArgThrAspLysHisIleAlaIleLeuAsnAsnGlnGluIleGln

151015

LysPhePro

Claims

1.一种蚕丝蛋白多肽，其特征在于，序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP。

2.根据权利要求1所述蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括（1）将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；（2）煮沸、超声1-2小时，同时缓慢搅拌；（3）待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40℃反应30-60分钟；（4）离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（5）将上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（6）将沉淀物复溶于pH5.5-6.0缓冲液中，采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。

3.根据权利要求书2所述蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的水解酶是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶或朝鲜蓟蛋白酶。

4.根据权利要求书1所述的蚕丝蛋白多肽在制备化妆品中的应用。