CN103103244A - 核桃降血压活性肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了核桃降血压活性肽及其制备方法与应用。所述方法包括将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经分子量分级后脱苦，获得核桃降血压活性肽；所述变性采用微波结合超声波的处理方式，使核桃蛋白适度变性，提高了核桃蛋白水解程度，增加了核桃肽得率，提高了制备效率；所述脱苦是在分子量分级后进行的，使降血压活性较高的肽段得到富集。本发明方法获得的核桃肽具有明确的体内和体外降血压活性，并用β-环状糊精有效掩盖了苦味，容易吸收，感官品质良好，可广泛地应用到功能食品、保健品、食品添加剂中。
Description
技术领域
本发明涉及一种核桃降血压活性肽及其制备方法与应用。
背景技术
核桃为胡桃科胡桃属植物，是世界四大干果之一。核桃油中饱和脂肪酸总量一般小于10%，不饱和脂肪酸主要有油酸、亚油酸和亚麻酸，总量约90%，为人体必需的脂肪酸，对调节生理机能有重要作用。
核桃仁中蛋白的含量约为15%，其中含有18种氨基酸,8种人体必需氨基酸,且含量合理,接近联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)规定的标准，是一种很好的木本植物蛋白。核桃制油剩余的核桃粕占核桃仁重量的40%-60%，其中蛋白含量在30%以上，多被用作动物饲料原料，造成资源浪费。因此对核桃进行深加工，通过提取核桃蛋白对其进行再利用，既可提高核桃加工的附加值，又可以充分利用核桃蛋白资源。
核桃多肽一般由3-20个氨基酸组成，采用适当的蛋白酶对核桃蛋白进行水解，可获得具有一定生物活性的核桃蛋白肽，其活性主要包括抗氧化、提高免疫力、降血压活性等。已有发明专利涉及酶解核桃蛋白制备核桃肽的技术，但对核桃肽的具体生物活性未作明确界定。制备小分子多肽的方法主要包括化学水解法和生物酶解法。生物酶解法与化学水解法制备核桃肽相比，具有反应条件温和，氨基酸受损较少，可以获得特定肽段的优势，但同时存在水解时间较长，短肽得率较低等缺点。酶解之后得到核桃混合多肽,多具有较重的苦味，影响了在食品加工中的应用。根据前面述及的核桃蛋白肽制备中存在的问题，选用合适的蛋白酶和酶解工艺，结合辅助方式提高核桃肽得率，脱除核桃肽的苦味，提高核桃肽的生物活性，对核桃产品多样化和保健食品及药品的开发具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种核桃降血压活性肽及其制备方法与应用。
本发明所提供的核桃降血压活性肽的制备方法，包括如下步骤：
将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经分子量分级后脱苦，获得核桃降血压活性肽；
为了提高酶解效率和短肽得率，所述变性按照包括如下步骤的方法进行：将所述核桃蛋白配制成浓度为30—80g/L（如30、50或80g/L）的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液100-1000W（如100、500或1000W），处理时间为10-15分钟（如10、12或15分钟）；在所述超声波处理中，超声波的频率为40—60kHz（如40、50或60kHz），处理时间为20—50分钟（如20、30或50分钟）；所述核桃蛋白液在进行所述微波处理时的起始温度为25℃。
在上述方法中，为了较少地引入盐离子，所述蛋白酶为中性蛋白酶，具体可为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000—2000U（如1000、1500或2000U）的所述蛋白酶进行；所述酶解的温度为45℃—55℃（如45、48或55℃）；所述酶解的pH值为6.0—6.8（如6.0、6.4或6.8）；所述酶解的时间为2—4小时（如2、3或4小时）；所述酶解的pH值使用1mol/L氢氧化钠溶液调节。
在上述方法中，所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行：将所述核桃肽依次通过0.45μm微滤膜、8kD超滤膜和1kD超滤膜，收集透过所述1kD超滤膜的核桃肽；所述超滤膜具体可为再生纤维素膜。
在上述方法中，所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行：45℃—60℃（如45、50或60℃）条件下，将所述透过所述1kD超滤膜的核桃肽与β-环状糊精以100:(16—20）（如100:16、100:18或100:20）的质量比混合包埋处理10—20分钟（如10、15或20分钟）。
所述透过所述1kD超滤膜的核桃肽在所述混合包埋的体系中的浓度为20—80g/L（如20、50或80g/L）。
所述脱苦后的产物可通过真空冷冻干燥，制成核桃肽粉，以方便储运、用作其他剂型和相关产品的加工；
所述真空冷冻干燥按照包括如下步骤的方法进行：将所述脱苦后的产物于-50℃～-45℃条件下预冻5小时后，于物料隔板温度10℃，真空度为5—30Pa条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5℃～10℃，得到粉状的所述核桃降血压活性肽，包装后得到成品。
在上述方法中，所述核桃蛋白可通过商业途径购买，也可按照包括如下步骤的方法制备：取质量比为（5—10）:100（如5:100、8:100或10:100）的核桃粕和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.1—0.9mol/L（如0.1、0.8或0.9mol/L）的NaOH溶液调pH值至7.5—8.4（如7.5、8.0或8.4），于55℃下搅拌1.5—2小时（即进行碱溶），离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至4.6—6.5（如4.6、5.0或6.5），离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白；将所述沉淀用水溶解后，进行冷冻干燥，得到核桃蛋白粉。
本发明保护上述任一所述方法制备得到的核桃降血压活性肽。
本发明保护所述核桃降血压活性肽在制备降血压产品（或药物）中的应用。
实验证明，本发明所提供的核桃降血压活性肽为浅黄色粉末，分子量在300-1200Da之间，精氨酸的摩尔百分比为14.72%，谷氨酸摩尔百分比为17.29%。该活性肽具有良好的血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性和体内降血压活性。在核桃降血压活性肽浓度为1.0mg/mL时，ACE抑制率为84.26%，一次给药剂量为150—300mg/kg即对SHR（原发性高血压大鼠）有显著降血压效果，且对SHR的心率无影响；多次给药剂量以每天150mg/kg、300mg/kg、900mg/kg剂量喂养的SHR大鼠在9天后，SBP（尾动脉收缩压）与空白对照组相比有极显著降低，300mg/kg以上剂量喂养的SHR大鼠在21天后，SBP与空白对照组相比有显著降低。
本发明所提供的核桃降血压活性肽制备方法与其他方法相比，采用了微波结合超声波预处理方式，使核桃蛋白适度变性，提高了核桃蛋白水解程度，增加了核桃肽得率，提高了制备效率。通过超滤分级，使降血压活性较高的肽段得到富集，使该分子量肽段比例显著增加，纯度提高。本发明方法制备核桃肽具有显著的体内、体外降血压活性，容易吸收，感官品质良好，可广泛地应用到功能食品、保健品、食品添加剂中。
附图说明
图1为本发明核桃降血压肽的质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。
下述实施例中的核桃粕为核桃制油后的剩余物，其蛋白含量为70%—75%，购自北京绿湖工贸公司，也可用螺旋榨油机榨油后收集。
实施例1、核桃降血压肽的制备
将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经超滤分级后脱苦，获得核桃降血压肽；具体步骤如下：
1、核桃蛋白的制备
取质量比为5:100的核桃粕和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5，于55℃下搅拌1.5小时（即进行碱溶），离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至6.5，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白；将所述沉淀用水溶解后，进行冷冻干燥，得到核桃蛋白粉。
2、核桃蛋白的变性（酶解预处理）
将步骤1得到的所述核桃蛋白或核桃蛋白粉配制成浓度为30g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液100W，处理时间为15分钟；在所述超声波处理中，超声波的频率为40kHz，处理时间为50分钟；所述核桃蛋白液在进行所述微波处理时的起始温度为25℃。
3、核桃蛋白的酶解
将经步骤2预处理的核桃蛋白液用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（购自北京奥博兴生物技术有限公司，产品目录编号：01-080）进行酶解；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000U的所述中性蛋白酶进行；所述酶解的温度为45℃；所述酶解的pH值为6.0；所述酶解的时间为2小时；所述酶解的pH值使用1mol/L氢氧化钠溶液调节。
经上述酶解后的酶解液升温至90℃灭酶10分钟，冷却，调pH至4.5，离心去掉未分解蛋白及杂质，取上清液，即核桃肽液。
4、核桃肽的分子量分级
将步骤3得到的核桃肽液依次通过0.45μm微滤膜、8kD再生纤维素膜和1kD再生纤维素膜，收集透过所述1kD再生纤维素膜的核桃肽液，真空冷冻干燥，得到分子量在1kD左右及以下的核桃肽粉。
5、核桃肽的脱苦
将步骤4获得的核桃肽粉配成50g/L的溶液，加入核桃肽粉质量16%的β-环状糊精，45℃下搅拌均匀，包埋处理10min。
6、核桃降血压肽产品的获得
将经步骤5脱苦的核桃肽于-50℃～-45℃冷阱中预冻5小时，于物料隔板温度10℃，真空度为5—30Pa的条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5～10℃，得到核桃降血压肽粉，真空包装得到核桃降血压肽产品。
结果：在本实施例条件下，微波加热及超声波处理后酶解核桃肽得率为65.83%；在核桃肽浓度为1.0mg/mL时，步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽的血管紧张素转换酶（ACE）抑制率由步骤3获得的未分级核桃肽的62.04%提高到77.19%，ACE抑制活性显著提高；步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽经步骤5的包埋后，苦味值由未包埋的5降低到2，ACE抑制率与未包埋的相比降低了2.8%。
上述核桃肽得率的测定方法为三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法，具体如下：
取步骤3的核桃肽液20ml，与10％三氯乙酸（TCA）溶液震荡混合均匀，静置10min，4000rmp/min下离心20min，取上清液进行消化处理,即将液体样品移入干燥的专用消煮管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于管口放一小漏斗，放置在下有电加热的石棉网上加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀，用全自动凯氏定氮仪测定在10％TCA中可溶性氮的含量（记为N1）；取酶解前的核桃蛋白液20ml，进行消化处理，消化方法、步骤同前所述，用全自动凯氏定氮仪测定原料中的总氮含量（记为N0），根据公式TCA-NSI＝（N1/N0）×100%，计算得到核桃肽得率。
上述血管紧张素转换酶（ACE）抑制率的测定方法如下：
取步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽冷冻干燥，用超纯水配制成一定浓度，旋涡振荡混匀后作为待测液进行ACE抑制率的测定；或取步骤3获得的酶解液作为待测液进行ACE抑制率的测定：
1）将HHL溶解于含0.3mol/L氯化钠的硼酸盐缓冲液(0.1mol／L，pH8.3)中，得到浓度为5mmol/L的HHL溶液；
2）在2mL刻度离心管中依次加入80μL的5mmol/L的HHL溶液、100μL去离子水和10μL待测液，将此混合液放入37℃恒温水浴中保温3min，然后加入10μL(0.1U/mL)ACE酶液，开始反应。恒温保持30min，加入0.2mL的HCl(1mol/L)，中止反应，再加入1.2mL冷(-20℃)的乙酸乙酯，均匀混合大约15s，萃取被ACE所释放的马尿酸，3500r/min离心5min，将乙酸乙酯转入另一刻度试管中，在120℃的烘箱中烘干，重新溶于去离子水中，在228nm处测定吸光值。空白对照管除在反应前先加入0.2mL的HC1(1mol/L)中止反应外，其余操作相同。抑制率计算公式如下：
抑制率=（ODA－ODB）/（ODA－ODC）×100%
其中：ODA代表不存在抑制剂(即待测液)时的吸光值(用超纯水代替待测液)；ODB代表存在抑制剂(待测液)与酶(ACE)时的吸光值；ODC代表抑制剂(待测液)与酶(ACE)都不存在时的吸光值(用超纯水代替待测液，并在反应前加盐酸中止反应)。
上述苦味值的感官评定标准如下：
将酶解后未经脱苦处理的核桃肽液分别配制成20%、40%、60%、80%、100%的浓度，将其苦味值分别定义为1-无苦味，2-略有苦味，3-苦味较弱，4-苦味一般，5-苦味较重。根据此评分标准，将脱苦的核桃肽液提供给10名感官评定者，与标准未脱苦的核桃肽液比较进行评分，最后得出平均值来表示苦味程度。
实施例2、制备核桃降血压肽
将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经超滤分级后脱苦，获得核桃降血压肽；具体步骤如下：
1、核桃蛋白的制备
取质量比为8:100的核桃粕和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至8.0，于55℃下搅拌2小时（即进行碱溶），离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至5.0，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白；将所述沉淀用水溶解后，进行冷冻干燥，得到核桃蛋白粉。
2、核桃蛋白的变性（酶解预处理）
将步骤1得到的所述核桃蛋白或核桃蛋白粉配制成浓度为80g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液500W，处理时间为12分钟；在所述超声波处理中，超声波的频率为50kHz，处理时间为30分钟；核桃蛋白液在进行所述微波处理时的起始温度为25℃。
3、核桃蛋白的酶解
将经步骤2预处理的核桃蛋白液用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（购自北京奥博兴生物技术有限公司，产品目录编号：01-080）进行酶解；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用2000U的所述中性蛋白酶进行；所述酶解的温度为55℃；所述酶解的pH值为6.4；所述酶解的时间为4小时；所述酶解的pH值使用1mol/L氢氧化钠溶液调节。
经上述酶解后的酶解液升温至90℃灭酶10分钟，冷却，调pH至4.5，离心去掉未分解蛋白及杂质，取上清液，即核桃肽液。
4、核桃肽的分子量分级
将步骤3得到的核桃肽液依次通过0.45μm微滤膜、8kD再生纤维素膜和1kD再生纤维素膜，收集透过所述1kD再生纤维素膜的核桃肽液，真空冷冻干燥，得到分子量在1kD左右及以下的核桃肽粉。
5、核桃肽的脱苦
对步骤4获得的核桃肽粉配成80g/L的溶液，加入核桃肽粉质量18%的β-环状糊精，60℃下搅拌均匀，包埋处理15分钟。
6、核桃降血压肽产品的获得
将经步骤5脱苦的核桃肽于-50℃～-45℃冷阱中预冻5小时，于物料隔板温度10℃，真空度为5—30Pa的条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5～10℃，得到核桃降血压肽粉，真空包装得到核桃降血压肽产品。
结果：在本实施例条件下，微波加热及超声波处理后酶解核桃肽得率明显提高，为77.15%；步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽对ACE抑制率由步骤3获得的未分级核桃肽的72.04%提高到78.19%，ACE抑制活性显著提高；步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽经步骤5的包埋后，苦味值由未包埋的5降低到3，ACE抑制率与未包埋的相比降低了2.5%。
实施例3、制备核桃降血压肽
将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经超滤分级后脱苦，获得核桃降血压肽；具体步骤如下：
1、核桃蛋白的制备
取质量比为10:100的核桃粕和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.9mol/L的NaOH溶液调pH值至8.4，于55℃下搅拌1.5小时（即进行碱溶），离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至4.6，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白；将所述沉淀用水溶解后，进行冷冻干燥，得到核桃蛋白粉。
2、酶解预处理（蛋白变性）
将步骤1得到的所述核桃蛋白或核桃蛋白粉配制成浓度为50g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液1000W，处理时间为10分钟；在所述超声波处理中，超声波的频率为60kHz，处理时间为20分钟；核桃蛋白液在进行所述微波处理时的起始温度为25℃。
3、核桃蛋白的酶解
将经步骤2预处理的核桃蛋白液用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（购自北京奥博兴生物技术有限公司，产品目录编号：01-080）进行酶解；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1500U的所述中性蛋白酶进行；所述酶解的温度为48℃；所述酶解的pH值为6.8；所述酶解的时间为3小时；所述酶解的pH值使用1mol/L氢氧化钠溶液调节。
经上述酶解后的酶解液升温至90℃灭酶10分钟，冷却，调pH至4.5，离心去掉未分解蛋白及杂质，取上清液，即核桃肽液。
4、核桃肽的分子量分级
将步骤3得到的核桃肽液依次通过0.45μm微滤膜、8kD再生纤维素膜和1kD再生纤维素膜，收集透过所述1kD再生纤维素膜的核桃肽液，真空冷冻干燥，得到分子量在1kD左右及以下的核桃肽粉。
5、核桃肽的脱苦
将步骤4获得的核桃肽粉配成20g/L的溶液，加入核桃肽粉质量20%的β-环状糊精，50℃下搅拌均匀，包埋处理20min。
6、核桃降血压肽产品的获得
将经步骤5脱苦的核桃肽于-50℃～-45℃冷阱中预冻5小时，于物料隔板温度10℃，真空度为5—30Pa的条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5～10℃，得到核桃降血压肽粉，真空包装得到核桃降血压肽产品。
结果：在本实施例条件下，微波加热及超声波处理后酶解核桃肽得率明显提高，为87.15%；步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽对ACE抑制率由步骤3获得的未分级核桃肽的75.04%提高到84.26%，ACE抑制活性显著提高；步骤4获得的透过1kD超滤膜的核桃肽经步骤5的包埋后，苦味值由未包埋的5降低到2，ACE抑制率与未包埋的相比降低了1.5%。
实施例4、实施例1-3核桃降血压肽的组成测定
实施例1—3获得的核桃降血压肽粉呈浅黄色粉末到颗粒状。实施例3获得的核桃降血压肽粉经高效液相色谱法检测其肽分子量在300Da—1200Da之间，经氨基酸自动分析仪检测其氨基酸组成如表1所示，其中，精氨酸摩尔百分比为14.72%，谷氨酸摩尔百分比为17.29%；实施例3获得的核桃降血压肽粉经多肽质谱检测，获得的质谱图如图1所示，质谱峰情况如表2所示。实施例1和2获得的核桃降血压肽粉的肽分子量、氨基酸组成和多肽质谱检测结果与实施例3的结果无显著差异。
上述分子量分布测定方法和条件具体如下：
采用高效液相色谱（HPLC）对待测物质的分子量分布进行测定，检测条件为：色谱柱：TSKgel2000SWXL（300×7.8mm）；流动相：乙腈:水:三氟乙酸=45:55:0.1（V/V）；流速：0.5mL/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；标准分子量分别为细胞色素C（MW12500）、杆菌酶（MW1450）、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（MW451）、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（MW189）。
上述氨基酸组成测定具体如下：
精确称量一定量样品于水解管中，加入定量6mol/L HCl，抽真空，110℃下水解24h，冷却。将水解液定容、过滤，取滤液1mL，氮吹干燥后加入0.02mol/L HCl。采用Ag1100氨基酸专用高效液相色谱仪进行分析。
上述多肽质谱分析方法和条件具体如下：
采用正离子电喷雾质谱(ESI-MS)（Agilent6520MS），离子源：Dual ESI；气体温度：350℃；气体流速9L/min；喷雾器压力：35psi；流动相：乙腈:0.1%甲酸溶液=6:4条件下进行多肽质谱检测。
表1、核桃降血压肽的氨基酸组成
表2核桃降血压肽质谱峰情况
实施例5、实施例1—3获得的核桃降血压肽的体内降血压活性测定
一、一次给药对原发性高血压大鼠的影响
取48只清洁级、鼠龄10周、体重为120士10g的雌性原发性高血压大鼠(简称SHR，购自北京维通利华公司)，分别单笼饲养，自由进食进水，在每日12h光照，环境温度(25士1)℃，相对湿度(60士5)%条件下适应环境7天后，开始试验。每日以尾脉搏法测定SHR的血压，进行测压训练。根据所测定的基础血压及体重大小，按随机区组设计分成6组，每组8只。对所述6组SHR大鼠分别一次灌胃给药，每组给药的药物成分和剂量如下（给药前先将药物溶于蒸馏水中）：
1）空白对照组（CK）：同体积的蒸馏水；
2）阳性对照组：卡托普利50mg/kg bw（体重）；
3）剂量组Ⅰ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉900mg/kg bw；
4）剂量组Ⅱ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉300mg/kg bw；
5）剂量组Ⅲ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉150mg/kg bw；
6）剂量组Ⅳ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉50mg/kg bw。
分别于灌胃后的第0、2、4、8、12、16、20、24h时测定SHR大鼠尾动脉收缩压(SBP)，同时记录大鼠心率。测定前先将大鼠在40℃的电热板上预热10min。然后进行血压和心率的测定。共测定15次，每次间隔6秒，结果取平均值，如表3和表4所示。
表3、实施例1—3获得的核桃降血压肽粉一次给药对SHR大鼠SBP的影响
注：表3中同一行结果（即同一时间不同处理的结果）后若不含有相同的小写字母，表示两个结果在p＜0.05差异显著；若不含有相同的大写字母，则表示两个结果在p＜0.01差异极显著。
表4、实施例1—3获得的核桃降血压肽粉对SHR心率的影响
二、多次给药对原发性高血压大鼠的影响
取40只清洁级、鼠龄10周、体重为120士10g的雌性原发性高血压大鼠(简称SHR，购自北京维通利华公司)，分别单笼饲养，自由进食进水，在每日12h光照，环境温度(25士1)℃，相对湿度(60士5)%条件下适应环境7天后，开始试验。每日以尾脉搏法测定SHR的血压，进行测压训练。根据所测定的基础血压及体重大小，按随机区组设计分成5组，每组8只。每天对该5组SHR大鼠分别一次灌胃给药，每组每次给药的药物成分和剂量如下（给药前先将药物溶于蒸馏水中）：
1）空白对照组（CK）：同体积的蒸馏水；
2）阳性对照组：卡托普利50mg/kg bw（体重）；
3）剂量组Ⅰ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉900mg/kg bw；
4）剂量组Ⅱ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉300mg/kg bw；
5）剂量组Ⅲ：实施例1—3获得的核桃降血压肽粉150mg/kg bw；
分别于试验开始后的第0、3、9、15、21、27天时测定SHR大鼠尾动脉收缩压(SBP)。测定前先将大鼠在40℃的电热板上预热10min。然后进行血压的测定。共测定15次，每次间隔6秒，结果取平均值，如表5所示。
表5、实施例1—3获得的核桃降血压肽粉多次给药对SHR大鼠SBP的影响
注：表5中同一行结果（即同一时间不同处理的结果）后若不含有相同的小写字母，表示两个结果在p＜0.05差异显著；若不含有相同的大写字母，则表示两个结果在p＜0.01差异极显著。
实施例5的上述结果表明，对SHR大鼠分别一次给药实施例1—3获得的核桃降血压肽粉50mg/kg、150mg/kg、300mg/kg、900mg/kg，SHR大鼠的SBP最多分别降低了11mmHg、16mmHg、16mmHg，22mmHg，且对SHR大鼠的心率无影响。对SHR大鼠分别多次给药实施例1—3获得的核桃降血压肽粉，以每天150mg/kg、300mg/kg、900mg/kg剂量喂养的SHR大鼠在9天后，SBP与空白对照组相比有极显著降低（p＜0.01），300mg/kg以上剂量喂养的SHR大鼠在21天后，SBP与空白对照相比有显著降低（p＜0.05）。这说明实施例1—3获得的核桃降血压肽粉具有降血压活性。
Claims (9)
1.一种核桃降血压活性肽的制备方法，包括如下步骤：
将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经分子量分级后脱苦，获得核桃降血压活性肽；
所述变性按照包括如下步骤的方法进行：将所述核桃蛋白配制成浓度为30—80g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液100—1000W，处理时间为10—15分钟；在所述超声波处理中，超声波的频率为40—60kHz，处理时间为20—50分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述蛋白酶为中性蛋白酶；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000—2000U的所述蛋白酶进行；所述酶解的温度为45℃—55℃；所述酶解的pH值为6.0—6.8；所述酶解的时间为2—4小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。
4.根据权利要求1—3中任一所述的方法，其特征在于：
所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行：将所述核桃肽依次通过0.45μm微滤膜、8kD超滤膜和1kD超滤膜，收集透过所述1kD超滤膜的核桃肽。
5.根据权利要求1—4中任一所述的方法，其特征在于：所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行：45℃—60℃条件下，将所述透过所述1kD超滤膜的核桃肽与β-环状糊精以100:(16—20）的质量比混合包埋处理10—20分钟；所述混合包埋的体系中所述透过所述1kD超滤膜的核桃肽的浓度为20—80g/L。
6.根据权利要求1—5中任一所述的方法，其特征在于：所述核桃蛋白按照包括如下步骤的方法制备：取质量比为（5—10）:100的核桃粕和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.1—0.9mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5—8.4，于55℃下搅拌1.5—2小时，离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至4.6—6.5，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白。
7.根据权利要求1—6中任一所述的方法，其特征在于：所述脱苦后还包括将所述脱苦后的产物进行真空冷冻干燥的步骤；
所述真空冷冻干燥按照包括如下步骤的方法进行：将所述脱苦后的产物于-50℃～-45℃条件下预冻5小时后，于物料隔板温度10℃，真空度为5—30Pa条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5℃～10℃，得到粉状的所述核桃降血压活性肽。
8.权利要求1-7中任一所述方法制备得到的核桃降血压活性肽。
9.权利要求8所述核桃降血压活性肽在制备降血压产品中的应用。
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