CN104561205A - 一种制备枸杞ace抑制肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其是以枸杞为原料，经研磨成粉加超纯水成枸杞溶液，进行离心处理后得枸杞粗蛋白，然后加超纯水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶进行酶解制得枸杞ACE抑制肽，并优化实验条件及对其进行ACE抑制肽的活性测定。采用本发明的方法制备的枸杞ACE抑制肽活性强，经实验测定其活性可达99.03%，能够有效地起到降压作用，可同时发挥出营养和保健两方面的作用，因此，有望为开发无毒副作用的降压功能新药物提供有效成分。
Description
技术领域：
本发明属于ACE抑制肽制备方法，特别涉及一种制备枸杞ACE抑制肽的方法。
背景技术：
血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzy me,简称ACE)是使血压升高的一个关键酶。一方面，它可催化不具有活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有强烈收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ；另一方面，它能降解具有舒张血管作用的舒缓激肽并导致其失活。因此，通过抑制ACE的活性就可达到预防和治疗高血压的目的。已知通过对多种来源的蛋白进行蛋白水解消化可获得ACE抑制肽，该蛋白的来源包括鱼、动物奶蛋白以及植物。多数所描述的用于从植物蛋白中获得ACE抑制肽的方法在水解之前均包括对所述蛋白进行初步纯化的步骤，其增加了所述方法的成本和复杂性并因此增加了产品的成本。因此，仍需要从植物材料中制备ACE抑制剂组合物的改进方法和高特异活性的ACE抑制肽的其它来源。
目前，人们已从食品蛋白质中获得了各种功能性肽，如促钙吸收肽、ACE抑制肽、免疫调节肽等。ACE抑制肽因其无毒副作用的降压功能成为活性肽研究的热点，《食品科技》2009年第34卷第4期，任清等著《荞麦蛋白的提取及其酶解产物ACE抑制活性的研究》中提到过类似方法，该文中提出以荞麦粉为原料，采用碱提酸沉法提取荞麦蛋白。通过正交实验优化了最佳蛋白提取工艺：温度50℃，pH=11，时间3h，蛋白的提取率可达44.2%，由碱性蛋白酶、中性蛋白酶及复合蛋白酶共同水解所获得的产物ACE抑制肽活性可达90.55%。
枸杞是茄目茄科枸杞属（Lycium）的植物，果实称枸杞子，嫩叶称枸杞头，常见种类为枸杞(Lycium chinense Miller)，主要的药用种类为宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)。宁夏枸杞是宁夏地区的五宝之一，其作为名贵的药材和滋补品，中医很早就有“枸杞养生”的说法，《本草纲目》中有记载：“枸杞，补肾生精，养肝……明目安神，令人长寿。”因其具有降低血糖、 抗脂肪肝作用，并能抗动脉粥样硬化等药食同源的功效，申请人结合现有技术的研究方法，经过分析对比，建立从枸杞中提取ACE抑制肽的方法并优化实验条件，最终测得ACE抑制肽的活性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，即建立从枸杞中提取ACE抑制肽的方法并优化实验条件，并对其进行ACE抑制肽的活性测定。
为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，是以枸杞为原料，经研磨成粉加超纯水成枸杞溶液，进行离心处理后得枸杞粗蛋白，然后加超纯水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶进行酶解制得枸杞ACE抑制肽，包括以下步骤：
S1：将枸杞研磨成枸杞粉，过80目筛网，并称取枸杞粉于烧杯中，按1:80的质量比加入超纯水，搅拌至完全溶解，然后用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8.5得枸杞溶液；
S2：将上述枸杞溶液在40℃条件下水浴搅拌4h后，于4℃，6000r/min条件下离心处理，取上清液，用1mol/L HCl溶液调解等电点至pH=4.0，静置；
S3：在4℃，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白;
S4：取上述干燥后的枸杞粗蛋白，按1:20的质量比加入超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶液，然后加入中性蛋白酶，在温度45℃，pH=7条件下连续酶解4h，然后迅速冷却至40℃，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4；
S5：将上述酶解处理后的枸杞蛋白溶液在4℃，6000r/min条件下离心处理，并取上清液，即得枸杞ACE抑制肽。
S6：用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰)-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG）作为ACE抑制肽的底物，测定4个时间段肽组分的抑制肽活性。
上述加入的中性蛋白酶与枸杞蛋白的质量比为1:50。
上述连续酶解过程是每隔1h取酶解液20ml，于90℃水浴中进行灭酶15min。
上述测定枸杞ACE抑制肽的活性是在酶标定量仪中340nm波长条件下，先测出空白孔、样品孔的初始吸光度，然后在37℃环境下孵育30min后再一次测定吸光度，根据I=（空白吸光度减少值-样品吸光度减少值）/空白吸光度减少值，算出其抑制率。
本发明的有益效果：采用本发明的方法制备的枸杞ACE抑制肽活性强，经实验测定其活性可达99.03%，能够有效地起到降压作用，可同时发挥出营养和保健两方面的作用，因此，有望为开发无毒副作用的降压功能新药物提供有效成分。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
将枸杞研磨成粉，过80目筛，称取50g于烧杯，加入400ml超纯水，搅拌至完全溶解得枸杞溶液；用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8.5，在40℃条件下水浴搅拌4h后，在4℃，6000r/min条件下离心，取上清液，用1mol/L HCl溶液调解等电点至pH=4.0，静置；在4℃，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取5g干燥后的枸杞粗蛋白，用超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶液100g，根据加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0.1g，在温度45℃，pH=7条件下连续酶解4小时，每隔1h取酶解液20ml，90℃水浴15min灭酶，迅速冷却至40℃，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4；在4℃，6000r/min条件下离心并取上清液即得枸杞ACE抑制肽。
实施例2
将枸杞研磨成粉，过80目筛，称取25g于烧杯，加入200ml超纯水，搅拌至完全溶解得枸杞溶液；用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8.5，在40℃条件下水浴搅拌4h后，在4℃，6000r/min条件下离心，取上清液，用1mol/L HCl溶液调解等电点至pH=4.0，静置；在4℃，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取2.5g干燥后的枸杞粗蛋白，用超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶液50g，根据加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0.05g，在温度45℃，pH=7条件下连续酶解4小时，每隔1h取酶解液20ml，90℃水浴15min灭酶，迅速冷却至40℃，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4；在4℃，6000r/min条件下离心并取上清液即得枸杞ACE抑制肽。
实施例3
将枸杞研磨成粉，过80目筛，称取100g于烧杯，加入800ml超纯水，搅拌至完全溶解得枸杞溶液；用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8.5，在40℃条件下水浴搅拌4h后，在4℃，6000r/min条件下离心，取上清液，用1mol/L HCl溶液调解等电点至pH=4.0，静置；在4℃，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取10g干燥后的枸杞粗蛋白，用超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶液200g，根据加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0.2g，在温度45℃，pH=7条件下连续酶解4小时，每隔1h取酶解液20ml，90℃水浴15min灭酶，迅速冷却至40℃，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4；在4℃，6000r/min条件下离心并取上清液即得枸杞ACE抑制肽。
测定采用上述方法制备的枸杞ACE抑制肽的活性，在酶标定量仪中340nm波长条件下，先测出空白孔、样品孔的初始吸光度，然后在37℃环境下孵育30min后再一次测定吸光度，根据I=（空白吸光度减少值-样品吸光度减少值）/空白吸光度减少值，算出其抑制率。其中，枸杞ACE抑制肽的活性测定受到时间，底物浓度和加酶量三个因素的影响，用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰)-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG）作为ACE抑制肽的底物，对此选用L9（33）正交设计表对上述时间，底物浓度和加酶量三个因素进行正交实验，建立从枸杞中提取ACE抑制肽的方法并优化实验条件，各因素及水平的设计见表1：
表1 L9（33）正交实验因素水平
按照上述表1正交实验的各种配方进行实验后，根据各项数据可以得到正交实验的结果并进行数据分析，则正交实验评分结果见表2：
表2 L9（33）正交实验结果
由表2极差分析可知，影响枸杞ACE抑制肽抑制率的主次因素为时间>加酶量>底物浓度，即A >C >B，因此可以得到结论，枸杞ACE抑制肽能得到最高抑制率的条件是A2B3C1，即时间3小时，底物浓度20%，加酶量1%。
由表2实验结果分析可知，抑制率均值是95.0171，标准差是3.07554，进行离散程度分析，最终得出结论：枸杞ACE抑制肽活性最高值可达99.03%。
Claims (4)
1.一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：以枸杞为原料，经研磨成粉加超纯水成枸杞溶液，进行离心处理后得枸杞粗蛋白，然后加超纯水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶进行酶解制得枸杞ACE抑制肽，包括以下步骤：
S1：将枸杞研磨成枸杞粉，过80目筛网，并称取枸杞粉于烧杯中，按1:80的质量比加入超纯水，搅拌至完全溶解，然后用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8.5得枸杞溶液；
S2：将上述枸杞溶液在40℃条件下水浴搅拌4h后，于4℃，6000r/min条件下离心处理，取上清液，用1mol/L HCl溶液调解等电点至pH=4.0，静置；
S3：在4℃，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白;
S4：取上述干燥后的枸杞粗蛋白，按1:20的质量比加入超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶液，然后加入中性蛋白酶，在温度45℃，pH=7条件下连续酶解4h，然后迅速冷却至40℃，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4；
S5：将上述酶解处理后的枸杞蛋白溶液在4℃，6000r/min条件下离心处理，并取上清液，即得枸杞ACE抑制肽;
S6：用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰)-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG）作为ACE抑制肽的底物，测定4个时间段肽组分的抑制肽活性。
2.根据权利要求1所述的一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述加入的中性蛋白酶与枸杞蛋白的质量比为1:50。
3.根据权利要求1所述的一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述连续酶解过程是每隔1h取酶解液20ml，于90℃水浴中进行灭酶15min。
4.根据权利要求1所述的一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述测定枸杞ACE抑制肽的活性是在酶标定量仪中340nm波长条件下，先测出空白孔、样品孔的初始吸光度，然后在37℃环境下孵育30min后再一次测定吸光度，根据I=（空白吸光度减少值-样品吸光度减少值）/空白吸光度减少值，算出其抑制率。
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