CN103275177A - 具有肾素和ace双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用，涉及生物技术领域。所述小肽序列为Gly-His-Ser。该小肽的制备方法：将菜籽粕粉碎，分散于水中，调节pH为10.5-11.5，搅拌，离心后取上清液为菜籽蛋白粗提液；调节菜籽蛋白粗提液的pH为4-5，静置后离心取沉淀，用胃蛋白酶和胰酶水解后，分离出分子量小于2.5-3.5kDa的菜籽蛋白水解物，采用凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。本发明小肽，具有较好的肾素和ACE双重抑制活性和较好的降血压效果，可以用于制备药物或者降血压功能食品。本发明小肽的制备方法简单，由于原料来源于菜籽粕，所以对人体安全。

Description

具有肾素和 ACE 双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用。

背景技术

肾素-血管紧张素系统（RAS）对机体血压和体液平衡的调节具有重要作用，RAS系统失衡会导致机体血压升高，进而导致相关慢性疾病如心脑血管疾病、慢性肾病和糖尿病等发病率的升高。抑制RAS系统中的2个关键水解酶肾素和血管紧张素转化酶-

（ACE），能够有效阻断RAS系统。另一方面，临床研究发现，长期使用ACE抑制剂例如卡托普利（Captopril）还会导致血管紧张素-

（Ang-I）的堆积，激活旁路途径，将大量Ang-I重新转化成血管紧张素-Ⅱ（Ang-Ⅱ），发生‘Ang-Ⅱ逃逸’的现象，严重影响高血压病的治疗。近年来，新研制的肾素抑制剂阿利吉仑在临床应用中表现出了较好的降血压效果和对相关机体组织的保护作用，然而也存在头晕、头痛等不良反应。鉴于单独使用ACE抑制剂和肾素抑制剂中存在的问题，研究人员尝试联合使用不同功能的抑制剂，发现联合肾素抑制剂和ACE抑制剂，不仅可以降低机体血压，还有助于减少

-型糖尿病患者肾功能的损伤。但是，现有技术中缺少同时具有肾素和ACE双重抑制活性的物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽。

本发明的另一目的是提供具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽的制备方法，该方法简单，由于原料来源于菜籽粕，所以对人体安全。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽，氨基酸序列为Gly-His-Ser。

一种所述小肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）将菜籽粕粉碎，分散于蒸馏水中，用碱液调节pH值为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌1-2 h，离心后分离上清液和沉淀，所述上清液为菜籽蛋白粗提液，所述沉淀为残渣；调节所述菜籽蛋白粗提液的pH值为4-5，静置后离心取沉淀，即得菜籽蛋白粗提物；

（2）将所述菜籽蛋白粗提物用胃蛋白酶和胰酶水解后，分离出分子量小于2.5-3.5 kDa的菜籽蛋白水解物；

（3）将所述分子量小于2.5-3.5 kDa的菜籽蛋白水解物采用凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。

将步骤（1）中所述残渣分散于蒸馏水中，用碱液调节pH 为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌，离心后取上清液，所述上清液为菜籽蛋白粗提液。

步骤（2）所述水解的具体方法为：将菜籽蛋白粗提物冷冻干燥后溶于水，调节pH为1.5-2.5，加入胃蛋白酶，在36.5-37.5℃条件下进行水解反应；反应结束后，调节溶液pH至7.0-8.0，加入胰酶进行水解反应。

步骤（3）中采用凝胶过滤色谱分离时，收集分子量范围为270-700 Da的活性成分。

所述凝胶过滤色谱分离的方法为：凝胶柱为Hiload 26/600 Superdex 30 Prep grade，流动相为含有0.1-0.15 M NaCl、浓度为40-60 mM的磷酸缓冲液，pH 7-7.5；取对应于保留体积为275-295 mL时的洗脱液，即得分子量为270-700 Da的活性成分。

将所述分子量为270-700Da的活性成分采用反相高效液相色谱分离的具体方法为：

（1）将所述分子量为270-700 Da的活性成分采用Jupiter C12色谱柱进行分离，收集对应于流动相B的体积浓度为27.5-30%时的洗脱液（F3-C）；洗脱程序为：0～60 min，流动相A 95～20%线性降低，流动相B 5～80%线性升高；

（2）将洗脱液F3-C冷冻干燥后采用Vydac C18色谱柱分离，收集对应于流动相B体积浓度为27.3-27.4%时的洗脱液（F3-C-），冷冻干燥后得到所述小肽；洗脱程序为：0～30 min ，流动相A 75～65%线性降低，流动相B 25-35%线性升高；

所述流动相A为质量百分浓度为0.05-0.15%三氟乙酸的水溶液，所述流动相B为质量百分浓度为0.05-0.15%三氟乙酸的甲醇溶液；

一种所述具有肾素和ACE抑制活性的小肽在制备降血压药物或具有降血压功能的食品中的应用。

一种降血压药物组合物，含有氨基酸序列为Gly-His-Ser的小肽。

一种具有降血压功能的食品，含有氨基酸序列为Gly-His-Ser的小肽。

有益效果：

本发明提供的小肽，具有较好的肾素和ACE双重抑制活性，较好的降血压效果，反应出较好的体内、体外活性的一致性。其原因可能是抑制了RAS系统中的2个关键酶肾素和ACE的活性。该小肽来源于食物源蛋白肽，与降血压药物相比，具有更好的安全性，可以作为药物使用，或者作为降血压营养添加剂用于与降血压相关的功能食品和保健品的开发。本发明小肽的制备方法简单，由于原料来源于菜籽粕，所以对人体安全。

附图说明

图1 分子量小于3 kDa 的菜籽蛋白水解物的凝胶过滤色谱图。

图2经凝胶过滤色谱分离后得到各洗脱液中活性成分的ACE和肾素抑制活性，样品测试浓度为1 mg/mL。

图3 Jupiter C12柱分离洗脱液F3中活性成分得到的色谱图。

图4 Jupiter C12柱分离得到的各洗脱液中活性成分的ACE和肾素抑制活性，样品测试浓度为0.5 mg/mL。

图5 洗脱液F3-C中活性成分采用Vydac C18柱分离得到的色谱图

图6 洗脱液F3−C−

中活性成分的二级质谱图。

图7不同浓度下GHS抑制ACE和肾素的莱恩威佛-伯克双倒数图，其中图7（a）为小肽GHS抑制ACE的莱恩威佛-伯克双倒数图；图7（b），小肽GHS抑制ACE的莱恩威佛-伯克双倒数图。

图8各物质降低自发性高血压大鼠血压的效果（其中Saline为空白对照组，Captopril为卡托普利灌胃组， GHS为小肽GHS灌胃组，﹤3 KD为分子量小于3 KD的菜籽蛋白水解物灌胃组）。

具体实施方式

1.材料：菜籽粕（Brassica napus），东海粮油工业有限公司；牛血清白蛋白、细胞色素C、抑肽酶、维生素B12、胃蛋白酶（Pepsin）、胰酶（Pancreatin）、血管紧张素转化酶（ACE）、N-[(2S,3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯丁酰]-L-亮氨酸（FAPGG），Sigma公司；肾素活性测定试剂盒，美国Cayman chemical公司；凝胶柱（Hiload 26/600 Superdex 30 Prep grade，600×26 mm）， 美国通用公司；Jupiter C12 制备型色谱柱（250 × 21.10 mm, 5 µm），美国Phenomenex；Vydac C18 protein & peptide 分析柱（4.6 × 250 mm, 5 µm），美国VYDAC； Eclipse Plus C18 RRHD 色谱柱（2.1 x 100 mm, 1.8 μm）美国 ZORBAX；超滤膜、96-孔板和其他所用化学试剂，美国 Fisher公司。

2.主要仪器与设备：RET磁力搅拌器 ，德国IKA公司；FE20K pH 酸度计，瑞士梅特勒-托利多；llegra64R高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特；荧光酶标仪，美国 Spectra MAX Gemini；Cary 4000 紫外可见光分光光度计，美国瓦里安；AKTA purify10蛋白质纯化仪，美国通用公司；Varian 940半制备高效液相色谱仪，美国瓦利安；Stirred Cell 8010超滤装置，美国Millipore；IITC RMA 253动物血压计，美国 ‏Life Science (IITC)；ACQUITY超高效液相色谱，美国Waters；Micromass四级杆质谱，美国Waters。

3.ACE抑制活性检测方法如下:在比色杯中加入1 mL 0.5 mM FAPGG (溶解在含 0.3 M NaCl、浓度为 50 mM 的Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5) ，20 μL ACE (1U/mL, 最终活力 20 mU) ，200 μL样品（蛋白质浓度为1mg/mL，溶剂为50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.3 M NaCl, pH 7.5），混匀；室温下（18～25 ℃），2 min内测定345 nm下吸光值的降低速率.空白以 Tris–HCl 缓冲液代替样品. 根据以下公式计算ACE抑制活性：

ACE抑制率（%）=1-[ΔA·min^-1(样品)/ ΔA·min^-1(空白)]×100%,

其中，ΔA·min^-1(样品)和ΔA·min^-1(空白)分别是表示样品和空白的ACE活性变化速率。

小肽GHS对ACE的IC₅₀（抑制50% ACE活性时的样品浓度）测定：分别测试样品（小肽GHS）中蛋白浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/mL时对ACE抑制活性，采用非线性回归计算其IC₅₀值。

4.肾素抑制活性的检测方法如下:样品抑制肾素活性的体外测定根据肾素活性试剂盒(购买于Cayman Chemical，编号10006270)提供方法，按以下步骤测定：96-孔板中依次加入(1) 空白孔：20 μL 底物, 160 μL 测试用缓冲液, 10 μL 纯水；（2）空白对照孔：20 μL 底物, 150 μL 测试用缓冲液, 和10 μL 纯水；(3)样品孔：20 μL 底物, 150 μL 测试用缓冲液, 10 μL蛋白浓度已经调整至1mg/mL的样品。之后分别在每个孔（除空白孔外）中加入10 μL肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10 s ，在37 ^oC下预热15 min ，在10min内测定样品的荧光强度，激发波长340nm, 发射波长490nm，根据以下公式计算样品的肾素抑制活性：肾素抑制率（%）=1-[ΔFI·min^-1(样品孔)/ΔFI·min^-1(空白对照孔)]×100% ，其中，ΔFI·min^-1(样品孔)和ΔFI·min^-1(空白对照孔) 分别是表示样品孔和空白对照孔的肾素活性变化速率。

测试用缓冲液：50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.1 M NaCl，pH 8.0 。

小肽GHS对肾素的IC₅₀（抑制50%肾素活性时的样品浓度）测定：分别测试样品（小肽GHS）中蛋白浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5，1.0 mg/mL时对肾素的抑制活性，采用非线性回归计算其IC₅₀值。

实施例 1 小肽的制备

1. 菜籽蛋白水解物的制备

采用碱溶酸沉方法制备菜籽蛋白：将菜籽粕粉碎、过80目筛，分散于10倍重量的蒸馏水中，用1M NaOH 调节pH 为11.0，并维持pH不变，室温搅拌2 h 后 ，8000 g 力离心分离上清液和沉淀，收集上清液为菜籽蛋白粗提液，沉淀为残渣；在所述残渣中加入其重量5倍的蒸馏水，用1M NaOH 调节pH 为11.0，并维持pH不变，室温搅拌2 h 后 ，8000 g 力离心分离上清液和沉淀，收集上清液为菜籽蛋白粗提液。合并上述菜籽蛋白粗提液，用1M HCl 调节pH至4.5，静置2 h后离心，取沉淀得到菜籽蛋白粗提物。在菜籽蛋白粗提物中加入少量蒸馏水，搅匀，调节pH 为7.0后，冷冻干燥，得到菜籽蛋白粗品（蛋白质含量为85.2%）。将菜籽蛋白粗品溶解于蒸馏水中，调节蛋白浓度至50g/L，pH 2.0，温度37 ℃，搅拌1 h后，加入菜籽蛋白粗品中蛋白质重量4%的胃蛋白酶水解2h，再调节pH值为7.5，然后加入蛋白质重量4%的胰酶继续水解4 h。水解过程中通过滴加1 mol/L的HCl和NaOH 保持反应溶液的pH恒定。水解反应结束后，将水解物加热至90 ℃保温 10min灭酶，冰水浴快速冷却后以8000×g力离心1 h，取上清液作为菜籽蛋白水解物。

菜籽蛋白水解物经截留分子量为3 kDa的超滤膜超滤后，取透过液（分子量小于3 kDa）冷冻干燥后用于分离纯化。采用lorry 法测定其蛋白质含量。将分子量小于3 kDa的菜籽蛋白水解物调整蛋白浓度至1 mg/mL，测定其ACE和肾素的抑制活性，分别为61.52 ± 1.77% 和42.06 ± 1.32%。

2. 分子量小于3 kDa 菜籽蛋白水解物的分离和纯化

将分子量小于3 kDa的菜籽蛋白水解物溶解于50 mM的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2，含有0.15 M NaCl）中，使蛋白浓度为10 mg/mL。应用配有自动收集器和Hiload 26/600 Superdex 30 Prep grade制备型凝胶柱的蛋白质纯化仪对分子量小于3 kDa的菜籽蛋白水解物进行初步纯化，进样体积为5 mL，等度洗脱流速为3 mL/min，流动相为含有0.15 M NaCl、浓度为50 mM的磷酸盐缓冲溶液，pH 7.2。分子量标准品牛血清白蛋白（66,000 Da）、细胞色素C（12,384 Da）、抑肽酶（6,512 Da）和维生素B12（1,855 Da）用于绘制该色谱柱标准曲线。分子量小于3 kDa 的菜籽蛋白水解物经凝胶过滤色谱分离后，得到6份洗脱液F1-F6，如图1所示。其中，洗脱液F3中活性成分的分子量范围为270-700 Da，洗脱液F3对应的保留体积为275-295 mL、保留时间为91.7-98.3min。将各洗脱液，分别用截留分子量100 Da的透析袋透析脱盐、冷冻干燥后制得冻干粉，分析各洗脱液中活性成分的肾素和ACE抑制活性，如图2所示。检测过程中各样品的蛋白浓度调节至1 mg/mL，洗脱液F3中活性成分具有较高的ACE和肾素抑制活性，抑制率分别为74.15 ± 3.45%和33.34 ± 0.65%；而洗脱液F4中活性成分表现出较高的肾素抑制活性，抑制率为36.70 ± 0.14%。另外，根据色谱柱标准曲线及各洗脱液中活性成分的分子量大小，可以推断F5 (193 Da) 和 F6 (78 Da)主要是游离的氨基酸或者其他的非肽化合物，这可能是这2个组分具有较低的ACE和肾素抑制活性的主要原因。因此，综合考虑各洗脱液中活性成分的ACE和肾素的抑制活性，选择洗脱液F3中活性成分进行进一步分离。

将洗脱液F3的冻干粉溶解于含 0.1% 三氟乙酸（缩写为TFA）的去离子水中，使其蛋白浓度为10 mg/mL。采用配有自动收集器和Jupiter C12 制备型色谱柱（Jupiter 4μm Proteo 90A）的高效液相色谱仪（Varian）进一步分离此活性肽。流动相A为质量百分浓度为0.1% TFA的去离子水溶液，流动相B为质量百分浓度为0.1% TFA的甲醇溶液。进样体积为1 mL，流速为5 mL/min。洗脱程序为：0～60 min ，流动相A 95～20%线性降低，流动相B 5～80%线性升高。收集6份洗脱液F3-A～F3-E（如图3所示），当流动相B的体积浓度为27.5-30%，收集到洗脱液F3-C。将各洗脱液冷冻干燥得到冻干粉，分析其活性成分的ACE和肾素抑制活性（如图4所示）。虽然洗脱液F3-D中活性成分在色谱图中具有明显的吸收峰，但是跟其他洗脱液相比，洗脱液F3-D却表现出较低的肾素和ACE抑制活性，质谱进一步分析发现F3-D是苯丙氨酸。相反，虽然洗脱液F3-C在色谱图中的吸收峰较小，却表现出较强的ACE和肾素的抑制活性。在蛋白浓度为0.5 mg/mL的测试浓度下，洗脱液F3-C中活性成分的ACE和肾素抑制率分别为56.86 ± 1.38%和 41.67 ± 2.18%。

采用Vydac C18 分析柱(protein & peptide)进一步分离洗脱液F3-C中活性成分。进样体积为0.5 mL，流速为0.5 mL/min。流动相A为质量百分浓度为0.1% TFA的去离子水溶液，流动相B为质量百分浓度为0.1% TFA的甲醇溶液。洗脱程序为：0～30 min ，流动相A 75～65%线性降低，流动相B 25-35%线性升高。收集2份洗脱液F3-C-

和F3-C-

（图5），当流动相B体积浓度为27.3-27.4时收集得到洗脱液F3-C-

。将各洗脱液冷冻干燥得到冻干粉，分析其ACE和肾素抑制活性。洗脱液F3-C-

中活性成分具有较高的ACE和肾素抑制活性，分别为16.13±1.08%和18.35±1.21%。因此可以对洗脱液F3-C-

中的活性成分进行氨基酸序列鉴定。

3.结构鉴定

采用超高效液相色谱-质谱分离和鉴定洗脱液F3-C-

中活性成分的氨基酸序列。进样前，将洗脱液F3-C-

的冻干粉溶解于去离子水中（含0.1% TFA）。色谱分离条件：色谱仪ACQUITY UPLC system，色谱柱Eclipse Plus C18 RRHD，进样体积为10 μL，流速为0.2 mL/min。洗脱程序：0～6 min，含0.1% TFA的乙腈5-30%线性升高，含0.1% TFA的去离子水95-70%线性降低。质谱条件：质谱仪Quadrupole Mass Spectrometer，ESI源，碰撞能量30 V，毛细管电压1.5 kV，锥孔电压20 V，毛细管温度150 ⁰C。在低能量下，电子主要将多肽打碎成y-型和b-型碎片。洗脱液F3-C-

中活性成分经过Eclipse Plus C18 RRHD 色谱柱分离后总离子色谱图中只得到一个峰（图略），说明洗脱液F3-C-

中活性成分只含有一种化合物。洗脱液F3-C-

中活性成分的二级质谱图如图6所示，可见洗脱液F3-C-

中活性成分的分子量是299.8 Da。另外，图中可见一个明显的b-型离子碎片峰194.7 m/z，并且在低分子量区发现Ｃ端y-型碎片峰88.0 m/z(y1-18)，可见该活性成分的Ｃ末端是丝氨酸（Ser）。相似地，根据低分子量区的b-型离子碎片峰57.3 m/z (b1)和高分子量区的y-型离子碎片峰241.3 m/z (y2)，可以判断该活性成分N端氨基酸为甘氨酸（Gly），而碎片峰137.2 m/z则是组氨酸(His)的典型离子峰。这样，洗脱液F3-C-

中活性成分就被鉴定为3肽Gly-His-Ser（GHS）。

实施例 2 小肽GHS的活性

采用实施例1制备的小肽GHS进行如下实验。

1. 小肽GHS体外酶抑制活性

（1）小肽GHS抑制ACE和肾素的IC₅₀值

小肽GHS抑制ACE和肾素的IC₅₀值分别是0.52 ± 0.01 mg/mL和0.32 ± 0.01 mg/mL，与分子量小于3 kDa的菜籽蛋白水解物相比（IC₅₀值分别是0.79 ± 0.007 mg/mL和1.19 ± 0.008 mg/mL），小肽GHS提高了1.5倍的ACE抑制活性和3.5倍的肾素抑制活性。

（ 2 ）小肽GHS的ACE、肾素抑制活性和抑制方式的测定

测试小肽GHS抑制ACE的动力学抑制模式。当底物FAPGG浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5 mM时，分别测定反应速度。根据酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/[s]）双倒数曲线图（莱恩威佛-伯克双倒数图），计算催化反应常数V_max 、K_m 和 K_i 。

测试小肽GHS抑制肾素的动力学抑制模式。当底物浓度为0.625、1.25、2.5、5 和10 µM时，分别测定反应速度。根据酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/[s]）双倒数曲线图（莱恩威佛-伯克双倒数图），计算催化反应常数V_max 、K_m 和 K_i 。

如图7a，小肽GHS抑制ACE的双倒数曲线图汇聚于x轴，说明小肽GHS是ACE的一个非竞争性抑制剂。也就是说，小肽GHS可以通过结合ACE、ACE-底物（FAPGG）复合物或者ACE的其他不同于底物的活性位点，通过改变ACE的原有构像来其失去活性。另外，根据酶抑制动力学参数K_m 不变、V_max 下降的特点，也可以判断小肽GHS对ACE的抑制类型是非竞争性（表1）。

相似地，在低浓度下(0.25 mg/mL)，图7b显示了小肽GHS是肾素的一个非竞争性抑制剂，而在高浓度下(0.5 mg/mL)，这种抑制类型又变成反竞争抑制型。也就是说，低浓度下小肽GHS可以通过结合肾素或者肾素-底物复合物来使其失活，而在高浓度下，小肽GHS主要通过形成GHS-肾素-底物复合物来使其失活。同样地，小肽GHS对肾素的抑制模式也可以通过其抑制动力学参数来确定。在小肽GHS浓度0.25、0.5mg/mL下，肾素催化反应的最大反应速率v_max 由38.58 FIU/min分别下降到23.35 and 12.34 FIU/min，而其k_m 也由4.7824 mg/mL，变化到4.8473，3.0694 mg/mL（表1）。这种k_m 、v_max 同时发生的变化，说明GHS对肾素的抑制类型是反竞争抑制型。另外，表1显示了肾素抑制动力学的抑制常数（k_i ）大于ACE抑制动力学的抑制常数，说明，小肽GHS与ACE的相互作用要强于肾素，也就是说要抑制肾素的活性，需要更高的小肽GHS浓度。

表 1 GHS 抑制 ACE 和肾素催化反应的动力学参数

k _m 是米氏常数，对ACE和肾素的单位分别为 mM 和 μM；v_max 是最大反应速率，对ACE和肾素的单位分别为ΔA/min和FIU/min ；k_i 是抑制剂常数，单位为mg/mL。

2. 小肽GHS体内降血压活性

通过单剂量灌胃自发性高血压大鼠（SHRs），探讨了小肽GHS的体内降血压活性。具体方法为：将体重（bw）340-380g雄性自发性高血压大鼠（SHR），随机分为4组，每组6只，分别灌胃1 mL PBS 缓冲液（对照组）、卡托普利（3 mg/kg bw）、小肽GHS（30 mg/kg bw）和分子量小于3kDa 的菜籽蛋白水解物（100 mg/kg bw），其中卡托普利和小肽GHS及分子量小于3kDa的菜籽蛋白水解物溶于PBS缓冲液。采用夹尾法测量SHRs的血管收缩压（SBP），计算灌胃后 2、4、6、8、24h SHRs的SBP该变量（灌胃后的收缩压减去灌胃前收缩压），见图8所示。

与空白对照相比，30 mg/kg bw下，小肽GHS表现出显著的降血压效果。灌胃GHS 6 h后，降低了SHRs血压17.29 ± 2.47 mmHg，并且可以持续到24 h (10 ± 7.15 mmHg)。在较高的剂量下（100 mg/kg bw），分子量小于3kDa 的菜籽蛋白水解物也表现出了较好的体内降血压活性，灌胃4 h后，可以迅速将SHRs的血压降低21.29 ± 9.29 mmHg。分子量小于3kDa 的菜籽蛋白水解物的快速降压效果可以归功于其较高的剂量和多种活性肽的综合作用效果。从图8可以看出，低浓度下GHS的具有持续降压的效果，说明与分子量小于3kDa 的菜籽蛋白水解物相比，GHS可能具有更强的抵抗胃肠道消化酶的水解的能力而发挥其降血压活性。另外，GHS和分子量小于3kDa 的菜籽蛋白水解物降压效果都与商业化降血压药卡托普利(3 mg/kg bw) 降血压效果相似。因此，GHS具有较好的降血效果。

综上所述，小肽GHS具有较好的肾素和ACE抑制活性，同时具有很好的体内降血压效果，可以用于制备降血压药物或具有降血压功能的食品和保健品。

Claims (10)

1.一种具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽，氨基酸序列为Gly-His-Ser。

2.一种权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将菜籽粕粉碎，分散于蒸馏水中，用碱液调节pH值为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌1-2 h，离心后分离上清液和沉淀，所述上清液为菜籽蛋白粗提液，所述沉淀为残渣；调节所述菜籽蛋白粗提液的pH值为4-5，静置后离心取沉淀，即得菜籽蛋白粗提物；

（2）将所述菜籽蛋白粗提物用胃蛋白酶和胰酶水解后，分离出分子量小于2.5-3.5 kDa的菜籽蛋白水解物；

（3）将所述分子量小于2.5-3.5 kDa的菜籽蛋白水解物采用凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。

3.根据权利要求2所述小肽的制备方法，其特征在于：将步骤（1）中所述残渣分散于蒸馏水中，用碱液调节pH值为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌，离心后取上清液，所述上清液为菜籽蛋白粗提液。

4.根据权利要求3所述小肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述水解的具体方法为：将菜籽蛋白粗提物冷冻干燥后溶于水，调节pH为1.5-2.5，加入胃蛋白酶，在36.5-37.5℃条件下进行水解反应；反应结束后，调节溶液pH至7.0-8.0，加入胰酶进行水解反应。

5.根据权利要求4所述小肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中采用凝胶过滤色谱分离时，收集分子量范围为270-700 Da的活性成分。

6.根据权利要求5所述小肽的制备方法，其特征在于：所述凝胶过滤色谱分离的方法为：凝胶柱为Hiload 26/600 Superdex 30 Prep grade，流动相为含有0.1-0.15 M NaCl、浓度为40-60 mM的磷酸缓冲液，pH 7-7.5；取对应于保留体积为275-295 mL时的洗脱液，即得分子量为270-700 Da的活性成分。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于：将所述分子量为270-700Da的活性成分采用反相高效液相色谱分离的具体方法为：

（1）将所述分子量为270-700 Da的活性成分采用Jupiter C12色谱柱进行分离，收集对应于流动相B的体积浓度为27.5-30%时的洗脱液F3-C；洗脱程序为：0～60 min，流动相A 95～20%线性降低，流动相B 5～80%线性升高；

（2）将洗脱液F3-C冷冻干燥后采用Vydac C18色谱柱分离，收集对应于流动相B体积浓度为27.3-27.4%时的洗脱液F3-C- ，冷冻干燥后得到所述小肽；洗脱程序为：0～30 min ，流动相A 75～65%线性降低，流动相B 25-35%线性升高；

所述流动相A为质量百分浓度为0.05-0.15%三氟乙酸的水溶液，所述流动相B为质量百分浓度为0.05-0.15%三氟乙酸的甲醇溶液。

8.一种权利要求1所述具有肾素和ACE抑制活性的小肽在制备降血压药物或具有降血压功能的食品中的应用。

9.一种降血压药物组合物，其特征在于含有氨基酸序列为Gly-His-Ser的小肽。

10.一种具有降血压功能的食品，其特征在于含有氨基酸序列为Gly-His-Ser的小肽。

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