CN101171024A - 降血压的蛋白质水解产物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述三肽MAP和/或三肽ITP和/或其盐。

Description

降血压的蛋白质水解产物
技术领域
本发明涉及新颖肽的生产。
背景技术
高血压是人中相对常见的疾病，并代表了心血管疾病、肾衰竭和中风的主要风险因素。大量药物产品(钙阻断剂、β阻断剂、利尿药、α阻断剂、中央α拮抗剂、血管紧张素II拮抗剂和ACE抑制剂)的可用性说明高血压的根本生理学机制是多方面的。
在高血压的生理机制中，肾素-血管紧张素机制特别地受到大量的科学关注。在该机制中，血管紧张素由肝分泌，并被肽酶肾素切割产生无生物活性的十肽血管紧张素I。当血管紧张素I经过肺毛细管时，称为血管紧张素转化酶(下文称作ACE)的另一肽酶作用于血管紧张素I，将血管紧张素I的最后两个残基(His-Leu)去除形成辛肽血管紧张素II。血管紧张素II辛肽显示强烈的血管收缩活性，从而提高血压。导致较低水平血管紧张素II的ACE抑制阻止血管收缩，从而阻止高血压。
除切割血管紧张素外，ACE还可水解缓激肽——也参与血压调节的一种九肽。在后一机制中，ACE抑制引起提高的缓激肽原水平，这也促进血管舒张并降低血压。抑制ACE因此通过至少两个分离的机制导致血压降低效应。
还已知辛肽血管紧张素II刺激肾上腺皮质释放醛固酮。醛固酮的靶器官是肾，在那里醛固酮促进提高的从肾小管的钠再吸收。ACE抑制还通过该第三种机制降低血压，但是在该情况下是通过减少钠的再吸收。
由于多重的生理学效应，抑制ACE的蛋白质水解活性是降低血压的有效途径。该观察结果导致大量有效的药物性降血压产品，例如卡托普利(captopril)和依那普利(enalapril)(Ondetti，M.A.et al.，1977，Science，Washington DC，196，441-444)。
因为高血压是相对常见的疾病状态，因此用温和活性的天然成分对抗现代生活方式的这种不期望的结果会是有利的。特别温和的活性天然成分可被掺入食品或饮品中，因为这类产物是例行被消耗的。或者这类温和活性的天然成分可以被掺入饮食添加物中。最近十年内，已经发现存在于经发酵乳中的特异肽具有ACE抑制能力，并能在高血压受试者中降低血压。现在，大量体外实验和一些动物试验已经证明得自多种蛋白质来源的不同肽的ACE抑制效应。尽管体外ACE抑制测定法已经揭示许多不同的肽序列，但是需要强调ACE抑制肽需要在血中循环以显示体内效应。意义在于有效的ACE抑制肽应当抵抗胃肠蛋白质水解消化体系的降解并应当在随后穿过肠壁的转运中保持完整。
多种ACE抑制肽的结构-功能研究提示它们常在C端序列中具有Pro-Pro、Ala-Pro或Ala-Hyp(Maruyama，S.and Suzuki，H.，1982；Agric BiolChem.，46(5)：1393-1394)。ACE是不能切割脯氨酸相关肽键的肽基二肽酶(EC3.4.15.1)的事实部分地揭示了上述发现。因此，不能从具有Xaa-Pro-Pro结构的三肽去除二肽Pro-Pro，因为Xaa-Pro键不能被切割。因此可以想像：以相对高的浓度存在时，具有Xaa-Pro-Pro结构的三肽会抑制ACE活性。因为不仅ACE，而且所有的蛋白质水解酶都在切割Xaa-Pro或Pro-Pro键时有困难，因此肽羧基端存在(多)脯氨酸残基导致相对抗蛋白酶的分子的概念几乎是不证自明的。含羟脯氨酸(Hyp)代替脯氨酸的相似肽是相对抗蛋白酶的。由此可推断羧基端带有一个或多个(羟基)脯氨酸残基的肽很可能在胃肠道中免受蛋白水解降解。这些结论会帮助我们理解特异ACE抑制肽可观的体内降血压效应：它们不仅满足了ACE抑制的结构需要，而且抵抗胃肠蛋白水解消化系统的降解，并在随后穿过肠壁转运时保持完整。
已经报导三肽Leu-Pro-Pro(JP02036127)、Val-Pro-Pro(EP0583074)和Ile-Pro-Pro (J.Dairy Sci.，78：777-7831995))具有强烈的ACE抑制活性。最初所有的ACE抑制肽根据它们对ACE活性的体外效应被表征，三肽Ile-Pro-Pro(下文称作IPP)、Val-Pro-Pro(下文称作VPP)和Leu-Pro-Pro(下文称作LPP)因为它们强烈的ACE抑制效应(其引起相对低的IC50值)而与众不同。后来，三肽VPP和IPP的推测的抗高血压效应可在自发性高血压大鼠中被证实(Nakamura et al.，J.Dairy Sci.，78：12531257(1995))。在这些实施方案中，抑制性三肽来自经乳酸细菌发酵的乳。在乳发酵中，所需肽由蛋白酶生产，所述蛋白酶由生长的乳酸细菌生产。ACE抑制肽已通过电渗析、中空纤维膜透析或色谱方法从经发酵的乳产物中浓缩，使得它们能够以浓缩的饮食添加物(如片剂或锭剂)形式被销售。
发明内容
本发明涉及新颖的三肽MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐。
本发明还涉及包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的蛋白质水解产物。优选地，所述蛋白质水解产物具有5％到50％的DH，更优选地为10％到40％，最优选地20％到35％的DH。另外，本发明涉及包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的肽混合物。优选地，该肽混合物包含至少1mg MAP/克蛋白质，更优选地至少2mg/g和最优选地至少4mg/克蛋白质。优选地，肽混合物还包含LPP和/或IPP。因此，肽混合物还优选地包含至少1mg IPP/克蛋白质，更优选地至少2mg/g和最优选地至少4mg/克蛋白质，和/或肽混合物还优选地包含至少1mg LPP/克蛋白质，更优选地至少2mg/g和最优选地至少4mg/克蛋白质。
该肽混合物优选地包含至少30wt％(干物质)的肽具有小于500Da的MW，更优选地肽混合物的35％到70％wt(干物质)是具有小于500DaMW的肽。
另外，本发明涉及生产MAP和/或ITP的酶方法，优选地通过酶水解蛋白质源来生产。
发明详述
如本申请中所示，三肽MAP和ITP在抑制ACE时是非常有效的。这些抑制效应对应于惊人低的IC50值，在本文实验部分测定为分别是MAP为0.4和ITP是10(以μM计)。另外，发现两个肽MAP和ITP均抵抗胃肠蛋白水解降解，因此被期望在人肠道中是稳定的。因此三肽MAP和/或三肽ITP及其盐非常适用于有效的ACE抑制，并可在例如功能性食物中被用作营养药物或药物。本文使用术语营养药物是指在应用的营养学和药物学领域中均有有用性。因此，包含MAP和/或ITP的新颖营养药物性组合物可用作食物或饮料的添加物和用作用于肠内或肠胃外应用的药物配方或药物，其可以是固体配方如胶囊或片剂，或液体配方如溶液、悬液或乳剂。
三肽MAP(Met-Ala-Pro)和ITP(Ile-Thr-Pro)可通过多种方法制备，所述方法包括化学合成、酶水解和含蛋白质的溶液发酵。
在复杂的混合物(如蛋白质水解产物或得自发酵的液体)中鉴定生物活性肽是具有挑战性的任务。除基本的问题(是否使用正确的蛋白质底物、是否使用正确的酶、是否使用正确的微生物培养物)外，可期望含数千种肽的复杂样品中存在若干生物活性肽。使用重复循环高效液相色谱(HPLC)分级和生物化学评价的传统鉴定途径通常是费时的并且易于丢失存在的生物活性肽，使得相关生物活性的检测极度困难。在本发明中使用非常复杂的设备并筛选许多不同的蛋白质水解产物和发酵培养基，这最终导致我们鉴定了具有ACE抑制特征的两个新肽MAP和ITP。在我们的途径中，连续流动生物化学测定法与HPLC分级体系联机配对(coupled on-line)。HPLC柱流出物在连续流动ACE生物测定法和化学分析技术(质谱法)之间分流。粗水解产物和发酵培养基通过HPLC分离，之后借助于联机生物化学测定法检测生物活性化合物的存在。连续记录质谱图，使得当肽在生物化学测定中显示活性信号时可立即获得结构信息。
通过上述途径鉴定的三肽MAP和ITP可通过多种方法产生，包括经济学有活力的生产途径。如例如″Peptides：Chemistry and Biology″by N.Sewald and H.D.Jakubke，Eds.Wiley-VCH Verlag GmbH，2002，Chapter 4中所述，使用常规技术通过化学合成生产是可能的。适用于大规模生产的化学肽合成的具体成本有效的方法基于：烷基氯甲酸盐或pivaloyl chloride用于激活羧基的用途，以及甲基酯用于C端保护的用途和苄氧羰基(Z)或叔丁氧羟基用于N保护的用途。例如在MAP的情况下，L-脯氨酸甲基酯可以与异丁基氯甲酸盐激活的Z-Ala偶联；产生的二肽可以使用氢和Pd在C上通过氢解来Z-去保护，并再次与异丁基氯甲酸盐激活的Z-Met偶联；在产生的三肽中，使用NaOH水解甲基酯，并在通过氢解Z-去保护后获得三肽Met-Ala-Pro。相似地，可合成Ile-Thr-Pro，但是在偶联反应中Thr的羟基功能需要苄基保护；然后在最后的步骤中，在Z-去保护时将该基团同时去除。
MAP和/或ITP也可通过酶水解或发酵途径，使用含有氨基酸序列MAP和/或ITP的任何蛋白质底物制造。有利地，蛋白质底物含有MAP和ITP二者。这类酶或发酵途径优选的底物是牛乳或牛乳的酪蛋白级分。通过优化发酵或水解条件，可最大化生物活性分子MAP和/或ITP的产生。尝试最大化产生的技术人员会知道如何调节所述方法的参数，例如水解/发酵时间、水解/发酵温度、酶/微生物类型和浓度等。
有利地，MAP和/或ITP或包含MAP和/或ITP的组合物是水解产物，并优选根据涉及以下步骤的方法制造：
(a)酶水解其氨基酸序列中包含MAP或ITP的合适蛋白质底物，得到包含三肽MAP和/或ITP的经水解蛋白质产物；
(b)从经水解的蛋白质产物中分离富含三肽MAP和/或三肽ITP的级分；和任选地
(c)浓缩和/或干燥来自步骤b)的级分以得到富含三肽MAP和/或三肽ITP的浓缩液体或固体。
酶水解步骤(a)可以是引起蛋白质水解、导致MAP和/或ITP三肽释放的对合适蛋白质底物的任何酶处理。尽管若干种酶组合可用于从蛋白质底物中释放所需三肽，但是本方法中所使用的优选酶是脯氨酸特异内蛋白酶或脯氨酸特异寡肽酶。合适的蛋白质底物可以是包含氨基酸序列MAP和/或ITP的任何底物。已知包含MAP的蛋白质底物是例如酪蛋白、小麦谷蛋白、向日葵蛋白质分离物、稻蛋白、卵蛋白。优选地，合适的蛋白质底物包含氨基酸序列AMAP或PMAP，如存在于牛β-酪蛋白、小麦谷蛋白的α-麦醇溶蛋白级分和向日葵蛋白质分离物2S级分中的。
酪蛋白底物可以是含有大量β-酪蛋白和α-s2-酪蛋白的任何材料。合适底物的实例是乳以及酪蛋白、酪蛋白粉末、酪蛋白粉末浓缩物、酪蛋白粉末分离物，或β-酪蛋白，或α-s2-酪蛋白。优选地，底物具有高含量的酪蛋白，例如酪蛋白蛋白质分离物(CPI)。
酶可以是能够水解蛋白质(例如β-酪蛋白和/或α-s2-酪蛋白)导致一种或多种三肽MAP和/或ITP释放的任何酶或酶组合物。
分离步骤(b)可以以技术人员已知的任何途径进行，例如通过沉淀、过滤、离心、抽提或色谱及其组合。优选地，分离步骤(b)使用微滤或超滤技术进行。过滤步骤中使用的膜孔尺寸以及膜的电荷可用于控制三肽MAP和/或三肽ITP的分离。使用带电的UF/NF膜对酪蛋白水解产物分级描述于Y.Poilot et al，Journal of Membrane Science 158(1999)105-114。
浓缩步骤(c)可涉及纳米过滤或蒸发通过步骤(b)产生的级分，以产生高度浓缩的液体。被合适地配制时(例如具有低水活性(Aw)、低pH和优选地如苯甲酸盐或山梨酸盐的防腐剂)，这类浓缩液体组合物形成储存本发明三肽的吸引人的方式。任选地，蒸发步骤之后进行干燥步骤，例如通过喷雾干燥或冷冻干燥产生含高浓度MAP和/或ITP的固体。
优选地，酶方法包含一个单酶孵育步骤。根据本发明的该酶方法还涉及脯氨酸特异蛋白酶的使用，所述脯氨酸特异蛋白酶优选地不含酶活性。脯氨酸特异蛋白酶定义为水解脯氨酸羧基端一侧的肽键。优选的脯氨酸特异蛋白酶是水解脯氨酸和丙氨酸残基羧基端侧肽键的蛋白酶。优选地，脯氨酸特异蛋白酶能够水解大的蛋白质分子，如多肽或蛋白质自身。根据本发明的方法通产具有少于24小时的孵育时间，优选地孵育时间少于10小时，更优选地少于4小时。孵育温度通常是高于30℃，优选地高于40℃，更优选地高于50℃。
本发明的另一方面是从经水解的蛋白质中纯化和/或分离三肽MAP和ITP。优选地，大部分本发明的经水解蛋白质能够在所选择的pH条件下沉淀。该纯化方法包含将pH改变为大部分经水解的和未水解的蛋白质沉淀的pH，和从溶液中残留的(生物活性)三肽中分离经沉淀的蛋白质。
为了获得羧基端具有脯氨酸残基的本发明三肽，使用能够在羧基端侧脯氨酸残基处切割的蛋白酶提供优选的选项。所谓的脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)具有优先在脯氨酸残基的羧基侧切割肽的独特可能性。脯氨酰寡肽酶也具有在丙氨酸残基的羧基侧切割肽的可能性，但是后一反应不如涉及脯氨酸残基的切割肽键有效。在分离自哺乳动物及微生物来源的所有充分表征的脯氨酸特异蛋白酶中，已鉴定一个独特的肽酶结构域，其从酶活性位点排除了大肽。事实上，这些酶不能降解含有多于30个氨基酸残基的肽，因此现在这些酶被称为“脯氨酰寡肽酶”(Fulop et al：Cell，Vol.94.161-170，July 24，1998)。因此，在它们可以显示其水解作用之前，这些脯氨酰寡肽酶需要用其他内蛋白酶的预水解。然而，如WO 02/45523中所述，甚至脯氨酰寡肽酶与这类其他内蛋白酶的组合也导致下述水解产物，所述水解产物表征为显著增强的、具有羧基端脯氨酸残基的肽的比例。因此，这类水解产物形成了用于分离下述三肽的极佳起始点，所述三肽具有体外ACE抑制效应和对胃肠蛋白水解降解经改进的抗性。
“肽”或“寡肽”在本文定义为至少两个通过肽键连接的氨基酸的链。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如其通常被认为的)，并且每个术语可根据语境的需要交换使用。“多肽”在本文中定义为含有多于30个氨基酸残基的链。根据普遍实践，本文中所有的(寡)肽和多肽式或序列从左向右书写为氨基端到羧基端的方向。本文使用的单字母密码为本领域普遍已知，可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。肽混合物是包含至少30％wt(干物质)肽的组合物，其以基础Kjeldahl Nitrogen为基础结合具有小于3500Da的MW的肽的测定而测定。
内蛋白酶在本文定义为以内切方式水解多肽中肽键并属于EC 3.4的酶。内蛋白酶根据催化机制被分为亚-亚类。存在丝氨酸内蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸内蛋白酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内蛋白酶(EC 3.4.23)、金属内蛋白酶(EC 3.4.24)和苏氨酸内蛋白酶(EC 3.4.25)的亚-亚类。内蛋白酶在本文中定义为水解邻近末端α-氨基(“氨基肽酶”)或末端羧基和次末端氨基酸之间肽键(“羧肽酶”)的酶。
WO 02/45524描述了可得自黑曲霉(Aspergillus niger)的脯氨酸特异蛋白酶。来自黑曲霉的酶优先在脯氨酸的羧基端切割，但是也可在羟脯氨酸的羧基端切割和以较低效率在丙氨酸的羧基端切割。WO 02/45524还教导该来自黑曲霉的酶和已知的来自其他微生物或哺乳动物来源的脯氨酰寡肽酶之间不存在清晰的同源性。与已知的脯氨酰寡肽酶相反，黑曲霉酶具有酸性的pH最适度。尽管已知的脯氨酰寡肽酶以及来自黑曲霉的酶是所谓的丝氨酸蛋白酶，但是我们在此显示(实施例)黑曲霉酶属于完全不同的亚家族。经分泌的黑曲霉酶显示是丝氨酸肽酶家族S28的成员，而不是大部分胞质脯氨酰寡肽酶被归入其中的S9家族(Rawling.N.D.and Barrett，A.J.；Biochim.Biophys.Acta 1298(1996)1-3)。在实施例2中，我们显示来自黑曲霉的脯氨酸特异蛋白酶的pH和温度最适度。在实施例3中，我们阐述了来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶用于切割脯氨酸和丙氨酸残基羧基端的高度偏好。另外，我们在该实施例中证明本发明方法中使用的来自黑曲霉的酶制剂优选地是基本纯净的，即不存在除纯净的脯氨酸特异内蛋白酶固有的内切蛋白水解活性外的显著的内蛋白酶活性。我们还证明根据本发明所优选使用的我们的来自黑曲霉的酶制剂不含有任何外切蛋白水解活性，更特别地不含氨基肽水解的副作用。优选地，在本发明方法中使用的来自黑曲霉的酶制剂中没有外切蛋白水解活性。“脯氨酸特异内切蛋白水解活性基本上不存在于非重组的曲霉菌株中”的见解的实验证据可见于WO 02/45524，也阐述于本发明的实施例3中。由于本发明的方法通过将酪蛋白底物仅与脯氨酸特异内蛋白酶孵育是可能的，因此最佳的孵育条件如温度、pH等可以被容易地选择，并不必需固定为亚最佳条件，如在使用两种或更多酶的情况下时。另外，另外，防止形成不需要的副产物(例如造成培养基异味的额外的、非生物活性肽或游离氨基酸)。在选择反应条件上具有更大程度的自由使得可能更容易选择其他标准。例如，现在相对于随后对蛋白质沉淀步骤而言，选择对微生物感染和最佳pH条件较不敏感的条件容易得多。在实施例4中，我们显示曲霉酶不是寡肽酶，而是能够水解完整蛋白质、大肽以及较小肽分子而不需要附加的内蛋白酶的真正内肽酶。该新颖的、惊人的发现打开了使用黑曲霉酶制备具有空前高肽(带有羧基端脯氨酸残基)含量的水解产物的可能性，因为不需要附加的内蛋白酶。这类新的水解产物可以从不同的蛋白质性起始材料(来自植物或动物来源)制备。这类起始材料的实例为酪蛋白、明胶、鱼或卵蛋白、小麦谷蛋白、大豆和豌豆蛋白以及稻蛋白和向日葵蛋白。因为已知钠在高血压中起重要作用，制备ACE抑制肽的优选底物是这些蛋白质的钙盐和钾盐而不是钠盐。
来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶的pH最适度是4.3左右(见图1)。因为该低pH最适度，将牛乳酪蛋白酸盐与来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶孵育不是不证自明的。如果pH低于6.0，则牛乳酪蛋白酸盐会沉淀，但是在pH6.0时黑曲霉酶仅有有限活性。然而，我们在实施例5中显示即使在这个非常恶劣的条件下，与来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶孵育能够产生若干已知的ACE抑制肽，例如IPP和LPP。非常惊人的是在这些条件下不产生VPP。牛乳酪蛋白掺合大量不同的蛋白质，包括β酪蛋白和κ酪蛋白。根据已知的氨基酸序列，β酪蛋白包括ACE抑制性三肽IPP、VPP和LPP。κ酪蛋白仅包括IPP。来自黑曲霉的酶不含有任何可测量的氨肽酶活性的事实强烈地提示所形成的IPP是从存在于κ酪蛋白中的-A107-I108-P109-P110-序列中释放的。可推测IPP羧基端肽键被来自黑曲霉的内蛋白酶的主要活性切割，而之前Ala-Ile键的切割通过其Ala特异的副活性完成。相似地，VPP的缺失可以根据氨肽酶副活性的缺失来解释。VPP包含在β酪蛋白的序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中。因此，脯氨酸特异内蛋白酶切除VVVPP序列但是不能释放VPP。
这些结果基于将酪蛋白酸盐与来自黑曲霉的内蛋白酶在简单的一步方法中孵育而获得。含有蛋白质的水性溶液对微生物感染高度敏感，特别是当其在大于5.0的pH下和在50℃或低于50℃的温度下保持数小时时。特别地，在这类延长的孵育步骤中可形成微生物毒素并很可能在随后的加热步骤中幸存，形成对食品级别方法的可能威胁。优选地，本发明使用大于50℃的孵育温度。结合所述一步酶过程(其中酶孵育进行少于24小时的阶段，优选少于8小时，更优选地少于4小时)，根据本发明的方法提供经改进的微生物稳定性的优点。使用本发明的酶-底物比例，结合高温度条件，IPP和LPP的切除在3小时的孵育阶段中完成。
因为ACE抑制肽IPP和LPP可以使用单一的、基本上纯净的内蛋白酶从酪蛋白切除，所以本发明造成与技术背景方法中相比更小数量的水溶性肽。在这些水溶性肽中，IPP和LPP以主要量存在。在需要高浓度ACE抑制三肽而不需要其他(通常较低活性的化合物)的情况下，这尤其重要。
根据本方法，蛋白质中存在的至少20％，更优选地至少30％，最优选地至少40％的-I-P-P-或-L-P-P-序列分别被转化为三肽IPP或LPP。
在实施例6中，我们阐述通过新的、惊人的纯化步骤的生物活性肽的5倍纯化效应。该纯化方法的基础由来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶的独特特征形成。与该酶的孵育将底物分子最具生物活性的部分以水溶性三肽的形式释放。底物分子的无生物活性或较低生物活性的部分在很大程度上保持未经切割，从而是底物分子更大的肽或多肽部分。由于这些较大的肽或多肽部分在选定的pH条件下有限的水溶性，底物的这些无生物活性或较低生物活性的部分可从可溶得多的生物活性三肽中容易地被分离。在该过程中，最初的水解产物在55℃、pH6.0的短暂酶孵育阶段中形成，然后被任选地加热至大于80℃的温度以杀死所有污染微生物并灭活来自黑曲霉的脯氨酰内肽酶。随后将水解产物酸化，实现pH降至4.5或至少低于5.0。在该pH值(其不能用于灭活来自黑曲霉的脯氨酰内肽酶，因为其代表了该酶的最适条件)下，来自酪蛋白酸盐的所有大肽沉淀，从而仅较小的肽残留在溶液中。由于沉淀的酪蛋白酸盐可通过倾析或过滤步骤或低速(即低于5000rpm)离心容易地去除，因此水相含有相对于存在的蛋白质数量高比例的生物活性肽。根据Kjeldahl数据，通过低速离心步骤，80％到70％的酪蛋白酸盐蛋白质被去除，意味着ACE抑制肽四倍或五倍的纯化。我们发现该纯化原理可有利地被应用，以获得得自除酪蛋白以外的蛋白质性材料的生物活性肽。另外，酶产生的水解产物和由合适微生物发酵的蛋白质均能够根据本方法被分离和纯化。在与底物沉淀、酶仍然有活性的pH接近的pH值孵育酶和底物会允许该纯化步骤进行。因为来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶的低pH最适度，能够认为底物在pH1.5到6.5的范围内沉淀。考虑到它们特异的沉淀行为，谷蛋白在高于pH3.5沉淀，向日葵蛋白在高于pH4.0、低于pH6.0沉淀，卵白在高于pH3.5、低于pH5.0沉淀，这形成经水解的蛋白质沉淀和经沉淀的蛋白质可从经水解的蛋白质或肽中分离的条件的实例。
倾析、过滤或低速离心后，能够以纯化的状态回收含有生物活性肽的上清液。随后的蒸发和喷雾干燥步骤会产生用于获得具有高生物活性的食品级别糊剂或粉末的经济途径。根据所述方法消化酪蛋白酸盐后，获得具有高浓度ACE抑制肽的白色、无味粉末。或者可使用蒸发或纳米过滤进一步浓缩生物活性肽。通过提高水活性结合pH调节和添加食品级别防腐剂(如苯甲酸盐或山梨酸盐)配制这类浓缩物会得到微生物学稳定的、食品级别的、降血压肽的液体浓缩物。如果适当地稀释至正确的三肽浓度，可获得通用起始材料，其适用于制造具有ACE抑制特征的所有种类的食物和饮料。需要时在倾析、过滤或低速离心后获得的上清液可被进一步加工以改善最终产物的味道。例如，上清液可与粉末状的激活的活性炭接触，随后是去除活性炭的过滤步骤。为了最小化最终产物的苦味，倾析、过滤或低速离心后获得的上清液还可进行与另一蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或谷氨酸特异的内蛋白酶)的孵育。需要时，生物活性成分MAP和/或ITP的浓度可通过随后的纯化步骤被进一步地提高，所述纯化步骤中使用三肽MAP和ITP的特异亲水/疏水性质。优选的纯化方法包括纳米过滤(根据尺寸分离)、用例如己烷或丁醇萃取然后蒸发/沉淀或接触用色谱树脂从Amberlite XAD范围(Roehm)获得的经酸化水解产物。还可以使用由Pharmacia提供的丁酰-琼脂糖树脂。
在实施例7中，我们描述使用来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶结合新的肽纯化方法制备的酪蛋白中新颖的ACE抑制肽MAP和ITP的鉴定。只有将该单一的、(基本纯净的)内蛋白酶与大比例的无生物活性肽和高度复杂的分离和鉴定设备组合使用，才能允许我们追踪并鉴定这些新颖的ACE抑制三肽。在根据实施例7(在沉淀后)制备的、来自酪蛋白的生物活性肽(CDBAP)中，三肽MAP和ITP被鉴定为数量对应于2.9mgMAP/克CDBAP(4.8mg MAP/克CDBAP中的蛋白质)和0.9mg ITP/克CDBAP(1.4mg ITP/克CDBAP中的蛋白质)。CDBAP的另一特征在于其格外高的、以摩尔数计24％的脯氨酸含量。该实施例7中描述的测试阐述了经改进的Matsui测试中两种新颖三肽的非常低的IC50值，即MAP为0.5micromol/l，ITP为10micromol/l。如果我们意识到已知最有效的天然ACE抑制肽IPP在该经改进的Matsui测试中具有2.0micromol/l的IC50值，该发现就更令人惊讶了。根据本方法，优选地至少20％，更优选地至少30％，最优选地至少40％的存在于蛋白质中的-M-A-P-或-I-T-P-序列被分别转化为三肽MAP或ITP。
实施例8中进一步阐述了新鉴定的ACE抑制肽MAP和ITP的有用性。在后一实施例中，我们显示两种肽均在模拟典型地存在于胃肠道的消化条件的条件下幸存。根据这些数据，我们推断：新颖的三肽很可能在哺乳动物(例如人)的胃肠道中幸存，意味着用于治疗高血压的可观的经济潜力。
在实施例9中，我们证明高级的ACE抑制肽MAP不仅能在酶水解实验中产生，而且可以在用适当的食品级别微生物发酵的乳制剂中检测。然而，我们不能证明这类经发酵产物中肽ITP的存在。
额外的(例如色谱)纯化步骤之前或之后获得的肽MAP和/或ITP可用于整合进以常规基础被消耗的食品产物中。这类产物的实例是人造黄油、spreads、多种乳制品如黄油或酸乳或含乳或乳清的饮料。尽管这类组合物通常被施用给人类，但是它们也可被施用给动物，优选地施用给哺乳动物，以缓解高血压。另外，所获得的产物中高含量的ACE抑制剂使得这些产物非常适用于以丸剂、药片或高度浓缩的溶液或糊或粉末的形式被整合进食品添加物中。确保连续释放ACE抑制肽的缓释饮食添加物尤其值得注意。根据本发明的MAP和/或ITP肽可作为干粉被配制在例如药丸、药片、颗粒、药囊或胶囊中。或者根据本发明的酶可作为液体被配制在例如糖浆或胶囊中。用在多种配方中并含有本发明酶的组合物也可掺入至少一种下述化合物：生理学可接受载体、佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲液和稀释液，这些术语以其常规含义使用以表示有助于包装、递送、吸收、稳定或(在佐剂的情况下)增强酶生理学效应的物质。可以粉末状形式与根据本发明的酶组合使用的多种化合物的相关背景可见于″Pharmaceutical Dosage Forms″，second edition，Volumes 1，2 and 3，ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker，Inc.。尽管作为干粉被配制的本发明的ACE抑制肽可被储存相当长的时间，但是应通过选择合适的包装(例如铝泡aluminium blister)来避免与潮湿或湿润空气接触。相对新颖的口服应用形式是使用多种类型的明胶胶囊或以明胶为基础的药片。
考虑到天然ACE抑制肽抵抗高血压的相关性，该新的和成本有效的途径为温和降压的饮食产品或甚至是兽医产品提供了吸引人的起点。因为该途径还包括惊人的简单纯化步骤，所以也扩大了降血压的、浓缩的饮食添加物的可能性。
根据本发明的或根据本发明使用的脯氨酸特异内切蛋白酶是指WO02/45524的权利要求1-5、11和13中提到的多肽。因此，该脯氨酸特异内切蛋白酶是具有脯氨酸特异内切蛋白水解活性的多肽，其选自：
(a)具有下述氨基酸序列的多肽或其片段，所述氨基酸序列与SEQID NO：2的氨基酸1到526具有至少40％的氨基酸序列同一性；
(b)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格度条件下与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，或大于60个、优选地大于100个核苷酸至少80％或90％与之同一，更优选大于200个核苷酸至少90％与之同一的片段，或(ii)与SEQ ID NO：1的核酸序列互补的核酸序列杂交。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2显示于WO 02/45524中。优选地，多肽是经分离的形式。
根据本发明使用的优选的多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1到526至少50％，优选地至少60％，优选地至少65％，优选地至少70％，更优选地至少80％，进一步更优选地至少90％，最优选地至少95％和进一步最优选地至少约97％同一的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
优选地，多肽由下述多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格度条件下，更优选地在中严格度条件下，最优选地在高严格度条件下与(i)SEQID NO：1的核酸序列或其片段，或(ii)与SEQ ID NO：1核酸序列互补的核酸序列杂交。
术语“能够杂交”是指本发明的靶多核苷酸能够与用作探针的核酸(例如SEQ.ID NO：1中公开的核苷酸序列或其片段，或SEQ.ID NO：1的补体)以显著高于背景的水平杂交。本发明还包括编码本发明脯氨酸特异内切蛋白酶的多核苷酸，以及与之互补的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因组DNA、合成DNA或cDNA。优选地，核苷酸序列是DNA，最优选地是基因组DNA序列。典型地，本发明的多核苷酸包含核苷酸的连续序列，所述连续序列能够在选择性条件下与SEQ ID NO：1的编码序列或SEQ ID NO：1编码序列的补体杂交。这类核苷酸可以根据本领域公知的方法来合成。
本发明的多核苷酸能与SEQ ID NO：1的编码序列或SEQ ID NO：1编码序列的补体以显著高于背景的水平杂交。背景杂交可由于cDNA文库中存在的其它cDNA而发生。典型地，通过本发明多核苷酸与SEQ ID NO：1编码序列或SEQ ID NO：1编码序列的补体之间相互作用而产生的信号水平是其它多核苷酸与SEQ ID NO：1编码序列之间相互作用的至少10倍、优选地至少20倍、更优选地至少50倍、进一步更优选至少100倍强。相互作用的强度可通过例如放射性(例如用32P)标记探针来测量。典型地，可使用低严格度条件(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约40℃)或高严格度条件(例如0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约60℃)进行选择性杂交。
UWGCG Package提供BESTFIT程序，该程序可用于计算同一性(例如按其默认设定使用)。
PILEUP和BLAST N算法也可以用于计算序列同一性或比对序列(例如鉴定等价物或响应序列，例如按照它们的默认设定)。
用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for BiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。
该算法首先涉及通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高分值序列对(HSP)，所述短词与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足一些阈值为正的得分T。T是指相邻词的得分阈值。这些初始的相邻词击中作为种子起始了寻找包含它们的HSP的搜索。所述词击中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积的比对得分能够提高为止。当累积的比对得分与其达到的最大值相比下降X量时；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分达到零或零下时；或达到任一序列末端时，停止每个方向上的词击中延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的敏感性和速度。BLAST算法使用如下的默认值：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵比对(B)为50、期望(E)为10、M＝5、N＝4和两链均比较。
BLAST算法进行了两个序列间的相似性统计分析。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总概率(smallest sum probability(P(N)))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列间随机发生的匹配可能性的提示。例如，当第一个序列与第二个序列比较时最小总概率是小于约1、优选地小于约0.1、更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001时，认为一个序列与另一序列相似。
Aspergillus属的菌株具有食品级别的状态，来自这些微生物的酶已知形成不受怀疑的食品级别来源。根据另一优选的实施方案，酶由其生产细胞分泌而不是非分泌的，因此称为胞质酶。这样，酶可以从细胞培养基中不经昂贵的纯化步骤以基本纯净的级别被回收。优选地，所述酶在主要的pH和温度条件下对其底物具有高亲和力。
附图说明
图1：来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶pH最适度的图示。
图2：来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶的特异性图。
图3：与经色谱纯化的、来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶孵育后，完整卵清蛋白和合成的27-mer肽的SDS-PAGE。
材料和方法
可食用酪蛋白酸钾喷雾(88％)得自DMV International，TheNetherlands。合成的生色肽得自Pepscan Systems B.V.The Netherlands或来自Bachem，Switzerland。
脯氨酸特异内蛋白酶来自黑曲霉。
从黑曲霉过量声场脯氨酸特异内蛋白酶如WO 02/45524所描述完成。该酶的活性在柠檬酸盐/磷酸氢二钠缓冲液pH4.6中，在37℃下根据合成的肽Z-Gly-Pro-pNA来测试。在405nm处用分光光度计测量监测反应产物。一个单位定义为在这些条件下每分钟释放1μmol对-硝基苯胺的酶量。
来自黑曲霉的内蛋白酶的色谱纯化
得自过量生产的黑曲霉菌株的培养物培养基用于色谱纯化蛋白酶，以去除任何污染的内蛋白水解和外蛋白水解活性。为此，首先离心发酵培养基以去除大块真菌物质，然后将上清液经过大量孔径递减的滤纸以去除所有的细胞碎片。最后在20毫摩/升醋酸钠pH5.1中将获得的超滤液稀释十倍，并上于Q-Sepharose FF柱上。将蛋白质用10毫摩/升醋酸钠pH5.1中0到0.4摩尔/升NaCl的梯度洗脱。根据World Journal of Microbiology&Biotechnology 11，209-212(1995)中描述的方案，在轻微改进的测定条件下收集并合并对Z-Gly-Pro-pNA切割显示活性的峰级分。考虑到来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶的酸性pH最适度，酶测定在柠檬酸盐/磷酸氢二钠缓冲液中在37℃下pH4.6进行。合并活性成分然后浓缩，最终产生在SDS-PAGE中仅显示单一条带、在HP-SEC中仅显示一个峰的制剂。通过疏水相互作用色谱的进一步分析证实所获得的酶制剂的纯度。
LC/MS/MS分析用于IPP、LPP和VPP的检测。
使用与P4000泵(Thermoquest，Breda，the Netherlands)偶联的离子阱质谱仪(Thermoquest，Breda，the Netherlands)的HPLC，用于定量通过本发明酶混合物产生的酶蛋白质水解产物中的目的肽，包括三肽IPP、LPP和VPP。使用Inertsil 3 ODS 3，3μm，150*2.1mm(Varian Belgium，Belgium)柱，结合Milli Q水中0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，USA；溶液A)和乙腈中0.1％甲酸(溶液B)的梯度用于洗脱来分离所形成的肽。所述梯度从100％的溶液A开始，保持5分钟，在10分钟内线性增长至5％B，随后在30分钟内线性增长至45％的溶液B，立即进入起始条件并在此保持15分钟用于稳定。使用的注射体积是50微升，流速是200微升每分钟，柱温度保持在55℃。经注射样品的蛋白质浓度约为50微克/毫升。
通过使用专门用于目的肽的MS/MS，使用约30％的最佳碰撞能量获得个体肽的详细信息。通过使用在MS/MS模式中观察到的最多碎片离子，使用外标进行个体肽的定量。
三肽LPP(M＝325.2)被用于调节MS模式中的最佳敏感度和MS/MS模式中的最佳碎裂(进行5μg/ml的恒量输注，导致MS模式中经质子化的分子)和MS/MS模式中约30％的最佳碰撞能量(产生B-和Y-离子组)。
在LC/MS/MS之前，在环境温度下和13000rpm将酶蛋白质水解产物离心10分钟，滤过0.22μm滤纸并用MilliQ水1∶100稀释上清液。
Kieldahl Nitrogen
通过Flow Injection Analysis测量Kjeldahl Nitrogen。使用装备有TKNMethod Cassette 5000-040、带有SOFIA软件的Pentium 4计算机和Tecator5027 Autosampler的Tecator FIASTAR 5000 Flow Injection System，在590nM处将从含蛋白质溶液中释放的氨定量。将对应于所述方法动态范围(0.5-20mg N/l)的样品量与95-97％的硫酸和Kjeltab一起置于消化管中，在200℃进行30分钟的消化程序，之后在360℃进行90分钟。注射进FIASTAR 5000体系后，测量氮峰，从中可以推断所测量的蛋白质量。
氨基酸分析
将精确称重的蛋白质性材料样品溶于稀酸中，通过在Eppendorf离心机中离心去除沉淀。根据Amino Acid Analysis System of Waters(MilfordMA，USA)的操作员手册中说明的PicoTag方法，对澄清的上清液进行氨基酸分析。为此，从液体中获得合适的样品，然后干燥并进行蒸汽相酸水解并使用异硫氰酸苯质来衍生化。使用HPLC方法对存在的多种经衍生化的氨基酸定量，并合计以计算称重样品中游离氨基酸的总水平。氨基酸Cys和Trp不包括在得自该分析的数据中。
使用快速OPA测试测量蛋白质水解产物的水解程度(Degree ofHydrolysis(DH))并如所述计算(Nielsen et al，JFS，VoI 66，NO 5，642-646，2001)。
水解产物中存在的肽和蛋白质的分子量分布。
在自动化HPLC体系上分析经蛋白酶处理的蛋白质样品的肽尺寸分布，所述自动化HPLC体系装备有高压泵、能够注射10-100μl样品的注射设备和能够在214nm处监测柱流出液的UV检测器。
用于该分析的柱是用20mM磷酸钠/250mM氯化钠pH7.0缓冲液平衡的Superdex Peptide HR 10/300 GL(Amersham)。注射样品(典型地50μl)后，在90分钟内0.5ml/min的流速下用缓冲液将多种成分从柱中洗脱。使用细胞色素C(Mw 13500Da)、抑肽酶(Mw 6510Da)和四甘氨酸(Mw 246Da)的混合物作为分子量标记来校准该体系。
实施例1
得自黑曲霉的酶代表新一类的脯氨酸特异蛋白酶
从WO 02/45524中提供的来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶的整个编码序列可以确定526个氨基酸的蛋白质序列。该酶的新颖性通过BLAST搜索数据库(例如SwissProt、PIR和trEMBL)来证实。让我们惊讶的是，在黑曲霉酶和已知的脯氨酰寡肽酶之间不能检测到清晰的同源性。然而，氨基酸序列更接近的检查揭示了与Pro-X羧肽酶(EC3.4.16.2)、二肽基氨肽酶I(EC3.4.14.2)和胸腺特异丝氨酸蛋白酶的低但是显著的同源性。所有的这些酶已被归为丝氨酸肽酶S28家族。活性位点丝氨酸周围的GxSYxG构型在这些酶和来自黑曲霉的内蛋白酶之间也是保守的。另外，S28家族的成员具有酸性pH最适度，具有在脯氨酸残基羧基端侧切割的特异性，并用与来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶相似的信号序列和前肽合成。黑曲霉酶的尺寸也与S28家族成员的相似。因此，黑曲霉脯氨酸特异内蛋白酶显示是丝氨酸蛋白酶S28家族而不是S9家族的成员，大部分胞质脯氨酰寡肽酶(包括得自Flavobacterium meningosepticum的酶)被归入所述S9家族。根据这些结构和生理特征，我们推断：黑曲霉酶属于丝氨酸蛋白酶的S28家族而不是S9家族。将来自黑曲霉的酶与属于S9家族的脯氨酰寡肽酶区别的另一特征在于下述事实：与属于后一家族的胞质脯氨酰内蛋白酶不同，新鉴定的黑曲霉酶被分泌进生长培养基中。这是对来自低等真核生物S28家族成员的分离和表征的首次报导。
实施例2
从黑曲霉获得的脯氨酸特异内蛋自酶的pH和温度最适度
为了确立来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶的pH最适度，制备具有不同pH的缓冲液。使用0.05mol/l醋酸钠和0.02M CaCl2制造pH为4.0-4.5-4.8-5.0-5.5和6.0的缓冲液；使用含有0.02M CaCl2的0.05MTris/HCl缓冲液制造pH7.0和8.0的缓冲液。分别使用醋酸和HCl调节pH值。生色的合成肽Z-Gly-Pro-pNA被用作底物。缓冲溶液、底物溶液和脯氨酰内蛋白酶预稀释液(0.1U/mL的活性)在水浴中被精确地加热至37.00℃。混合后将反应在405nm处37.00℃下分光光度计测量，每0.5分钟测量一次。根据图1显示的结果，清楚的是来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶具有4左右的pH最适度。
还确立了脯氨酰内蛋白酶的温度最适度。为此使用Caseine Resorufine(Roche version 3)作为底物，将经纯化的酶制剂在含有0.1mol/l醋酸钠的0.02mol/l CaCl2中，pH5.0下孵育2小时，并通过在574nm处测量来定量酶活性。根据获得的结果，来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶具有50℃左右的温度最适度。
实施例3
来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶的特异性和纯度
将得自黑曲霉菌株的粗酶样品以及经色谱纯化的酶样品针对一系列生色肽底物测试，以确立被编码的内蛋白酶的特异性，所述黑曲霉菌株含有多个拷贝的表达盒(cf WO 02/45524)。使用不同组的生色肽确立可能的污染酶活性的存在。被编码的内蛋白酶的内蛋白水解特异性在不同的Ala-Ala-XpNA(AAXpNA)底物上检测。在该语境中，“X”是指不同的天然氨基酸残基，“p-NA”是指对-硝基苯胺。“X”残基与分子的pNA部分之间肽键的切割引起色彩改变，所述色彩改变可通过λ＝405或410nm处光吸光度的提高而被监测。AAXpNA底物。为此，在含有20 CaCl2的0.1M醋酸盐缓冲液pH4.0中100X地稀释AAX-pNA底物(150mmol/l)的储存液。405nm处在TECAN Genios MTP Reader(Salzburg，Vienna)中的10分钟动力学测量记录了光密度的提高，通过在Excel中的数据加工得到图2所示的图。根据该结果，明显的是来自黑曲霉的内蛋白酶对脯氨酰肽键高度特异，带有对丙胺酰键的副活性。粗制剂和经色谱纯化的制剂显示相似的活性情况。
外来酶活性对来自黑曲霉的内蛋白酶的可能污染引起大量不期望的副反应。例如，外蛋白酶(例如羧肽酶或氨肽酶)的存在造成具有提高水平游离氨基酸的肽制剂。这些额外的氨基酸稀释了存在的生物活性氨基酸的相对浓度，还作为提高的Maillard反应的结果给予了培养基异味。如果过表达的脯氨酸特异内蛋白酶制剂中存在严重水平的污染内蛋白酶，则引入除脯氨酸或丙氨酸残基的羧基端外其他位置的切割位点。这类额外的切割位点产生额外的肽，从而也稀释了具有羧基端脯氨酸残基的生物活性肽的浓度。为了最小化所有这些不期望的副反应，优选使用基本纯净的脯氨酸特异蛋白酶。基本纯净是指在所使用的孵育条件下污染内蛋白酶以及污染外肽酶的活性是最小的或优选地不具活性。给出以下的测试步骤以定量这类污染的内肽酶和外肽酶活性。
所述测试步骤的基础通过收集多种选择性生色肽形成。因为只有脯氨酸特异的寡蛋白酶和内蛋白酶能够从肽Z-AAAP-pNA释放pNA，因此该具体的肽被用于定量所需的脯氨酸特异内蛋白水解活性。因为许多内蛋白酶能够从肽Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA释放pNA，所以这两种肽被用于定量污染的、非脯氨酸特异的内蛋白水解活性。
因为许多氨肽酶能够从肽底物有效地释放Phe和Gln，所以生色肽Q-pNA和V-pNA被用于定量污染的氨肽酶活性。
因为许多羧肽酶能够从肽底物释放Phe和Arg残基，因此选择含有这些残基的肽以定量污染的羧肽酶活性。然而，不能得到用于测量羧肽酶活性的合适生色组，从而必需开发使用合成的肽Z-AF和Z-AR的备选方法。该备选方法在下文提供。在所有的合成肽中使用的“Z”表示苄氧羰基，“pNA”表示生色团对-硝基苯胺。所有的生色肽得自Pepscan(Lelystad，The Netherlands)。肽Z-AF和Z-AR购自Bachem(Switserland)。所有的孵育在40℃下进行。经稀释的酶制剂被再计算为商业产品的浓度。
为了阐述规则地存在于工业可获得的酶制剂中多种酶活性的水平，在该实施例中我们描述三种市售酶制剂的多种蛋白水解活性的测试，即Flavourzyme 1000L Batch HPN00218(Novozymes)、Sumizyme FP(ShinNihon，Japan)和Corolase LAP Ch.：4123(AB Enzymes，UK)。Flavourzyme和Sumizyme FP均已知是除非特异性内蛋白水解和羧肽水解活性活性外，含有若干氨肽水解酶活性的复杂酶制剂。Corolase LAP显示来自曲霉的相对纯净的、经克隆和过表达的亮氨酸氨肽酶活性。
氨肽酶活性测量
100％DMSO中150mmol/l的F-pNA和Q-pNA的储存溶液在0.1MBisTris缓冲液pH6中被稀释80倍，以制造含1∶1比例的F-pNA和Q-pNA的3.75mmol/l F-pNA+Q-pNA底物溶液。将该氨肽酶底物溶液的200μl等分式样吸入微量滴定板(MTP)的分离孔中。将MTP在40℃下、运行Magellan4软件的Tecan Genios MTP(Salzburg，Vienna)中预孵育。通过添加50μl适当的酶溶液开始反应，使得孵育在3mM的底物浓度下进行。典型地，使用液体酶样品Flavourzyme，Corolase LAP和脯氨酸特异内蛋白酶的1∶50的稀释液。对干燥的Sumizyme FP产品，使用1％的溶液。
作为氨基酸-pNA键切割结果而显影的、在405nm处通过TecanGenios MTP测量的黄色随后是至少20个动力学循环(约10分钟)。该软件将所获得数据产生为OD405/min。
测量脯氨酸特异内蛋白酶活性
该测量基本上与氨肽酶测定法相同地进行，但是在该情况下使用终浓度3mmol/l的Z-AAAP-pNA作为唯一的底物。通过将pH 6缓冲液中的悬浮液加热至50-55℃使该底物溶解得到室温下澄清的溶液。测量在40℃下进行。
典型地，使用液体酶样品Flavourzyme和Corolase LAP的1∶50稀释液。以1％的溶液使用Sumizyme FP。典型地以1∶5000的稀释液使用脯氨酸特异内蛋白酶。
软件将数据产生为OD405/min。
测量污染的非脯氨酸特异内蛋白酶活性
该测量也与氨肽酶测定法所述基本相同地进行，但是在该测试中，使用1∶1比例和3mmol/l终浓度地Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA作为底物。在使用地pH6.0测试条件下，底物Z-AAAF-pNA显示弱可溶性，但是与枯草杆菌蛋白酶的测试孵育导致伴随pNA释放的底物快速增溶。测量在40℃下进行。然而，为了补偿该弱可溶性，将MTP读数器编程为在动力学循环之间摇动。
软件还将数据产生为OD405/min。
测量污染的羧基肽酶活性
因为不能得到敏感的生色肽以测量羧基肽酶活性，所以使用基于Boehringer方案的方法用于定量羧基肽酶C。
两种乙醇中150mmol/l的Z-A-F和Z-A-R储存溶液在0.1mol/l BisTris缓冲液pH6中被稀释80倍，以制造含1∶1比例的Z-A-F和Z-A-R的3.75mmol/l Z-AF+Z-A-R底物溶液。然后将该氨肽酶底物溶液的200μl等分式样吸入eppendorf小管中并在40℃预孵育。通过添加50μl适当的酶稀释液开始反应。典型地，使用Flavourzyme和Corolase LAP和脯氨酸特异内蛋白酶的1∶50的稀释液。对Sumizyme FP，使用1％的溶液。5分钟后通过添加250μl的茚三酮试剂终止反应。茚三酮试剂由溶解于15mlDMSO中的400mg茚三酮(Merck)和60mg茚氮兰组成，其中添加了5ml的4.0mol/l醋酸锂缓冲液pH5.2。4.0mol/l醋酸锂缓冲液通过将LiOH(Sigma)溶解，之后使用冰醋酸(Merck)将溶液的pH调节至pH5.2来制备。
终止反应后，将每种样品在95℃加热15分钟以便于颜色形成，随后用纯乙醇稀释10倍。在578nm处在Uvikon分光光度计中测量所形成的颜色。以与活性样品相同的方式制造空白，但是茚三酮试剂和酶的添加被反转。为了定量由羧肽酶活性产生的游离氨基酸量，使用氨基酸L-苯丙氨酸创建校准曲线。以与样品相同的方式处理含有0.1875、0.375、0.75、1.5和3.0mmol/l的L-苯丙氨酸(Sigma)的pH6缓冲液中的溶液，即在小管中250μl。根据获得的OD578值，在Excel中构建曲线。使用该曲线计算含Z-A-F和Z-A-R的样品中存在的游离氨基酸的浓度。根据获得的值，以每微摩尔每分钟每经测试的酶量计算羧基肽酶活性。
计算活性比例
为了确立多种酶制剂用于本发明方法的合适性，计算相关酶活性的商(quotients)。在基于MTP读数器的测定法中，酶活性被表征为随时间的pNA释放，即表征为ΔOD405/min。通过MTP读数器获得的酶活性的商通过将得自相同量酶的ΔOD/min值简单相除来计算。
然而，在羧肽酶测定法的情况下，产生不能与基于MTP-pNA测定法产生的ΔOD/min直接比较的OD。这时所测量的OD首先被转化为每分钟释放的μmol氨基酸(μmol/min)。然后将释放的pNA的ΔOD/min转化为μmol/min。为此，在MTP读数器上产生校准曲线，其中测量0.25、0.125、0.0625、0.0312和0.015mmol/l纯pNA(Sigma)的稀释液，每孔测量250μl。根据获得的数据，在Excel中构建校准曲线。根据该校准曲线，将ΔOD/min转化为μmol/min，使得基于pNA的测量可以与基于茚三酮的测量进行比较。
以上述测试中产生的数据为基础，所使用的多种酶制剂根据目的脯氨酸(和丙氨酸)特异活性和污染内蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶活性被表征。每种酶制剂中存在的脯氨酸特异寡蛋白水解活性或内蛋白水解活性显示在表1中“脯氨酸特异活性”列中。关于污染的氨肽酶活性(AP/Prol SpecAct)、污染的羧肽酶(CPD/Prol Spec Act)和污染的内蛋白水解活性(Endo/Prol Spec Act)的数据相对于存在的脯氨酸特异活性而被显示。每种制剂中存在的污染的氨肽酶活性相对于污染的羧肽酶活性水平被显示为(AP/CPD)。
明显的是所测试的市售酶制剂中均不含有任何显著的脯氨酸特异寡蛋白水解活性或内蛋白水解活性。另外，所测试的所有市售酶制剂均含有显著的污染内蛋白水解或外蛋白水解活性。
表1：目的(脯氨酸和丙氨酸特异的)内蛋白酶活性水平相对于污染的内蛋白水解和外蛋白水解活性水平
脯氨酸特异活性* CPD/脯氨酸特异活性 AP/脯氨酸特异活性 Endo/脯氨酸特异活性 AP/CPD
 Sumizyme  0.004  21.7  1.2  1.7  0.06
 Flavourzyme  0.0007  253.5  25.6  35.5  0.10
 CorolaseLAP  0.0  0.74
 脯氨酸特异黑曲霉 100  0.005  0.00001  0.000004  0.00
*Sumizyme以1％的溶液测量，Flavourzyme和Corolase作为1∶50的稀释液测量。得自黑曲霉的脯氨酸特异活性以1∶5000的稀释液测量。然后由数据计算存在于所提供产物中的活性。
实施例4
来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶能够水解大蛋白质和小肽，从而是真正 的内蛋白酶
由于特异的结构特征，属于S9家族的脯氨酸寡肽酶不能消化大于30个氨基酸的肽。该限制对旨在尽可能快和尽可能有效地水解不同蛋白质的酶而言是明显的缺点。为了了解来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶是否显示与底物分子尺寸相关的相同限制，我们将经色谱纯化的、来自黑曲霉的脯氨酰内蛋白酶与小的合成肽和大的卵清蛋白分子孵育，并分析由SDS-PAGE形成的水解产物。
所使用的合成肽是27-mer的序列NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH，是Pepscan公司(Lelystad.The Netherlands)的赠品。如其氨基酸序列所显示的，该肽含有2个脯氨酸残基，一个位于中间，一个位于肽的末端。
完整的卵清蛋白分子(Pierce Imject，小管含有20mg冷冻干燥的材料)由385个氨基酸组成，具有42750Da的分子量。该分子含有14个脯氨酸残基，其中之一位于分子的最C-末端，不能被脯氨酸内蛋白酶切割。
卵清蛋白和寡肽在50℃与经纯化的、来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶独立地被孵育。在若干时间间隔取样，样品使用SDS-PAGE被分析。
用含有20mM CaCl2的0.1M醋酸盐缓冲液pH4将具有4.5单位/ml活性的、经色谱纯化的、来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶稀释100倍。将卵清蛋白在醋酸盐缓冲液pH4中溶解为1mg/ml(22μM)的浓度。将27-mer溶解于相同的缓冲液中以达到0.48mg/ml(152μM)的浓度。选择卵清蛋白和27-mer溶液的容积摩尔数，使得两种溶液含有相同的可切割脯氨酸残基容积摩尔数。卵清蛋白含有13个潜在的脯氨酸切割位点，而27-mer肽仅含有两个。用0.5ml的每种底物与10μl(0.45milliU)的酶溶液在Eppendorf恒温混合仪中在50℃下孵育。在若干时间间隔中，从孵育混合物中取出10μl样品，并保持在20℃直至进行SDS-PAGE。用于SDS-PAGE和染色的所有材料均购自Invitrogen。使用LDS缓冲液根据制造商说明制备样品，并使用MES-SDS缓冲体系根据制造商说明在12％Bis-Tris凝胶上分离。使用Simply Blue Safe Stain(Collodial Coomassie G250)进行染色。
如图3中可看到的，在孵育的前4.75个小时，卵清蛋白被来自黑曲霉的酶切割为约35到36kD的离散条带(第3泳道)。延长的孵育周期导致进一步降解为不同分子量的更小产物(第7泳道)。
根据泳道4、6和8比泳道2更模糊的条带所判断，27-mer的肽也被降解。产物很小的分子量迁移(比较泳道9和8)最可能是由于肽羧基端精氨酸残基的切割。该差异为约200D(使用Alphalmager 3.3d软件在Alphalmager 2000系统上测量)，精氨酸具有174的MW。该分子量的小迁移可能是肽降解的第一步。
产物的进一步降解仅可通过SDS凝胶上条带强度的减弱看到。进一步降解的产物不是可见的，因为具有约1000MW的成分的凝胶染色不可能用考马斯亮蓝实现。
根据该实验可以推断：与已知的属于S9家族的脯氨酰寡肽酶不同，来自黑曲霉的脯氨酸特异内蛋白酶不具有对切割小尺寸肽高于较大蛋白质的特异偏好。同样，来自黑曲霉的酶表现为真正的内蛋白酶和水解不同类型蛋白质的优选的酶。该发现导致该酶的惊人用途，如以下实施例中所阐述。
实施例5
酪蛋白酸钾与来自A.niger的脯氨酸特异内蛋白酶孵育快速地产生IPP和 LPP而非VPP
在该实验中，将来自A.niger的过量产生的、基本纯净的脯氨酸特异内蛋白酶与酪蛋白酸钾孵育，以检测ACE抑制肽IPP、VPP以及LPP的释放。使用的内蛋白酶基本纯净是指不存在除纯净的脯氨酸特异内蛋白酶固有的内切蛋白水解活性(即羧基端切除脯氨酸和丙氨酸残基)以外的显著内切蛋白水解活性。
为了尽可能地限制作为摄食ACE抑制肽的结果的钠摄入，使用酪蛋白酸钾作为该孵育的底物。以10％(w/w)的蛋白质浓度将酪蛋白酸盐悬浮于65℃的水中，然后使用磷酸将pH调节为6.0。然后将悬液冷却至55℃并以4单位/克(关于单位的定义，参阅材料&方法部分)的蛋白质浓度添加来自A.niger的脯氨酸特异内蛋白酶。将该混合物在连续搅拌下孵育24小时。该阶段不再进行pH调节。在孵育的1、2、3、4、8和24小时取样。通过将样品立刻加热至90℃ 5分钟终止每个样品的酶活性。冷却后使用磷酸将每个样品的pH迅速降低至4.5，之后在Hereaus床面离心机中将悬液在3000rpm离心5分钟。完全澄清的上清液用于LC/MS/MS分析，以定量上清液中的VPP、IPP、LPP、VWPP和VWPPF肽(参阅材料&方法部分)。
牛乳酪蛋白掺合大量不同的蛋白质，包括β-酪蛋白和κ-酪蛋白。根据已知的氨基酸序列，β-酪蛋白包括ACE抑制性三肽IPP、VPP和LPP。在β-酪蛋白中，IPP包含在序列-P71-Q72-N73-I74-P75-P76-中，VPP包含在序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP包含在序列-P150-L151-P152-P153-中。κ-酪蛋白(其以约50％的β-酪蛋白浓度存在于经酸沉淀的酪蛋白制剂)进包含IPP。在κ-酪蛋白中，IPP包含在序列-A107-I108-P109-P110-中。酪蛋白的其它蛋白质成分不含IPP、VPP或LPP。
表2和表3显示存在于经酸化和离心的上清液中的肽浓度，其被计算为添加进孵育混合物中的每克酪蛋白酸钾。如表2所示，孵育1小时后IPP到达其最大浓度。之后IPP浓度没有再提高。五肽VVVPP的形成显示与IPP产生相同的动力学。如理论所期望的，VVVPP的摩尔产率与LPP肽的摩尔产率相似。LPP和VVVPP的产率均达到理论可行产率的约60％。LPP的最大浓度仅在孵育3小时后达到的事实提示：β-酪蛋白分子具体部分的切割可能更难一些。与VVVPP相反，完全不形成六肽VVVPPF。该现象提示脯氨酸特异内蛋白酶有效地切割-P-F-键，从而产生VVVPP。三肽IPP立刻被形成，但是其摩尔产率不大于VVVPP或LPP最大摩尔产率的约三分之一。因为IPP既包含在β-酪蛋白中也包含在κ-酪蛋白中，因此其产出是无法预期的。对该现象的可能解释是：脯氨酸特异蛋白酶可以产生IPP，但是仅从酪蛋白酸盐的κ-酪蛋白部分产生。考虑到相关的κ-酪蛋白氨基酸序列，这提示-A107-I108-肽键被酶的丙氨酸特异活性切割。如果是真的，则所释放的IPP数量达到κ-酪蛋白中存在量的约40％，但是不大于β加κ酪蛋白中理论存在的IPP的约10％。释放IPP的该切割机制也解释了VPP为何不能从其前体分子VVVPP形成的原因：所需的内切蛋白水解活性不仅存在于所使用的来自A.niger的酶制剂中。
表2
按每克添加的蛋白质己酸的经酸化上清液的摩尔肽含量。
微摩尔/克蛋白质 IPP  LPP  VPP  VVVPP  VVVPPF
 K-cas 1小时 2.8  4.2 ＜0.2  8.4 ＜0.2
 K-cas 2小时 2.6  6.1 ＜0.2  9.1 ＜0.2
 K-cas 3小时 2.6  8.4 ＜0.2  9.1 ＜0.2
 K-cas 4小时 2.3  8.0 ＜0.2  8.3 ＜0.2
 K-cas 8小时 2.1  9.4 ＜0.2  7.2 ＜0.2
 K-cas 24小时 2.0  9.5  0.4  5.5 ＜0.2
表3
按添加的ma/g蛋白质己酸的经酸化的上清液中的肽浓度。
微摩尔/克蛋白质 IPP  LPP  VPP  VVVPP  VVVPPF
 K-cas 1小时 0.9  1.4 ＜0.05  4.3 ＜0.05
 K-cas 2小时 2.0  0.8 ＜0.05  4.6 ＜0.05
 K-cas 3小时 0.8  2.7 ＜0.05  4.6 ＜0.05
 K-cas 4小时 0.8  2.6 ＜0.05  4.2 ＜0.05
 K-cas 8小时 0.7  3.0 ＜0.05  3.6 ＜0.05
 K-cas 24小时 0.7  3.1  0.1  2.8 ＜0.05
实施例6
酸性酪蛋白沉淀步骤的掺入导致5倍浓度的ACE抑制肽
如实施例5所述，在pH6.0将10％(w/w)蛋白质浓度的酪蛋白酸钾与来自A.niger的脯氨酸特异内蛋白酶孵育。多种孵育时间段后加热样品以停止进一步的酶活性，之后将pH降至4.5以最小化酪蛋白可溶性。通过低速离心去除不溶性酪蛋白分子。在表2和表3中，我们提供了基于10％蛋白质的起始浓度计算的ACE抑制肽浓度。然而，作为酸化和随后的离心步骤的结果，大部分添加的蛋白质已被去除。而为了将该经酸化的上清液的经减少的蛋白质含量计算在内，进行氮(Kjeldahl)分析。根据后一数据，发现多种上清液含有表4显示的蛋白质水平。
表4
酸化的上清液中蛋白质的含量
 样品 蛋白质含量(克/升)
 K-cas 1小时 21
 K-cas 2小时 27
 K-cas 3小时 30
 K-cas 4小时 34
 K-cas 8小时 40
 K-cas 24小时 48
考虑到这些数据，我们再计算了每种上清液中存在的ACE抑制肽的浓度，但是这次使用它们的实际蛋白质含量。再计算的数据显示在表5中。
表5
按存在的每克蛋白质计算的经酸化上清液中肽浓度
毫克/克蛋白质 VPP  IPP  LPP  VVVPP  VVVPPF
 K-cas 1小时 0.1  4.8  7.1  22.5 ＜0.05
 K-cas 2小时 0.1  3.4  8.0  18.9 ＜0.05
 K-cas 3小时 0.1  3.1  10.0  17.0 ＜0.05
 K-cas 4小时 0.1  2.4  8.5  13.7 ＜0.05
 K-cas 8小时 0.1  1.9  8.4  10.0 ＜0.05
 K-cas 24小时 0.3  1.5  7.1  6.4 ＜0.05
表3和表5中存在的数据的比较清晰地显示之后进行工业可行的倾析、过滤或低速离心步骤的简单的酸化步骤导致特异ACE抑制肽浓度5倍的提高。
实施例7
在浓缩的酪蛋白水解产物中鉴定新颖的和可能的ACE抑制三肽MAP和 ITP
为了便于更彻底地分析存在的生物活性肽，以制备规模制备酪蛋白水解产物，所述酪蛋白水解产物通过用纯净的来自A.niger的脯氨酸特异内蛋白酶消化并通过酸沉淀来获得。为此，将3000克酪蛋白酸钾重悬于25升75℃的水中。彻底的均质化后用经稀释的磷酸将pH缓慢调节至6.0。冷却至55℃后，以4个酶单位/克酪蛋白酸盐(单位的定义参阅材料&方法部分)的浓度添加来自A.niger的脯氨酸特异内蛋白酶。在55℃孵育(搅拌)3小时后，通过缓慢地添加浓缩的磷酸将pH降低至4.5。在该更大规模的制备中，省略所述方法该部分中用于灭活脯氨酸特异内蛋白酶的加热处理步骤。然后将悬浮液快速冷却至4℃并在该温度保持过夜(不搅拌)。第二天早上，将澄清的上层倾析并蒸发，以达到40％干物质的水平。将后一浓缩的液体在140℃下进行UHT处理4秒钟，然后在50℃下超滤。微生物过滤后喷雾干燥液体。该材料在下文中称为来自酪蛋白的生物活性肽(CDBAP)。使用材料&方法部分中加下划线的LC/MS操作测定粉末状产物的IPP、LPP和VPP含量。根据其氮含量，粉末状的产物具有约60％的蛋白质含量(使用6.38的转换因子)。粉末的IPP、LPP和VPP含量提供在表6中。CDBAP产物的氨基酸组成提供在表7中。非常值得注意的是酸沉淀后获得的喷雾干燥材料中摩尔脯氨酸含量的提高：从最初的12％提高至约24％。
表6：CDBAP的IPP、LPP和VPP含量
IPP  LPP  VPP
以mg/克粉末表示的三肽含量
2.5  6.5 ＜0.1
以mg/克蛋白质表示的三肽含量
4.2  10.8 ＜0.17
表7：酪蛋白酸盐起始材料和CDBAP的氨基酸组成(酸水解后的氨基酸含量，并显示为摩尔氨基酸含量百分比)
氨基酸 起始材料 CDBAP
 Asp  6.5  3.2
 Glu  18.9  12.5
 Asn  -  -
 Ser  6.7  4.3
 Gln  -  -
 Gly  3.5  3.2
 His  2.2  3.7
 Arg  2.8  2.3
 Thr  4.3  3.0
 Ala  4.5  3.4
 Pro  12.3  24.1
 Tyr  3.9  2.4
 Val  7.1  9.6
 Met  2.3  3.9
 Ile  5.0  4.1
 Leu  9.2  9.0
 Phe  4.0  3.9
 Lys  6.9  7.4
总计  100  100
通过使用与at-line ACE抑制测定法和用于鉴定的质谱法组合的2维色谱分离来研究CDBAP中新颖ACE抑制肽的存在。在一种分析中，肽混合物在ODS3液体色谱(LC)柱上被分离，从获得的多个级分产生ACE抑制图谱。在另一分析中，显示高ACE抑制的来自第一种柱的级分在BiosuiteLC柱上使用不同的梯度形式被进一步地分离。将收集自第二种柱的级分分为两部分：一部分用于at-line ACE抑制测量，而另一部分进行MS和MS-MS分析以鉴定存在的肽。
使用装备了二元追踪UV检测器的Alliance 2795 HPLC系统(Waters，Etten-Leur，the Netherlands)进行所有的分析。为了鉴定肽，HPLC体系被与来自相同供应商的Q-TOF质谱仪配对。在测试中，20μl MiIIi-Q水中10％(w/v) CDBAP的溶液被注射在5μm颗粒大小的150×2.1 lnertsil 5ODS3柱上(Varian，Middelburg，the Netherlands)。流动相A由MiIIi-Q水中0.1％的三氟乙酸(TFA)溶液组成。最初的洗脱液组成为100％A。洗脱液被保持为100％A 5分钟。然后开始10分钟到达5％B的线性梯度，之后是10分钟到达30％B的线性梯度。通过将B的浓度在5分钟内提高至70％并在70％B再保持5分钟来冲洗柱。之后在1分钟内将洗脱液改变为100％A，平衡9分钟。总运行时间为50分钟。洗脱液流为0.2ml每分钟，柱温度设定为60℃。记录215nm处的UV色谱图。使用1分钟的间隔时间(导致200μl的级分体积)将洗脱级分收集在96孔板中。通过添加80μl0.05％的水性氨水(25％)溶液来中和孔中的流出物。在氮气中50℃下蒸发溶剂直至干燥。之后将残余物重溶于40μl的MiIIi-Q水中并混合1分钟。
为了进行at-line ACE抑制测定，添加27μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中的33.4mU ml-1ACE(酶得自Sigma)溶液(有260mM的氯化物浓度)，允许混合物在96孔板中700rpm下孵育5分钟。孵育周期后添加13μl PBS缓冲液中的0.35mM马尿酸-组氨酸-亮氨酸(HHL)溶液，在700ROM混合1分钟。允许混合物在GC-烘箱中反应60分钟。反应后将平板在熔化的冰上冷却。
然后在flash-HPLC柱上分析96孔板。将30μl每孔的反应混合物注射进装配了来自相同供应商的10×4.6mm RP18e保护柱的Chromlith FlashRP18e 25×4.6mm HPLC柱(Merck，Darmstadt，Germany)上。等度流动相由水/乙腈79/21中0.1％的TFA溶液组成。洗脱流为2ml每分钟，柱温度为25℃。注射以1分钟的间隔时间进行。在280nm处监测马尿酸(H)和HHL。测量H和HHL的峰高并根据以下等式计算每种级分的ACE抑制(ACEI)：
ACEI α = ( DC W - DCα ) DC W * 100
分析物的ACEIα抑制百分比
DCW水中ACE将HHL切割为H和HL的程度
DC3 分析物将HHL切割为H和HL的程度
通过将H峰高表达为H和HHL峰高和的部分来计算切割的程度
在18分钟和26分钟之间洗脱的级分中测量到最高的ACE抑制。收集该区并再注射于颗粒大小为3μm的150×2.1mm Biosuite柱(Waters，Etten-Leur，the Netherlands)上。流动相A由MiIIi-Q水中0.1％的甲酸(FA)溶液组成。流动相B由甲醇中0.1％FA溶液组成。最初的洗脱成分为100％A。洗脱液被保持为100％A 5分钟。然后开始1 5分钟到达5％B的线性梯度，之后是30分钟到达60％B的线性梯度。将洗脱液维持为60％B 5分钟。之后在1分钟内将洗脱液降低为100％流动相A，平衡10分钟。总运行时间为65分钟。洗脱液流为0.2ml每分钟，柱温度设定为60℃。记录215nm处的UV色谱图。使用10秒的间隔时间从Biosuite柱收集级分。再次将级分分为两份，一份用于使用前文所述at-line ACE抑制方法测量活性，而另一份用于使用MS和MS-MS鉴定活性肽。
分子离子326.2080Da的两个色谱峰和分子离子330.2029Da和318.1488Da的另外两个峰对应于再18和26分钟之间区域测量的提高的ACE抑制。使用MS-MS将这些肽分别鉴定为IPP和LPP(-0.6ppm)、ITP(-4.8 ppm)和MAP(+2.8ppm)的结构同分异构体。肽的蛋白质来源是κ酪蛋白f108-110(IPP)、β-酪蛋白f151-153(LPP)、α-s2-酪蛋白f119-121(ITP)和β-酪蛋白f102-104(MAP)。先前IPP和LPP被报导为IC50值分别为5和9.6μM的ACE抑制肽(Y.Nakamura，M.Yamamoto.，K.Sakai.，A.Okubo.，S.Yamazaki，T.Takano，J.Dairy Sci.78(1995)777-783；Y.Aryoshi，Trends in Food Science and Technol.4(1993)139-144)。然而，就我们所已知，三肽ITP和MAP从未被报导为可能的ACE抑制肽。
MAP、ITP和IPP被化学合成，并使用下文所述的经改进的Matsui测定法测量每种肽的活性。
在Micromass Quattro Il MS设备(再正电喷射、多重反应监控模式下运行)上进行多种样品中MAP和ITP的定量。使用的HPLC方法与上述的方法相似。MS设定(ESI+)如下：锥部电压37V、毛细管电压4kV、300l/h的干燥氮气。来源和雾化温度分别为100℃和250℃。使用合成的肽制备校准线，对MAP使用先驱离子(precursor ion)318.1和总和产物离子(summed product ions)227.2和347.2，对ITP使用先驱离子320.2和总和产物离子282.2和501.2。根据这些分析，新颖的ACE抑制三肽MAP和ITP以下述响应量存在于CDBAP产物中：2.9mg MAP/克CDBAP或4.8mg MAP/克CDBAP中的蛋白质，0.9mg ITP/克CDBAP和1.4mg ITP/克CDBAP中的蛋白质。
为了测定MAP和ITP的ACE抑制活性，根据Matsui等(Matsui，T.etal.(1992)Biosci.Biotech.Biochem.56：517-518)的方法进行一些小修饰来测定化学合成的三肽。多种孵育显示于表8中。
表8：用于Matsui ACE抑制测定法的步骤。成分添加于1.5mL管中，终体积为120μl。
成分 对照1(μl) 对照2(μl) 样品1(μl) 样品2(μl)
Hip-His-Leu(3 mM) 75  75 75  75
H2O 25  45 -  20
抑制肽 -  - 25  25
ACE(0.1U/ml) 20  - 20  -
四种样品的每一种含有75μl溶解于250 mM硼酸盐溶液的3mM马尿酰组氨酸亮氨酸(Hip-His-Leu，Sigma)，所述硼酸盐溶液含有200mM NaCl，pH8.3。ACE得自Sigma。混合物在37℃孵育，30分钟后通过添加125μl0.5M HCl终止。随后加入225μl bicine/NaOH溶液(1M NaOH：0.25Mbicine(4:6))，之后加入25μl 0.1M TNBS(0.1M Na2HPO4中的2，4，6-三硝基苯磺酸，Fluka，Switzerland)。再37℃孵育20分钟后，加入4ml 0.2MNa2HPO4中的4mM Na2SO3，用UV/Vis分光光度计(带有CPS控制器的Shimadzu UV-1601，Netherlands)测量416nm处的吸光度。
根据下式，将ACE抑制(ACEI)活性的数量计算为与不存在抑制剂时ACE转化速率相比的抑制百分比：
ACEI(％)＝((对照1-对照2)-(样品1-样品2))/(对照1-对照2))*100其中
对照1＝不含ACE抑制成分时的吸光度(＝最大ACE活性)[AU]。
对照2＝不含ACE抑制成分且不含ACE时的吸光度(背景)[AU]。
样品1＝存在ACE和ACE抑制成分时的吸光度[AU]。
样品2＝存在ACE抑制成分，但是不存在ACE时的吸光度[AU]。
获得的化学合成的MAP和ITP三肽的IC50与在本实验筛选阶段使用的at-line测量中获得的IC50值一起显示于表9中。化合合成的IPP的测量作为多种测量的内部参考而被包括。
表9：通过at-line ACE测定法和经改进的Matsui测定法测定的MAP、ITP和IPP的ACE抑制值(IC50值)。
肽 以μM计的IC50值
 at-line ACE测定法 经改进的Matsui测定法
MAP  3.8  0.4
ITP  50  10
IPP(参考)  7.1  2
实施例8
新颖的ACE抑制肽MAP和ITP很可能在人胃肠道中幸存
被消耗后，饮食蛋白质和肽被暴露于胃肠道中多种消化性酶过程。为了评价新鉴定的生物活性肽在人胃肠道中的稳定性，将CDBAP制剂(如实施例7所述制备)进行胃肠处理(GIT)，所述胃肠处理典型地模拟在人体中发现的消化条件。在GIT模型系统中不同的孵育时间后获得的样品使用on-line HPLC-Bioassay-MS或HRS-MS系统定量任何残留的MAP和ITP肽。在带有100ml烧瓶的标准化的混合设备(如由Vankel，US所提供)中进行GIT操作。水浴温度设定为37.5℃，选择搅棒速度使得样品保持为悬浮液(100rpm)。
将3.4克CDBAP(蛋白质水平约60％)溶解/悬浮于100ml MiIIi-Q水中。在胃模拟中，使用5M HCl降低pH。胃模拟结束和十二指肠阶段时，使用5M NaOH提高pH。
将CDBAP悬浮液预加热至37.5℃并取出5ml悬浮液以溶解0.31g胃蛋白酶(Fluka order no.77161)。T＝0时，将5ml现溶解的胃蛋白酶加回悬浮液中。然后使用分离的pH计根据以下流程手动缓慢调节CDBAP的pH：
t＝20分钟，pH降低至3.5
t＝40分钟，pH至3.0
t＝50分钟，pH至2.3
t＝60分钟，pH至1.8
t＝65分钟，pH提高至2.7
t＝75分钟，pH至3.7
t＝80分钟，pH至5.3
在t＝90分钟时，在另一5ml的CDBAP悬浮液中小心混合0.139g的8倍USP胰酶(Sigma order no.P7545)，立刻加回。
根据以下流程继续孵育：
t＝93分钟，pH调至5.5
t＝95分钟，pH调至6.3
t＝100分钟，pH调至7.1
在t＝125分钟时停止实验并检查pH(仍为pH7)。
然后将样品转移至烧杯中并置于微波炉中直至沸腾。随后将样品转移至玻璃管中并在95℃孵育60分钟以灭活所有的蛋白酶活性。冷却后将样品置于Falcon管中，在3000xg离心10分钟。将上清液冷冻干燥。测定获得的粉末的总N浓度并使用酪蛋白的Kjeldahl因子(6.38)将其转换为蛋白质水平。根据这些数据，GIT操作后CDBAP制剂的蛋白质水平是48.4％。在根据GIT的蛋白质水解处理后幸存的MAP和ITP的水平如实施例7所述被测定，获得的数据显示在表10中。
根据实验的结果，MAP和ITP均显示针对GIT消化的高度抗性。结合这些三肽的IC50值(也在实施例7中测定)，数据提示两个新颖的ACE抑制肽作为降血压肽的巨大潜力。
表10：经过模拟的人胃肠道(GIT操作)之前和之后的MAP和ITP浓度
样品 以μg g-1粉末计的浓度
MAP  ITP
 CDBAP(实施例7)  2851.4  903.7
 GIT后的CDBAP  3095.8  889.1

Claims (10)

1.三肽MAP和/或三肽ITP和/或MAP盐和/或ITP盐。
2.包含MAP和/或ITP和/或MAP盐和/或ITP盐的蛋白质水解产物。
3.如权利要求2所述的蛋白质水解产物，其具有5％到50％的DH，优选地为10％到40％，更优选地为20％到35％的DH。
4.包含MAP和或ITP或MAP盐和/或ITP盐的肽混合物。
5.如权利要求4所述的肽混合物，其包含：
至少1mg的MAP/克蛋白质，
优选地至少2mg MAP/克蛋白质，
更优选地至少4mg MAP/克蛋白质。
6.如权利要求4或5所述的肽混合物，其中具有小于500Da的MW的肽数量为肽混合物的至少30wt％(干物质)，优选地为肽混合物的35wt％和70wt％(干物质)之间。
7.如权利要求4到6中任一项所述的肽混合物，或如权利要求2或3所述的蛋白质水解产物，其还包含IPP或LPP。
8.如权利要求4到6中任何一项所述的肽混合物，或如权利要求2或3所述的蛋白质水解产物，其包含1％到90％的水，优选地包含1％到30％的水，更优选地包含1％到15％的水。
9.生产三肽MAP和/或ITP和/或其盐的方法，所述方法包括：对蛋白质进行酶水解，以及，任选地，将MAP和/或ITP转化为其盐。
10.如权利要求9所述的方法，包括使用蛋白酶水解合适的蛋白质，优选地使用脯氨酸特异蛋白酶。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275177A (zh) * 2013-06-24 2013-09-04 南京财经大学 具有肾素和ace双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用
CN107105707A (zh) * 2014-10-24 2017-08-29 杜邦营养生物科学有限公司 脯氨酸耐受性三肽基肽酶及其用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004098309A1 (en) 2003-05-05 2004-11-18 Unilever N.V. Hydrolysed casein product comprising tripeptides ipp and/ or vpp
ZA200709009B (en) * 2005-04-28 2009-01-28 Unilever Plc Peptides having an ace inhibiting effect
CN110028549B (zh) * 2016-07-07 2022-08-05 华东理工大学 降血压肽和降血压蛋白质及其应用
US11312754B2 (en) 2019-05-31 2022-04-26 Access Business Group International Llc Sunflower seed protein-derived peptides

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5013662A (en) * 1985-09-20 1991-05-07 Cetus Corporation Bacterial methionine n-terminal peptidase
JP2782142B2 (ja) * 1992-07-23 1998-07-30 カルピス株式会社 アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法
WO2001068114A1 (en) * 2000-03-10 2001-09-20 Monsanto Company Novel peptides with anti-hypertensive activity
AU2001255469A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Monsanto Technology Llc Purification of ace inhibiting polypeptides containing vpp from milk
AU2001255501A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Monsanto Technology Llc Blood-pressure reducing polypeptides containing vpp derived from microorganisms

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275177A (zh) * 2013-06-24 2013-09-04 南京财经大学 具有肾素和ace双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用
CN103275177B (zh) * 2013-06-24 2015-08-12 南京财经大学 具有肾素和ace双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用
CN107105707A (zh) * 2014-10-24 2017-08-29 杜邦营养生物科学有限公司 脯氨酸耐受性三肽基肽酶及其用途

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