EA012972B1 - Трипептиды мар и itp или их соли, белковые гидролизаты и смеси, содержащие указанные трипептиды или их соли, для снижения кровяного давления - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение раскрывает трипептиды MAP и ITP и их соли, белковые гидролизаты, содержащие указанные трипептиды и их соли, и смеси указанных трипептидов и их солей, используемые для снижения кровяного давления. Изобретение также раскрывает способ получения указанных трипептидов и их солей, который включает ферментативный гидролиз белка пролин-специфичной протеазой и при необходимости преобразование MAP и/или ITP в их соли.

Description

Настоящее изобретение относится к получению новых пептидов.

Предшествующий уровень техники

Гипертензия представляет собой относительно общее болезненное состояние у людей и является доминирующим фактором риска для развития сердечно-сосудистых заболеваний, почечной недостаточности и нарушений мозгового кровообращения. Возможность использования широкого ряда фармацевтических продуктов, таких как блокаторов кальциевых каналов, бета-блокаторов, диуретических средств, альфа-блокаторов, центральных альфа-антагонистов, антагонистов ангиотензина II и ингибиторов ангиотензин-конвертирующего фермента, демонстрирует, что физиологические механизмы, лежащие в основе генеза гипертензии, являются многосторонними.

Физиологическим механизмам гипертензии, в особенности ренин-ангиотензивному механизму, уделяется много научного внимания. В этом механизме ангиотензин секретируется печенью и расщепляется ферментом ренином с образованием биологически неактивного декапептида ангиотензина I. Как только ангиотензин проходит через легочные капилляры, другой фермент, называемый ангиотензинконвертирующий фермент (именуемый в дальнейшем АСЕ), взаимодействует с ангиотензином I, что приводит к отщеплению последних двух остатков ангиотензина I (Нщ-Ьеи) и образованию октапептида ангиотензина II. Октапептид ангиотензин II проявляет сильную вазоконстрикторную активность и, вследствие чего, повышает артериальное давление. Ингибирование АСЕ, что влечет за собой низкие уровни ангиотензина II, препятствует вазоконстрикции и, следовательно, высоким кровяным давлениям.

Помимо расщепления ангиотензина I АСЕ также может подвергать гидролизу брадикинин, нонапептид, также участвующий в регуляции кровяного давления. В последнем механизме ингибирование АСЕ приводит к повышенным уровням брадикинина, что приводит к расширению кровеносных сосудов и снижению кровяного давления. Ингибирование АСЕ, таким образом, приводит к понижению кровяного давления посредством по меньшей мере двух отдельных механизмов.

Также известно, что октапептид ангиотензин II стимулирует высвобождение альдостерона из коры надпочечников. Органом-мишенью для альдостерона являются почки, где альдостерон обеспечивает повышенную реабсорцию натрия из почечных канальцев. Также посредством этого третьего механизма ингибирование АСЕ снижает кровяное давление, но в данном случае - путем снижения реабсорции натрия.

Вследствие его многочисленных физиологических действий ингибирование протеолитической активности АСЕ является эффективным способом снижения кровяного давления. Эти наблюдения влекут за собой создание ряда эффективных фармацевтических средств, снижающих кровяное давление, таких как каптоприл и эналаприл (Опбебц М.А. е! а1., 1977, 8с1епсе, \Уа51нпдЮп ΌΟ, 196, 441-444).

Поскольку гипертензия является общим болезненным состоянием, то будет предпочтительным уравновесить эти нежелательные результаты современного образа жизни со слабоактивными натуральными ингредиентами, в особенности слабоактивные натуральные ингредиенты, которые могут быть включены в продукты питания или напитки, поскольку такие продукты регулярно потребляются. Альтернативно, такие слабоактивные натуральные ингредиенты могут включаться в диетические добавки. За последние десятилетия было обнаружено, что специфичные пептиды в кисломолочных продуктах обладают способностью ингибирования АСЕ и могут вызывать снижение кровяного давления у субъектов, страдающих гипертензией. На сегодняшний день ряд ίη νίίτο и некоторые исследования на животных продемонстрировали АСЕ-ингибирующие действия различных пептидов, полученных из различных источников белка. Несмотря на то что исследования ингибирования АСЕ ίη νίίτο обнаружили многие различные пептидные последовательности, следует отметить, что пептиды, ингибирующие АСЕ, нуждаются в циркуляции в крови для проявления своего действия ίη νίνο. Их роль заключается в том, что эффективные пептиды, ингибирующие АСЕ, должны препятствовать расщеплению посредством протеолитической системы пищеварения желудочно-кишечной тракта и должны оставаться интактными в течение дальнейшего переноса через стенку кишечника.

Структурно-функциональный анализ различных пептидов, ингибирующих АСЕ, натолкнул на мысль, что они обычно содержат Рго-Рго, А1а-Рго или А1а-Нур на С-концевой последовательности (Матиуаша, 8. апб 8ιιζι.ι1<ί. Н., 1982; Адпс Βίο1 Обет., 46(5): 1393-1394). Эта находка частично объясняется тем фактом, что АСЕ является пептидилдипептидазой (ЕС3.4.15.1), не способной расщеплять пептидные связи, включая пролиновые. Таким образом, из трипептидов, имеющих структуру Хаа-Рго-Рго, дипептид Рго-Рго не может быть удален, поскольку связь Хаа-Рго не может быть расщеплена. Вследствие чего можно допустить, что при наличии в высоких концентрациях трипептиды, содержащие структуру ХааРго-Рго, будут ингибировать активность АСЕ. Поскольку не только для АСЕ, но и почти для всех протеолитических ферментов характерны сложности в расщеплении связей Хаа-Рго или Рго-Рго, то убеждение в том, что наличие (многочисленных) пролиновых остатков на карбоксиконцевом конце пептидов приводит к относительной устойчивости молекул к действию протеаз, является почти очевидным. Подобные пептиды, содержащие гидроксипролин (Нур) вместо пролина, относительно устойчивы к действию протеаз. В связи с чем можно сделать вывод, что пептиды, содержащие один или более (гидрокси)пролиновые остатки на карбоксиконцевом конце, способны избегать протеолитического расщепле

- 1 012972 ния в желудочно-кишечном тракте. Эти заключения помогут понять заметное действие по снижению кровяного давление ίη νίνο специфичных пептидов, ингибирующих АСЕ: они не только испытывают трудности структурных требований для ингибирования АСЕ, они также являются стойкими при расщеплении протеолитической системой расщепления желудочно-кишечного тракта и остаются интактными в течение дальнейшего переноса через стенку кишечника.

Стойкие активности в отношении ингибирования АСЕ сообщались для трипептидов Ееи-Рго-Рго (1Р 02036127), Уа1-Рго-Рго (ЕР 0583074) и 11е-Рго-Рго (1. Иаиу 8ск, 78:777-7831995)). Исходно, все пептиды, ингибирующие АСЕ, характеризовались на основании их действия ίη νίΙΐΌ в отношении активности АСЕ и трипептиды 11е-Рго-Рго (именуемый в дальнейшем 1РР), Уа1-Рго-Рго (именуемый в дальнейшем УРР) и Ееи-Рто-Рто (именуемый в дальнейшем ЬРР) выпадали из-за их стойкого действия в отношении ингибирования АСЕ, что приводило к относительно низким значениям 1С₅₀. В дальнейшем предполагаемые антигипертензивные действия трипептидов УРР, а также 1РР могут быть подтверждены на спонтанногипертензивных крысах (Иакатига е! а1., 1. Иа1ту 8ск, 78:12531257 (1995)). В этих экспериментах ингибирующие трипептиды были получены из молочно-кислых бактерий сквашенного молока. Во время сквашивания молока желаемые пептиды продуцируются протеазами посредством роста молочно-кислых бактерий. АСЕ ингибирующие пептиды концентрировали из молочных продуктов после электродиализа, диализа с применением мембран из полых волокон или хроматографических способов для предоставления возможности их распространения в виде таблеток, подобных концентрированным диетическим добавкам или пастилкам.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым трипептидам МАР и/или 1ТР или к соли МАР и/или соли 1ТР.

Настоящее изобретение также относится к белковому гидролизату, содержащему МАР и/или 1ТР или соль МАР и/или 1ТР. Предпочтительно белковый гидролизат имеет от 5 до 50% ИН (степень гидролиза), более предпочтительно от 10 до 40% и наиболее предпочтительно от 20 до 35% ИН. Кроме того, настоящее изобретение относится к смеси пептидов, содержащей МАР и/или 1ТР или соль МАР и/или 1ТР. Предпочтительно эта смесь пептидов содержит по меньшей мере 1 мг МАР/г белка, более предпочтительно по меньшей мере 2 мг/г и более предпочтительно по меньшей мере 4 мг/г белка. Предпочтительно смесь пептидов также содержит ЬРР и/или 1РР. Таким образом, смесь пептидов предпочтительно содержит по меньшей мере 1 мг 1РР/г белка, более предпочтительно по меньшей мере 2 мг/г и наиболее предпочтительно по меньшей мере 4 мг/г белка и/или смесь пептидов предпочтительно также содержит по меньшей мере 1 мг ЬРР/г белка, более предпочтительно по меньшей мере 2 мг/г и наиболее предпочтительно по меньшей мере 4 мг/г белка.

Эти смеси пептидов предпочтительно содержат пептиды не менее 30 мас.% (сухого вещества), имеющие молекулярную массу менее чем 500 Да, более предпочтительно от 35 до 70 мас.% (сухого вещества) смеси пептидов пептиды, имеющие менее чем 500 Да.

Кроме того, настоящее изобретение относится к ферментативному процессу выработки МАР и/или 1ТР предпочтительно путем ферментативного гидролиза источника белка.

Подробное описание изобретения

Как показано в настоящем изобретении, трипептиды МАР и 1ТР являются достаточно эффективными в отношении ингибирования АСЕ. Эти ингибирующие эффекты сопоставляются с удивительно низкими значениями 1С₅₀, соответственно 0,4 для МАР и 10 для 1ТР (в мкМ), как определено в экспериментальной части настоящего изобретения. Кроме того, обнаружено, что оба трипептида МАР и 1ТР не поддаются расщеплению протеолитическими ферментами желудочно-кишечного тракта и, следовательно, как ожидается, являются устойчивыми в кишечном тракте человека. Трипептид МАР и/или трипептид 1ТР и их соли, следовательно, являются чрезвычайно пригодными для эффективного ингибирования АСЕ и могут, например, использоваться в функциональных продуктах питания в качестве нутрицевтиков или лекарств. Понятие нутрицевтик в используемом здесь значении указывает на пригодность как к пищевой, так и к фармацевтической областям применения. Таким образом, новые фармацевтические композиции, содержащие МАР и/или 1ТР, могут найти свое применение в качестве добавок к продуктам питания или напиткам и в качестве фармацевтических составов или лекарственных средств для энтерального или парентерального применения, которые могут быть в виде твердых составов, таких как капсулы и таблетки, или жидких составов, таких как растворы, суспензии и эмульсии.

Трипептиды МАР (Ме!-А1а-Рто) и 1ТР (11е-Тйг-Рго) могут приготавливаться с помощью различных способов, включая химический синтез, ферментативный гидролиз и сбраживания растворов, содержащих белки.

Идентификация биологически активных пептидов в комплексных смесях, таких как гидролизаты белков, или жидкостях, образованных в результате брожения, является трудной задачей. Кроме основных вопросов, используем ли мы правильный белковый субстрат, используем ли мы правильный фермент, используем ли мы правильную микрокультуру, ожидается, что некоторые биологически активные пептиды могут присутствовать в комплексных образцах, которые содержат тысячи различных пептидов. Традиционные способы идентификации, использующие повторяющиеся циклы фракционирования с по

- 2 012972 мощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и биохимическое определение, обычно являются трудоемкими и подвержены к потерям присутствующих биологически активных пептидов, делая обнаружение соответствующей биологической активности крайне затруднительным. В настоящей работе было использовано довольно сложное оборудование и был проведен скрининг множества различных белковых гидролизатов и ферментационных бульонов, что в конечном итоге привело к идентификации нами двух новых пептидов МАР и ΙΤΡ, которые обладают свойствами в отношении ингибирования АСЕ. В нашем способе непрерывный биохимический анализ был связан в режиме реального времени с ВЭЖХ системой фракционирования. ВЭЖХ-элюат разделялся между непрерывного АСЕ биоанализа и способа химического анализа (масс-спектрометрия). Неочищенные гидролизаты и ферментационные бульоны разделялись посредством ВЭЖХ и далее наличие биологически активных компонентов определялось с помощью биохимического способа в режиме реального времени. Масс-спектр записывался непрерывно, в результате чего информация о структуре белков являлась легкодоступной, когда пептид демонстрировал положительный сигнал при биохимическом анализе.

Трипептиды МАР и ΙΤΡ, идентифицированные вышеуказанным способом, могут быть получены различными способами, включая экономически эффективные способы получения. Получение посредством химического синтеза является возможным при использовании традиционных способов, которые, к примеру, описываются в книге N. 8е^а1б апб Η.Ό. 1акиЬке Рерббез: Сйеш181гу апб Вю1оду (Еб§. \УПеуУСН Уегкщ СшЬН, 2002, Сйар1ег 4). В частности, экономически эффективные способы химического синтеза пептидов, пригодные для массового производства, основаны на применении алкилхлорформиатов или пивалоил хлорида для активации карбоксильной группы и связаны с применением сложных метиловых эфиров для защиты С-конца и бензилоксикарбонила (Ζ) или трет-бутилоксикарбонильных групп для защиты Ν-конца. Например, в случае МАР, Ь-пролина сложный метиловый эфир может связываться с ΖА1а, активированного изобутилхлорформиатом; итоговый дипептид может быть Ζ-де-защищен посредством гидрогенолиза при использовании водорода и Рб на С и соединен снова с Ζ-Ме!, активированного изобутилхлорформиатом; итоговый трипептид метилового эфира подвергается гидролизу при использовании Ν;·ιϋΗ и после Ζ-де-защиты посредством гидрогенолиза получается трипептид Ме1-А1а-Рго. Аналогичным образом может синтезироваться 11е-Т11г-Рго. но во время реакций связывания гидроксифункция Т11Г нуждается в защите бензилом; затем, на конечной стадии, эта группа синхронно исключается в процессе Ζ-де-защиты.

МАР и/или 1ТР могут также производиться путем ферментативного гидролиза или посредством ферментационных способов при использовании любого белкового субстрата, содержащего последовательности аминокислот МАР и/или 1ТР. Преимущественно белковый субстрат содержит оба фрагмента МАР и 1ТР. Предпочтительными белковыми субстратами для таких ферментативных или ферментационных способов являются коровье молоко или казеиновая фракция коровьего молока. Посредством оптимизации условий ферментации или гидролиза продукция биологически активных молекул МАР и/или 1ТР может быть максимально повышена. Специалист, пытающийся максимально увеличить продукцию, будет знать, каким образом устанавливать параметры процесса, такие как время гидролиза/ферментации, температура гидролиза/ферментации, тип фермента/микроорганизма и концентрация и др.

МАР и/или 1ТР или композиции, содержащие МАР и/или 1ТР, являются преимущественно продуктами гидролиза и предпочтительно изготавливаются по способу, включающему следующие стадии:

(a) ферментативный гидролиз пригодного белкового субстрата, содержащего МАР или 1ТР в их аминокислотной последовательности, что приводит к образованию гидролизованного белкового продукта, содержащего трипептиды МАР и/или 1ТР;

(b) отделение от гидролизованного белкового продукта фракции с высоким содержанием трипептида МАР и/или трипептида 1ТР; и необязательно (c) концентрирование и/или высушивание фракции, полученной по стадии Ь), для получения концентрированной жидкости или твердого вещества с высоким содержанием трипептида МАР и/или трипептида 1ТР.

Стадия ферментативного гидролиза (а) может представлять собой ферментативную обработку пригодного белкового субстрата, приводящую к гидролизу белка, что приводит к выделению МАР и/или 1ТР трипептидов. Несмотря на то что для высвобождения желаемых трипептидов из белкового субстрата могут использоваться различные ферментативные комбинации, предпочтительным ферментом, используемым в настоящем процессе, является пролин-специфичная эндопротеаза или пролин-специфичная олигопептидаза. Пригодным белковым субстратом может являться любой субстрат, содержащий аминокислотную последовательность МАР и/или 1ТР. Известными белковыми субстратами, содержащими МАР, являются, например, казеин, пшеница с высоким содержанием клейковины, белковый изолят подсолнечника, рисовый белок, яичный белок. Пригодные белковые субстраты предпочтительно включают последовательности аминокислот АМАР или РМАР, которые встречаются в бета-казеине коровьего молока, альфа-глиадиновой фракции пшеницы с высоким содержанием клейковины и в 28-фракции белкового изолята подсолнечника.

Казеиновым субстратом может быть любой материал, который содержит значительное количество бета-казеина или альфа-§2-казеина. Примерами пригодных субстратов являются молоко, а также казеин,

- 3 012972 порошок казеина, казеиновые порошковые концентраты, казеиновые порошковые изоляты, или бетаказеина или альфа-§2-казеина. Предпочтительно субстратом, который имеет высокое содержание казеина, является белковый изолят казеина (СР1).

Ферментом может быть любой фермент или комбинация ферментов, которые способны подвергать гидролизу белок, такой как бета-казеин и/или альфа-§2-казеин, что приводит к выделению одного или более трипептидов МАР и/или 1ТР.

Стадия отделения (Ь) может быть выполнена любым известным для специалиста из уровня техники способом, например путем преципитации, фильтрации, центрифугации, экстракции или посредством хроматографии или их комбинациями. Предпочтительно стадия отделения (Ь) выполняется при использовании способов микро- или ультрафильтрации. Размер пор мембран, используемый в стадии фильтрации, так же как и заряд мембран могут использоваться для регулирования отделения трипептида МАР и/или трипептида 1ТР. Фракционирование казеиновых белковых гидрализатов при использовании мембран ИЕ/ΝΕ описывается в Υ. РоПо! е! а1., 1оигиа1 о£ МетЬгапе 8с1еисе 158 (1999), 105-114.

Стадия концентрирования (с) может включать нанофильтрацию или выпаривание фракции, образованной по стадии (Ь) для получения высоко концентрированной жидкости. Если образованы подходящим образом, например, с низкой активностью воды (Ате), низким значение рН и предпочтительно при наличии консервантов, таких как бензоат или сорбат, такие концентрированные жидкие композиции формируются приемлемым способом при сохранности трипептидов изобретения. Необязательно, за стадией высушивания, например, путем сушки распылением или лиофильной сушки, следует стадия выпаривания для получения твердого вещества, содержащего высокие концентрации МАР и/или 1ТР.

Ферментативный процесс содержит предпочтительно одну стадию инкубации фермента. Ферментативный процесс настоящего изобретения, кроме того, относится к применению пролин-специфичной протеазы, которая предпочтительно не содержит загрязнения ферментативными активностями. Пролинспецифичная протеаза определяется как протеаза, которая подвергает гидролизу пептидную связь на карбоксиконцевом участке пролина. Предпочтительной пролин-специфичной протеазой является протеаза, которая гидролизует пептидную связь на карбоксиконцевом участке пролина и аланиновых остатках. Пролин-специфичная протеаза предпочтительно способна подвергать гидролизу крупные белковые молекулы, такие как полипептиды или сами белки. В целом, время инкубации по способу изобретения составляет менее 24 ч, предпочтительно время инкубации составляет менее 10 ч и более предпочтительно менее 4 ч. Температура инкубации обычно составляет выше 30°С, предпочтительно выше 40°С и более предпочтительно выше 50°С.

Другим аспектом настоящего изобретения является процесс очистки и/или отделения трипептидов МАР и 1ТР от гидролизованного белка. Большинство гидролизованных белков согласно изобретению предпочтительно способны выпадать в осадок при выбранных рН условиях. Этот процесс очистки включает изменение рН до рН, в результате чего большинство гидролизованных и негидролизованных белков осаждаются и отделяются осажденные белков от (биологически активных) трипептидов, которые остаются в растворе.

Для получения настоящих трипептидов с пролиновым остатком на карбоксиконцевом конце, применение протеазы, которая может расщепляться на карбоксиконцевом участке пролиновых остатков, отражает предпочтительное мнение. Так называемые пролилолигопептидазы (ЕС 3.4.21.26) обладают уникальной способностью предпочтительного расщепления пептидов с карбоксиконцевой стороны пролиновых остатков. Пролилолигопептидазы также обладают способностью расщеплять пептиды на карбоксильном конце остатков аланина, однако последняя реакция менее эффективна, чем расщепление пептидных связей, включающих пролиновые остатки. Во всех достаточно охарактеризованных пролинспецифичных протеазах, выделенных из млекопитающих, а также из микробных источников, идентифицирован уникальный домен, который не позволяет крупным пептидам приблизиться к активному сайту фермента. Также эти ферменты не способны расщеплять пептиды, содержащие более чем приблизительно 30 аминокислотных остатков, вследствие чего такие ферменты в настоящее время относятся к пролилолигопептидазам (Еи1ор е! а1. Се11, Уо1. 94, 161-170, 1и1у 24, 1998). Как следствие, для этих пролилолигопептидаз требуется проведение предварительного гидролиза с другими эндопротеазами перед тем, как они могут проявлять их гидролитическое действие. Однако, как описывается в АО 02/45523, даже комбинация пролилолигопептидазы с другой эндопротеазой приводит к образованию гидролизатов, отличающихся значительно увеличенным содержанием пептидов с карбоксиконцевым пролиновым остатком. Вследствие чего, такие гидролизаты образуют превосходное исходное положение для выделения трипептидов с АСЕ-ингибирующими действиями ίη уйго, а также повышенную устойчивость к разрушению протеолитическими ферментами в желудочно-кишечном тракте.

Термины «пептид» или «олигопептид» в рамках настоящего изобретения определены как цепи, содержащие по меньшей мере два аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. Термины «пептид» и «олигопептид» считаются синонимами (что соответствует общепринятому толкованию), и каждый из этих терминов может применяться вместо другого в зависимости от контекста. В рамках настоящего изобретения «полипептид» определен как цепь, содержащая более 30 аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности (олиго)пептидов и полипептидов записаны в настоящем па

- 4 012972 тенте слева направо в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в соответствии с общепринятой практикой. Буквенные коды аминокислот, используемые в изобретении, общеизвестны в технике и могут быть найдены в 8атЬгоок, ек а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогакогу Мапиа1, 2'¹ ей. Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогакогу, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогакогу Рге§8, Со1й 8ргтд НагЬог, ΝΥ, 1989). Смесь пептидов представляет собой композицию, содержащую не менее 30 мас.% (сухого вещества) пептидов, определенных способом определения азота К)е1йаЫ в сочетании с определением пептида, имеющего Μν менее 3500 Да.

Эндопротеаза определяется здесь как фермент, который гидролизует пептидные связи в полипептиде в эндофазе и принадлежит к группе ЕС 3.4. Эндопреотеазы подразделяются на подподклассы на основании каталитического механизма. Существуют подподклассы серинэндопротеаз (ЕС 3.4.21), цистеинэндопротеаз (ЕС 3.4.22), аспарагиновых эндопротеаз (ЕС 3.4.23), металлоэндопротеаз (ЕС 3.4.24) и треонинэндопротеаз (ЕС 3.4.25). Экзопротеазы определены здесь как ферменты, которые гидролизуют пептидные связи, расположенные рядом с концевой α-аминогруппой («аминопептидазы»), или пептидные связи между концевой карбоксильной группой и предпоследней аминокислотой («карбоксипептидазы»).

В \νϋ 02/45524 описаны пролин-специфичные протеазы, полученные из АкрегдШик шдег. Фермент, полученный из А. шдег, расщепляет предпочтительно на карбоксиконце пролина, но также может расщеплять на карбоксиконце гидроксипролина и, с более низкой эффективностью, на карбоксиконце аланина. В νθ 02/45524 также указано, что не существует гомологии между этим ферментом, полученным из А. шдег, и известной пролилолигопептидазой из другого микробного источника или млекопитающего. В отличие от известных пролилолигопептидаз, фермент из А. шдег имеет кислый оптимум рН. Несмотря на то что известные пролилолигопептидазы, а также фермент, полученный из А. шдег, являются так называемыми сериновыми протеазами, мы демонстрируем в настоящем изобретении (пример 1), что фермент из А. шдег принадлежит к Ье1опд§ ко а совершенно другому подсемейству. Секретируемый фермент из А. шдег, по-видимому, является членом семейства 828 сериновых пептидаз, а не семейства 89, в котором сгруппированы большинство цитозольных пролилолигопептидаз (Яа^Ипд Ν.Ό. апй Ваггекк, А.1.; ВюсЫт. Вюрйуз. Аска 1298 (1996) 1-3). В примере 2 показывается рН и температурный оптимумы пролинспецифичной протеазы, полученной из А. шдег. В примере 3 проиллюстрировано высокое преимущество полученной из А. шдег пролин-специфичной эндопротеазы в отношении расщепления карбоксиконца пролиновых и аланиновых остатков. Кроме того, нами продемонстрировано в этом примере, что ферментативный препарат, полученный из А. шдег, как используется в настоящем изобретении, является предпочтительно более чистым, означая, что не присутствует другая значимая эндопротеолитическая активность, чем эндопротеолитическая активность, присущая чисто пролин-специфичной эндопротеазе. Нами также продемонстрировано, что ферментативный препарат, полученный из А. шдег предпочтительно используемый согласно настоящему изобретению, не включает какие-либо экзопротеолитические, в особенности аминопептидолитические побочные активности. Предпочтительно экзопротеолитическая активность отсутствует в ферментативном препарате, полученном из А. шдег, используемом в способе изобретения. Экспериментальное подтверждение того, что пролин-специфичная эндопротеолитическая активность фактически отсутствует в нерекомбинантных штаммах АкрегдШик может быть найдено в νθ 02/45524 и также проиллюстрировано в примере 3 настоящего патента. Поскольку осуществление способа настоящего изобретения возможно посредством инкубации казеинового субстрата только с пролин-специфичной эндопротеазой, условия для оптимальной инкубации, такие как температура, рН и др., могут быть без труда подобраны и не должны фиксироваться на недостаточно оптимальных условиях, как это может быть в случае, если используются два или более фермента. Более того, предотвращается образование нежелательных побочных продуктов, как, например, дополнительных, не биологически активных пептидов или свободных аминокислот, приводящих к постороннему вкусу бульона. Обладание большими степенями свобод в выборе условий реакции делает более легким выбор других возможных критериев. Например, более легким является выбор условий, которые менее чувствительны к микробным инфекциям и к оптимизированным рН условиям относительно дальнейших стадий осаждения белков. В примере 4 мы демонстрируем, что фермент из АкрегдШик является не олигопептидазой, а настоящей эндопептидазой, способной гидролизовать интактные белки, крупные пептиды, а также более мелкие пептидные молекулы, без необходимости в присутствии дополнительно эндопротеазы. Это новое и неожиданное открытие открывает возможность применения фермента из А. шдег для приготовления гидролизатов с беспрецедентно высокими содержаниями пептидов с карбоксиконцевым пролиновым остатком, поскольку не требуется дополнительной эндопротеазы. Такие новые гидролизаты могут быть приготовлены из различных белковоподобных исходных материалов, происходящих из овощей и животных. Примерами таких исходных материалов являются казеины, желатин, рыбьи или яичные белки, пшеница с высоким содержанием клейковины, соевый и гороховый белки, а также рисовый белок и белок подсолнечника. Поскольку известно, что натрий играет важную роль в гипертензии, предпочтительные субстраты для продукции пептидов, обладающих способностью ингибирования АСЕ, представляют собой кальций и калий, а не соли натрия этих белков.

Оптимум рН пролилэндопротеаз, полученных из А. шдег составляет около 4,3 (см. фиг. 1). Из-за такого низкого оптимума рН инкубирование казеина коровьего молока с пролилэндопротеазой из А. шдег не является очевидным. Казеин коровьего молока будет выпадать в осадок, если рН опустится ниже

- 5 012972

6,0, но при рН, равном 6,0, фермент из А. шдет обладает только ограниченной активностью. Однако в примере 5 показано, что даже при таком неблагоприятном условии при инкубировании с полученной из А. шдет пролилэндопротеазой можно привести к образованию некоторых известных пептидов, обладающих способностью ингибировать АСЕ, таких как ΙΡΡ и ЬРР. Достаточно неожиданно, что при таких условиях не синтезировались УРР. Казеин коровьего молока объединяет ряд различных белков, включая бета-казеин и каппа-казеин. Согласно известным аминокислотным последовательностям бета-казеин включает трипептиды ΙΡΡ, УРР и ЬРР, ингибирующие АСЕ. Каппа-казеин включает только ΙΡΡ. Тот факт, что фермент, полученный из А. шдет, не обладает какой-либо измеряемой аминопептидазной активностью, убедительно указывает, что сформированный ΙΡΡ высвобождается из -А107-108-Р109-Р110последовательности, присутствующей в каппа-казеине. По-видимому, пептидная связь карбоксиконца ΙΡΡ расщепляется посредством основной активности полученной из А. шдет пролилэндопротеазы, тогда как расщепление предыдущей А1а-Пе связи осуществляется А1а-специфичной концевой активностью. Аналогично, отсутствие УРР может объясняться, исходя из отсутствия аминопептидазной концевой активности. УРР содержится в бета-казеине в последовательности -Р₈₁-У₈₂-У₈₃-У₈₄-Р₈₅-Р₈₆-. Таким образом, пролин-специфичная эндопротеаза удаляет последовательность УУУРР, но не способна отщеплять УРР.

Эти результаты были получены путем инкубирования казеина с эндопротеазой, полученной из А. шдет, в простом одностадийном бепуеб ферментативном способе. Водные растворы, содержащие белок, высоко чувствительны к микробным инфекциям, особенно если хранятся в течение многих часов при значениях рН выше 5,0 и при температуре 50°С или ниже. В особенности микробные токсины, которые могут образовываться в течение таких длительных инкубационных стадий и которые способны сохраняться при последующих стадиях нагревания и образовывать потенциальную угрозу пищевым процессам. По настоящему изобретению предпочтительно применяется температура инкубации выше 50°С. В сочетании с одностадийным ферментативным способом, в котором инкубация фермента осуществляется в течение периода менее чем 24 ч, предпочтительно менее 8 ч, более предпочтительно менее 4 ч, способ изобретения дает преимущество повышенной к воздействию микроорганизмов. Используя настоящее соотношение фермент-субстрат в сочетании с высокими температурными условиями, удаление ΙΡΡ и ЬРР завершается в з-часовой инкубационный период.

Поскольку АСЕ-ингибирующие пептиды ΙΡΡ и ЬРР могут быть удалены из казеина при использовании одной практически очищенной эндопротеазы, осуществление способа настоящего изобретения приводит к образованию малых количеств растворимых в воде пептидов, чем при осуществлении способов, известных из уровня техники. Среди таких водорастворимых пептидов ΙΡΡ и ЬРР присутствуют в больших количествах. Это является особенно значимым в случае высоких концентраций трипептидов, ингибирующих АСЕ, которые требуются без многих других, часто менее активных соединений.

Согласно настоящему способу предпочтительно не менее 20%, более предпочтительно не менее 30%, наиболее предпочтительно не менее 40% -Ι-Ρ-Ρ- или -Ь-Р-Р-последовательности, присутствующей в белке, превращено в трипептид ΙΡΡ или ЬРР соответственно.

В примере 6 показана пятикратная степень очистки биоактивных пептидов путем новой и удивительной стадии очистки. Основа такого способа очистки формируется на основании уникальных свойств пролин-специфичной эндопротеазы из А. шдег. Инкубация с этим ферментом высвобождает наиболее биоактивные части субстратной молекулы в виде водорастворимых трипептидов. Не- или наименее биоактивные части субстратной молекулы сохраняются во многом в нерасщепленном и, следовательно, наиболее крупных пептидных или полипептидных частях субстратных молекул. Вследствие ограниченной водной растворимости этих более крупных пептидных или полипептидных частей при выбранных условиях рН, эти не- или наименее биоактивные части субстратной молекулы без труда отделяются от намного более растворимых биоактивных трипептидов. В этом процессе исходный гидролизат формируется во время короткого ферментативного инкубационного периода при 55°С, рН 6,0 и затем, необязательно, нагревается до температуры выше 80°С для уничтожения всех заражающих микроорганизмов и для инактивации полученной из А. шдет пролилэндопептидазы. Затем гидролизат подкислялся для достижения снижения рН до 4,5 или по меньшей мере ниже 5,0. При таком значении рН, которое не может использоваться для инактивации полученной из А. шдет пролин-эндопептидазы, поскольку является оптимальным условием для фермента, все крупные пептиды из казеинового осадка, таким образом, только более мелкие пептиды остаются в растворе. Как осажденные казеинаты могут быть без труда удалены путем декантации или стадии фильтрации или центрифугирования при низкой скорости (т.е. ниже 5000 грт), водная фаза содержит высокие пропорции биоактивных пептидов относительно количества присутствующего белка. Согласно данным К)е1ба111 от 80 до 70% казеината белка удаляется посредством стадии низкоскоростного центрифугирования, которая предполагает 4-5-кратную очистку АСЕ ингибирующих пептидов. Нами обнаружено, что такой принцип очистки может успешно применяться для получения биологически активных пептидов, полученных из белковоподобного материала, кроме казеина. Также не только ферментативно синтезированные гидролизаты, но и белки, которые сбраживаются пригодными микроорганизмами, могут быть отделены и очищены в соответствии со способом настоящего изобретения. Инкубация фермента и субстрата при значении рН, близком к таковому, при котором субстрат будет осаждаться и фермент будет сохранять активность, будет обеспечивать данную стадию очи

- 6 012972 стки. Благодаря низкому оптимуму рН пролилэндопротеазы, могут рассматриваться субстратные преципитаты в диапазоне значений рН от 1,5 до 6,5. Учитывая специфическую реакцию осаждения, глютен осаждается при рН выше 3,5, белок подсолнечника осаждается при рН выше 4,0 и ниже 6,0, яичный белок осаждается при рН выше 3,5 и ниже рН 5,0, при этом образуются примеры условий, с помощью которых гидролизованные белковые преципитаты и осажденные белки могут отделяться от гидролизованных белков или пептидов.

После декантации, фильтрации или низкоскоростного центрифугирования супернатанты, содержащие биологически активные пептиды, могут быть удалены в очищенном состоянии. Последующее испарение и стадия сушки распылением будут образовывать экономичный способ для получения пищевого состава или порошка с высокой биоактивностью. При расщеплении казеинатов в соответствии со способом, который описывается, образуется белый и без запаха порошок с высоким содержанием пептидов, ингибирующих АСЕ. Альтернативно могут применяться выпаривание и нанофильтрация для дальнейшего концентрирования биоактивных пептидов. Правильный состав концентрируется путем увеличения активности воды (Ате) в сочетании с регулированием рН и добавление пищевых консервантов, таких как бензоат или сорбат, приведет к образованию устойчивых к действию микроорганизмов, пищевых жидких концентрированных пептидов, снижающих кровяное давление. Если должным образом разбавить до правильной трипептидной концентрации, универсальный исходный материал получается пригодным для наделения всех видов продуктов питания и напитков свойствами ингибирования АСЕ. При необходимости, супернатант, полученный после декантации, фильтрации или низкоскоростного центрифугирования, может в дальнейшем подвергаться обработке для улучшения вкусовых качеств итогового продукта. Например, супернатант может вступать в реакцию с порошкообразным активированным углем, с последующей стадией фильтрации для удаления угля. Для уменьшения горечи итогового продукта супернатант, полученный после декантации, фильтрации или низкоскоростного центрифугирования, также может использоваться для инкубации с другой протеазой, такой как субтилизин, трипсин, нейтральная протеаза или глутамат-специфичная эндопротеаза. При необходимости, концентрация биоактивных ингредиентов МАР и/или ΙΤΡ может повышаться в дальнейшем путем последовательных стадий очистки, в которых целью является приготовление специфичного гидрофильного/гидрофобного свойства трипептидов МАР и ΙΤΡ. Предпочтительные способы очистки включают нанофильтрацию (разделение по размеру), экстракцию, например, гексаном или бутанолом, за которой следует выпаривание/осаждение или взаимодействие подкисленного гидролизата, который получен с хроматографическими смолами из класса АшЬегШе ХАО (Коейт). Также могут применяться бутилсефарозные смолы, которые обеспечиваются РйагшаДа.

В примере 7 описывается идентификация новых пептидов МАР и ΙΤΡ, ингибирующих АСЕ, в казеиновом гидролизате, полученных при использовании пролин-специфичной эндопротеазы, полученной из А. шдег, в сочетании с новым способом очистки пептидов. Только применение такой одной (фактически чистой) эндопротеазы в сочетании с большим процентом небиоактивных пептидов и высокосложное оборудование для отделения и идентификации позволили нам выявить и идентифицировать эти новые трипептиды, обладающие способностью ингибировать АСЕ. В полученных из казеина биоактивных пептидах (СОВАР), приготовленных по примеру 7 (после осаждения), были идентифицированы трипептиды МАР и 1ТР в количествах, равняющихся 2,9 мг МАР/г СОВАР (4,8 мг МАР/г белка в СОВАР) и 0,9 мг 1ТР/г СОВАР (1,4 мг 1ТР/грамм белка в СОВАР). Кроме того, характеристикой для СОВАР является их чрезвычайно высокое пролиновое содержание в 24% по молярному значению. Тесты, описанные в примере 7, иллюстрируют очень низкие значения 1С₅₀ для двух новых трипептидов в модифицированном тесте Майш, т.е. 0,5 мкмоль/л для МАР и 10 мкмоль/л для 1ТР. Эти данные являются еще более удивительными, если мы осознаем, что 1РР, один из наиболее эффективных известных натуральных пептидов, ингибирующих АСЕ, имеет значение 1С₅₀, полученное в модифицированном тесте Майш, равное 2,0 мкмоль/л.

В соответствии с настоящим способом предпочтительно не менее 20%, более предпочтительно не менее 30%, наиболее предпочтительно не менее 40% последовательности -М-А-Р- или -Ι-Τ-Р-, присутствующей в белке, преобразовывается в трипептид МАР или ГРР соответственно.

Применимость недавно идентифицированных пептидов МАР и ΙΤΓ, ингибирующих АСЕ, в дальнейшем иллюстрируется в примере 8. В последнем примере показывается, что оба пептида успешно сохраняются в инкубационных условиях, искусственно воспроизводящих условия пищеварения, типично созданные в желудочно-кишечном тракте. На основании этого мы сделали заключение, что новые трипептиды способны сохраняться в желудочно-кишечном тракте млекопитающего (например, человека), что подразумевает значительный экономический потенциал при применении для лечения гипертензии.

В примере 9 продемонстрировано, что лучший АСЕ-ингибирующий пептид МАР может быть синтезирован не только в экспериментах ферментативного гидролиза, но также выявляется в молочных препаратах, подвергнутых ферментации соответствующими пищевыми микроорганизмами. Однако мы не смогли продемонстрировать присутствие пептида ГРР в таком продукте, подвергнувшемся ферментации.

Пептиды МАР и/или ΙΤΓ, полученные либо перед, либо после дополнительных, например, стадий хроматографической очистки, могут использоваться для включения в продукты питания, которые широ

- 7 012972 ко потребляются регулярно. Примерами таких продуктов являются маргарины, жиры, различные молочные продукты, такие как масло или йогурты либо молоко или напитки, содержащие молочную сыворотку. Несмотря на то что такие композиции обычным образом поступают в организм человека, они также могут применяться для животных, предпочтительно млекопитающих, для облегчения гипертензии. Кроме того, содержание в продуктах ингибиторов АСЕ в высоких концентрациях делает эти продукты пригодными для включения их в диетические добавки в виде пилюль, таблеток, или высококонцентрированных растворов, или паст, или порошков. Медленно высвобождающиеся диетические добавки, которые обеспечат непрерывное высвобождение пептидов, ингибирующих АСЕ, представляют особый интерес. Пептиды МАР и/или ΙΤΡ согласно изобретению могут иметь форму сухого порошка, например пилюли, таблетки, гранулы, саше или капсулы. Альтернативно, ферменты согласно изобретению могут иметь форму жидкости, например в сиропе или капсуле. Композиции, использующие различные формы и содержания ферментов, согласно изобретению также включают по меньшей мере одно соединение группы, состоящей из физиологически пригодного носителя, адъюванта, наполнителя, стабилизатора, буфера и растворителя, где термины используются в их обычных смыслах для определения субстанций, которые участвуют в сборке, доставке, поглощении, стабилизации или, в случае адъюванта, для повышения физиологического эффекта ферментов. Соответствующие фоновые значения различных соединений, которые могут использоваться в сочетании с ферментами согласно изобретению в порошковых формах, могут быть найдены в Рйагтасеибса1 Эо^аде Еогтз, второе издание, Уо1. 1-3, Ι8ΒΝ 0-8247-8044-2 Магсе1 Оскксг. Шс. Несмотря на то что пептиды, ингибирующие АСЕ, согласно изобретению имеющие форму сухого порошка, могут храниться в течение достаточно долгого времени, контакт с увлажнителем или влажным воздухом должен избегаться путем выбора пригодной упаковки, такой как, например, алюминиевый блистер. Относительно новыми формами для перорального применения являются применение различных типов желатиновых капсул или таблеток на желатиновой основе.

Принимая во внимание значимость природных пептидов, ингибирующих АСЕ, в борьбе с гипертензией, настоящий новый и экономически эффективный способ обеспечивает привлекательную отправную точку для пищевых и даже ветеринарных продуктов, обладающих умеренно гипотензивным действием. Поскольку настоящий способ также включает удивительно простую стадию очистки, то возможности концентрированных диетических добавок снижать кровяное давление увеличиваются.

Под пролин-специфичной эндопротеазой настоящего изобретения или примененной по настоящему изобретению подразумевается полипептид, упомянутый в пп.1-5, 11 и 13 формулы изобретения заявки \νϋ 02/45524. Следовательно, эта пролин-специфичная эндопротеаза представляет собой полипептид, который обладает пролин-специфичной эндопротеолитической активностью, выбранный из группы, состоящей из:

(a) полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью, которая по крайней мере на 40% идентична аминокислотной последовательности, включающей аминокислоты с 1 по 526 из 8Е0 ΙΌ N0:2 или ее фрагменту;

(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях пониженной жесткости с (1) последовательностью нуклеиновых кислот 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагментом, который идентичен не менее чем на 80 или 90% на участке более 60, предпочтительно более 100 нуклеотидов, более предпочтительно идентичен не менее чем на 90% на участке более 200 нуклеотидов, или (ίί) последовательностью нуклеиновых кислот, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот 8Е0 ΙΌ N0:1. Последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:2 соответствуют приведенным в ν0 02/45524. Полипептид предпочтительно присутствует в изолированной форме.

Предпочтительный полипептид, используемый по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 50%, предпочтительно не менее чем на 60%, предпочтительно не менее чем на 65%, предпочтительно не менее чем на 70%, более предпочтительно не менее чем на 80%, еще более предпочтительно не менее чем на 90%, наиболее предпочтительно не менее чем на 95% и даже еще более предпочтительно не менее чем приблизительно на 97% идентична аминокислотам с 1 по 526 из 8Е0 ΙΌ N0:2 или содержащей аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2.

Полипептид предпочтительно кодируется полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях пониженной жесткости, более предпочтительно в условиях средней жесткости и наиболее предпочтительно в жестких условиях с (1) последовательностью нуклеиновых кислот 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагментом или (ίί) последовательностью нуклеиновых кислот, которая комплементарна последовательности нуклеиновых кислот 8Е0 ΙΌ N0:1.

Термин «способный гибридизоваться» означает, что целевой полинуклеотид по настоящему изобретению может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, используемой в качестве зонда (например, с последовательностью нуклеотидов, приведенной в 8Е0 ΙΌ N0:1, или ее фрагментом или комплементом 8Е0 ΙΌ N0:1) на уровне, значительно превосходящем фоновый. Изобретение также включает полинуклеотиды, которые кодируют пролин-специфичную эндопротеазу по настоящему изобретению, а также нуклеотидную последовательность, ей комплементарную. Нуклеотидная последовательность может представлять собой РНК или ДНК, включая геномную ДНК, синтетическую ДНК или кДНК. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой ДНК и наиболее предпочтительно после

- 8 012972 довательность геномной ДНК. Как правило, полинуклеотид по настоящему изобретению содержит непрерывную последовательность нуклеотидов, которая способна селективно гибридизоваться с кодирующей последовательностью или комплементом кодирующей последовательности 8ЕО ΙΌ N0:1. Такие нуклеотиды могут быть синтезированы хорошо известными из уровня техники способами.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может гибридизоваться с кодирующей последовательностью или комплементом кодирующей последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 на уровне значительно выше фонового. Фоновая гибридизация может иметь место, например, из-за того, что другая кДНК представлена в библиотеке кДНК. Уровень сигнала, генерируемого взаимодействием между полинуклеотидом по настоящему изобретению и кодирующей последовательностью или комплементом кодирующей последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, как правило, не менее чем в 10 раз, предпочтительно не менее чем в 20 раз, более предпочтительно не менее чем в 50 раз и еще более предпочтительно не менее чем в 100 раз превосходит по интенсивности уровень взаимодействия между другими полинуклеотидами и кодирующей последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1. Интенсивность взаимодействия может быть измерена, например, внесением в зонд радиоактивной метки, например 32Р. Селективная гибридизация, как правило, может быть достигнута при использовании условий пониженной жесткости (0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при температуре около 40°С), условий средней жесткости (например, 0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при температуре около 50°С) и жестких условий (например, 0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при температуре около 60°С).

Пакет υ\νθί.Ό предоставляет программу ΒΕ8ΤΡΙΤ, которая может применяться для вычисления идентичности (например, используя ее установки по умолчанию).

Алгоритмы РГБЕИР и ВБА8Т N также могут быть использованы для вычисления идентичности последовательностей или для сравнения последовательностей (как, например, для идентификации эквивалентных или аналогичных последовательностей, например при установках по умолчанию).

Программное обеспечение для осуществления анализа ВБА8Т доступно всем желающим через Национальный центр биотехнологической информации (ййр://те^ет.псЫ.и1т.и1й.доу/). Этот алгоритм включает, во-первых, идентификацию пар последовательностей с высокой степенью соответствия (Н8Р§) путем идентификации коротких наборов символов длины ν в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют определенному положительному пороговому значению Т при сравнении с набором символов той же длины в базе данных последовательностей. Т называют пороговым значением близости набора символов. Эти первоначальные совпадения близких наборов символов действуют в качестве отправной точки для инициирования поиска с целью обнаружения содержащих их Н8Р§. Совпадения наборов символов расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может быть увеличено общее количество соответствий. Расширение в каждом из направлений для поиска совпадения набора символов прекращается в случае, если: общее количество соответствий уменьшается на число X по сравнению с максимальным достигнутым значением; общий счет соответствий доходит до нуля или ниже за счет накопления одной или нескольких групп остатков, вносящих отрицательный счет; или если достигнут конец любой из последовательностей. Параметры алгоритма ВБА8Т V, Т и X определяют чувствительность и скорость сверки. В программе ВБА8Т по умолчанию используется длина набора символов (V), равная 11, матрица подсчета соответствий ВЬ08ИМ62 (В), равная 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм ВБА8Т осуществляет статистический анализ подобия между двумя последовательностями. Одной из мер подобия, предоставляемых алгоритмом ВБА8Т, является наименьшая суммарная вероятность (Р(Щ), показывающая вероятность, с которой совпадение между двумя последовательностями нуклеотидов или аминокислот может появиться случайно. Например, считается, что последовательность подобна другой последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности со второй последовательностью менее чем приблизительно 1, предпочтительно менее чем приблизительно 0,1, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,001.

Штаммы рода АкрегдШик имеют статус пригодных для употребления в пищу, причем известно, что ферменты, выделенные из этих микроорганизмов, получены из источника, несомненно пригодного для употребления в пищу. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения фермент секретируется продуцирующей его клеткой, а не является не секретируемым, так называемым цитозольным или периплазматическим ферментом. Таким образом, ферменты могут быть повторно получены из клеточного бульона в основном в чистом состоянии, без дорогостоящих стадий очистки. Фермент предпочтительно имеет высокое сродство к своему субстрату при широко распространенных значениях рН и температурных условиях.

Описание чертежей

Фиг. 1 - графическое представление оптимального значения рН пролин-специфичной эндопротеазы, выделенной из А. шдег.

Фиг. 2 - профильная специфичность пролин-специфичной эндопротеазы, выделенной из А. шдег.

Фиг. 3 - δΌδ-РАОЕ интактного овальбумина и синтетического 27-мерного пептида после инкубации с очищенной хроматографией пролин-специфичной эндопротеазой, выделенной из А. шдег.

- 9 012972

Материалы и методы

Материалы.

Пригодный к употреблению в пищу раствор казеината калия (88%) был получен от ΌΜν 1ШсгпаΙίοηαΐ. Т11С №111сг1апб5. Синтетические хромогенные пептиды были получены либо от Рерксап 8у51ет5 Β.ν. Т11е №111ег1апб5. либо от Васйет. 8\\йхег1апб.

Пролин-специфичная эндопротеаза из А. №дет.

Сверхсинтез пролин-специфичной эндопротеазы из АкрегдШик шдег проводили. как описано в \νϋ 02/45524. Активность фермента испытывали на синтетическом пептиде Ζ-Ο1π-Ρτο-ρΝΑ при 37°С в буфере цитрат/динатрийфосфат рН 4.6. За продуктом реакции наблюдали спектрофотометрически при 405 нм. Единица определена как количество фермента. которое способствует выделению 1 мкмоль пнитроанилида в минуту при указанных тестовых условиях.

Хроматографическая очистка эндопротеазы. полученной из А. №дег.

Культуральный бульон. полученный из сверхсинтезирующего штамма А. шдег. использовался для хроматографической очистки протеазы для удаления любых контаминирующих эндо- и экзопротеолитических активностей. Для этого ферментационный бульон был сначала центрифугирован для удаления основной грибковой массы и супернатант был в дальнейшем пропущен через ряд фильтров с уменьшающимися размерами пор для удаления всех клеточных фрагментов. В итоге. полученный ультрафильтрат разбавлялся десятикратно в 20 ммоль/л ацетате натрия с рН 5.1 и вносился в колонку рЗерйагоке ЕЕ. Белки извлекались в градиенте от 0 до 0.4 моль/л №С1 в 20 ммоль/л ацетате натрия с рН 5.1. Пиковые фракции. проявляющие активность по отношению к расщеплению Ζ-С1у-Ρ^ο-ρNΑ. были собраны и объединены. в соответствии с протоколом. описанным в νοτ16 1оигпа1 οί МюгоЬю1оду & Βίο1ес11по1оду 11. 209-212 (1995). но при незначительно модифицированных условиях анализа. Учитывая кислотный оптимум рН пролин-специфичной эндопротеазы. полученной из А. шдег. ферментативный анализ осуществлялся при рН 4.6 в цитрат/дифосфатном буфере при 37°С. Объединяя активные фракции. с последующим концентрированием. полученный в итоге препарат показывал только простую полосу на 8Э8-РАОЕ и один пик на НР-8ЕС. Дальнейший анализ путем гидрофобной хроматографии подтвердил чистоту полученного ферментного препарата.

Анализ ЖХ/МС/МС. применяемый для определения ΙΡΡ. БРР и νΡΡ.

Для количественного определения в белковом ферментативном гидролизате представляющих интерес пептидов. в числе которых ΙΡΡ. БРР и νΡΡ. полученных при действии смеси ферментов по настоящему изобретению. применяли ВЭЖХ. использующую масс-спектрометр с ионной ловушкой (ТйегтосщеЧ®. Вгеба. 111е №1йег1апб8). соединенный с насосом Р4000 (Тйегтоциек!®. Вгеба. 111е №111ег1апб5). Полученные пептиды разделяли при использовании колонки 1пебы1 3 ΟΌ8 3.3 мкм. 150x2.1 мм (Уапап Ве1дшт. Ве1дшт) в сочетании с градиентом 0.1% муравьиной кислоты в Μί11ί О \\'а(ег (М1Шроге. ВебГогб. МА. И8А; раствор А) и 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор В) для элюирования. Градиент начинали с 100% раствора А. сохраняя в течение 5 мин. увеличивая линейно до 5% раствора В в течение 10 мин. с последующим линейным увеличением до 45% раствора В в течение 30 мин и немедленно возвращаясь к начальным условиям. и сохраняя в течение 15 мин для стабилизации. Вводимый объем составлял 50 мкл. скорость потока равнялась 200 мкл/мин и температуру колонки поддерживали на уровне 55°С. Концентрация белка во вводимом образце составляла приблизительно 50 мкг/мл.

Подробную информацию об отдельных пептидах получали. применяя специальный МС/МС алгоритм для пептидов. представляющих интерес. при использовании оптимальной энергии столкновения около 30%. Количественное определение отдельных пептидов осуществлялось. используя внешнюю калибровку. путем применения наиболее многочисленных заряженных фрагментов. наблюдаемых в МС/МС методе.

Трипептид БРР (М=325.2) использовался для регулировки оптимальной чувствительности алгоритма МС и оптимальной фрагментации в способе МС/МС. выполняя постоянное введение 5 мкг/мл. что приводит к образованию протонированной молекулы в МС алгоритме и оптимальной энергии столкновения около 30% в МС/МС алгоритме. образуя В- и Υ-ионные серии.

До проведения ЖХ/МС/МС ферментные белковые гидролизаты центрифугировались при комнатной температуре и 13000 грт в течение 10 мин. фильтровались через 0.22 мкм фильтр и супернатант разбавлялся 1:100 Μί11ίΟ водой.

Определение азота по К)е1баЫ.

Содержание общего азота способом Ц)е1баЫ измерялось путем анализа методом впрыскивания в поток. Используя систему ТесаЮг Е1А8ТАР 5000. оснащенную кассетным методом ΈΚΝ 5000-040. компьютером Репбит 4 с программным обеспечением 8ОЕ1А и автодозатором ТесаЮг 5027. аммоний. высвобождающийся из раствора. содержащего белки. определялся при длине волны 590 нм. Количество образца. соответствующего динамическому диапазону способа (0.5-20 мг Ν/л). помещалось в пищеварительную трубку вместе с 95-97% серной кислотой и таблетки 1<)е11аЬ подвергались действию пищеварительной программы в течение 30 мин при 200°С. с последующим воздействием в течение 90 мин при 360°С. После введения в систему Е1А8ТАК 5000 измерялся пик азота. по которому можно судить о ко

- 10 012972 личестве измеренного белка.

Аминокислотный анализ.

Точно взвешенный образец белковоподобного материала растворялся в разбавленной кислоте и осадок удалялся путем центрифугирования в центрифуге ЕррепбогТ. Аминокислотный анализ выполнялся на чистом супернатанте в соответствии со способом Р1соТад, как определено в руководстве по эксплуатации системы для аминокислотного анализа \Уа1егз (МбТогб МА, И8А). Для этого пригодный образец был получен из жидкости, затем высушен и подвергнут паровой фазе кислотного гидролиза и дериватизирован, используя фениловый эфир изотиоциановой кислоты. Содержание различных дериватизированных аминокислот определялось, используя способы ВЭЖХ, и суммировалось для определения общего уровня свободных аминокислот во взвешенном образце. Аминокислоты Суз и Т1р не включались в результаты, полученные при этом анализе.

Степень гидролиза (ПН) белкового гидролизата измерялась при использовании теста ОРА и рассчитывалась, как описано №е1зеп е! а1. (ΙΡ8, Уо1. 66, № 5, 642-646, 2001).

Расчет молекулярной массы пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах.

Анализ распределения размера частиц протеазы, обработанной белковыми образцами, осуществлялось на автоматизированной системе ВЭЖХ, оснащенной насосом высокого давления, устройством введения, способным вводить 10-100 мкл образца, и УФ-детектором, способным контролировать элюент при 214 нм.

Колонкой, используемой для этого анализа, была колонка 8ирегбех Рерббе НК 10/300 СЬ (Атегз11ат). уравновешенная 20 мМ фосфатом натрия/250 мМ хлоридом натрия буфером с рН 7,0. После введения образца (обычно 50 мкл) различные компоненты извлекались из колонки буфером в течение 90 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. Система калибровалась, используя смесь цитохрома С (молекулярная масса 13500 Да), апротинина (молекулярная масса 6510 Да) и тетраглицина (молекулярная масса 246 Да) в качестве маркеров молекулярной массы.

Пример 1.

Фермент, полученный из А. шдег, представляет собой новый класс пролин-специфичных ферментов.

Из всей кодирующей последовательности пролин-специфичной эндопротеазы, получаемой из А. шдег, которая описана в \УО 02/45524, может быть определена белковая последовательность из 526 аминокислот. Новизна фермента подтверждена с помощью баз данных для поиска ВЬА8Т, таких как 8х13зРго1, Р1К и 1гЕМВЬ. К удивлению авторов не удалось обнаружить явной гомологии между ферментом А. шдег и известными пролилолигопептидазами. Более тщательное исследование аминокислотной последовательности выявило, однако, низкую, но значимую, степень гомологии с карбоксипептидазами Рго-Х (ЕС3.4.16.2), дипептидиламинопептидазами I (ЕС3.4.14.2) и специфичной для тимуса серинпротеазой. Все эти ферменты отнесены к семейству серинпептидаз 828. Также, у всех этих ферментов и эндопротеазы А. шдег сохранена конфигурация Сх8УхС вокруг активного сайта серина. Кроме того, члены семейства 828 имеют кислотный рН-оптимум, обладают специфичностью в отношении расщепления с карбоксиконцевой стороны пролиновых остатков и синтезируются с сигнальной последовательностью и пропептидом, точно так же как пролин-специфичная эндопротеаза, вырабатываемая А. шдег. Также размер фермента А. шдег сходен с размером членов семейства 828. Следовательно, пролин-специфичная эндопротеаза А. шдег, по-видимому, является членом семейства серинпротеаз 828, а не семейства 89, в котором сгруппировано большинство цитозольных пролилолигопептидаз, включая фермент, выделенный из Е1ауоЬае1егшт тешпдозерйеит. На основе этих структурных и физиологических особенностей мы пришли к выводу, что фермент А. шдег принадлежит к семейству 828, а не к семейству серинпротеаз 89. Еще одной особенностью, которая отличает фермент А. шдег от пролилолигопептидаз, принадлежащих к семейству 89, является то, что в отличие от цитозольных пролилэндопротеаз, принадлежащих к последнему семейству, недавно идентифицированный фермент А. шдег секретируется в ростовую среду. Настоящая заявка является первым сообщением о выделении члена семейства 828 из низших эукариотов и описанием его характеристик.

Пример 2.

Оптимальные значения рН и температуры пролин-специфичной эндопротеазы, полученной из А. шдег.

Для установления оптимального значения рН пролин-специфичной эндопротеазы, вырабатываемой А. шдег, приготавливали буферные растворы с различными значениями рН. Буферные растворы с рН 4,04,5-4,8-5,0-5,5 и 6,0 получали, используя 0,05 моль/л ацетата №1 и 0,02М СаС1₂; буферные растворы с рН 7,0 и 8,0 получали, используя 0,05 М буферы Тпз/НСТ содержащие 0,02 М СаС1₂. Значения рН регулировали, используя уксусную кислоту и НС1 соответственно. В качестве субстрата использовали хромогенный синтетический пептид 2-С1и-Рго-рПА. Буферный раствор, раствор субстрата и предварительно разбавленную эндопротеазу (с активностью 0,1 Ед/мл) нагревали точно до температуры 37,0°С на водяной бане. После перемешивания за протеканием реакции наблюдали спектрофотометрически при длине волны 405 нм и температуре 37,0°С в течение 3,5 мин, осуществляя измерения каждые 0,5 мин. Из результатов, показанных на фиг. 1, ясно, что пролин-специфичная эндопротеаза, вырабатываемая А. шдег, имеет

- 11 012972 оптимальное значение рН около 4.

Кроме этого, устанавливали температурный оптимум пролилэндопротеазы. С этой целью очищенные препараты фермента инкубировали в 0,1 моль/л ацетате Ыа, содержащем 0,02 моль/л СаС1₂ при рН 5,0 в течение 2 ч при различных температурах, используя в качестве субстрата Казеин Резоруфин (Косйе усгмоп 3), и количественно определяли ферментную активность путем измерения при длине волны 574 нм. Согласно полученным результатам, пролин-специфичная эндопротеаза из А. шдег имеет температурный оптимум около 50°С.

Пример 3.

Специфичность и чистота пролин-специфичной протеазы, полученной из А. шдег.

Исходные, так же как и хроматографически очищенные ферментные образцы, полученные из штамма А. шдег, содержащие множественные копии полигенного экспрессирующего кластера (\νϋ 02/45524), были протестированы против набора хромогенных пептидных субстратов для определения специфичности кодированной эндопротеазы. Используя различные наборы хромогенных пептидов, определялось наличие возможного загрязнения ферментативной активности. Эндопротеолитическая специфичность кодированной эндопротеазы тестировалась на различных ΑΙα-ΑΙα-ΧρΝΑ (ΑΑΧρΝΑ) субстратах. В данном контексте X относится к различным аминокислотным остаткам и ρΝΑ - к рнитроанилиду. Расщепление пептидной связи между X остатком и ρΝΑ части молекулы вызывает изменение цвета, что может контролироваться путем усиления светового поглощения при длине волны = 405 или 410 нм ΑΑΧρΝΑ субстрат. Для этого исходные растворы ΑΑΧ-ρΝΑ субстратов (150 ммоль/л) разбавлялись в 100 раз в 0,1 М ацетатном буфере с рН 4,0, содержащем 20 СаС1₂. 10-минутные измерения кинетики на ΊΈΟΑΝ Сешо5 МТР Кеабег (8а1хйигд. У1еппа) при длине волны 405 нм записывали увеличения оптической плотности, что посредством данных, обработанных в Ехсе1, получили диаграмму, показанную на фиг. 2. Из результата наглядно видно, что эндопротеаза из Α. шдег является высоко специфичной к пролиловым пептидным связям с концевой активностью по отношению к аланиловым связям. Исходные и хроматографически очищенные препараты демонстрировали аналогичные профили активности.

Возможное загрязнение эндопротеазы, полученной из Α. шдег, чужеродными ферментативными активностями приводит к ряду нежелательных побочных реакций. Например, наличие экзопротеаз, таких как карбоксипептидаз или аминопептидаз, приводит к образованию пептидных препаратов, содержащих повышенный уровень свободных аминокислот. Эти экстрасвободные аминокислоты разбавляют относительные концентрации содержащихся биоактивных пептидов и, более того, придают хлебные вкусы в результате усиленных реакций МаШагб. Представлены вопросы, должны ли значительные уровни загрязненных эндопротеаз присутствовать в препарате сверхэкспрессированной пролин-специфичной эндопротеазы, сайты расщепления в других положениях, чем карбоксиконцевые пролиновые или аланиновые остатки. Такие экстрасайты расщепления генерируют экстрапептиды, при этом также разбавляя содержание биоактивных пептидов, имеющих карбоксиконцевые пролиновые остатки. Для снижения до минимума всех этих нежелательных побочных реакций предпочтительным является применение практически чистых пролин-специфичных протеаз. Под понятием практически чистые понимается, что активности загрязненных эндопротеаз, так же как и загрязненных экзопептидаз, при инкубационных условиях используются в минимальных количествах или предпочтительно отсутствуют. Следующая тестовая процедура была разработана для количественного определения таких загрязненных экзо- и эндопептидазных активностей.

Основа для тестовой процедуры формировалась путем сбора различных избирательных хромогенных пептидов. Поскольку только пролин-специфичные олиго- и эндопротеазы могут удалить ρΝΑ из пептида Ζ-ΑΑΑΡ-ρΝΑ, то этот специфический пептид применялся для количественного определения желаемой пролин-специфичной эндопротеолитической активности. Поскольку многие эндопротеазы могут удалить ρΝΑ из пептидов Ζ-ΑΑΑΕ-ρΝΑ и Ζ-ΑΑΑΚ-ρΝΑ, эти два пептида применялись для определения загрязненной, не-пролин-специфичной эндопротеолитической активности.

Так как многие аминопептидазы могут эффективно удалить Рйе и С1п из пептидных субстратов, хромогенные пептиды Ο-ρΝΑ и У-ρΝΑ применялись для определения загрязненных аминопептидазных активностей.

Поскольку многие карбоксипептидазы могут удалить Рйе- и ΑΓβ-остатки из пептидных субстратов, пептиды, содержащие эти остатки, были выбраны для определения загрязненных карбоксипептидазных активностей. Однако не существует пригодных хромогенных групп, пригодных для количественного определения карбоксипептидазных активностей, в связи с чем был разработан альтернативный способ при использовании синтетических пептидов Ζ-ΑΕ и Ζ-ΑΚ. Этот альтернативный способ приводится ниже. Во всех синтетических пептидах используемый Ζ представляет бензилоксикарбонил и ρΝΑ - хромофорный паранитроанилид. Все хромогенные пептиды были получены от Реρ8саη (Те1у81аб, Тйе №1йег1апб§). Пептиды Ζ-ΑΕ и Ζ-ΑΚ были куплены у Васйет (§^Й8ег1апб). Все инкубации производились при 40°С. Разбавленные ферментные препараты были пересчитаны в соответствии с концентрацией коммерческого продукта.

Для демонстрации уровней различных ферментативных активностей, которые обычно присутству

- 12 012972 ют в промышленно доступных ферментных препаратах, в данном примере нами описывается тестирование трех коммерческих ферментных препаратов на их различные протеолитические активности, а именно Иауоиг/уше 1000Ь Ва1с11 ΗΡΝ00218 (Νονοζνιηοδ). Зшшхутс РР (8Ып Νίΐιοη. 1арап) и Сого1а§е ЬАР СП.: 4123 (АВ Егиутех. иК). Известно. что оба Р1ауошууте и §ит^ζуте РР являются комплексными ферментными препаратами. которые содержат несколько аминопептидолитических ферментных активностей кроме неспецифичных эндопротеолитических и карбоксипептидолитических активностей. Сого1а§е ЬАР представляет относительно чистую. клональную и сверхэкспрессированную лейцинаминопептидазную активность из АкрегдШик.

Измерение аминопептидазных активностей.

Исходные растворы 150 ммоль/л Ρ-ρΝΑ и Ο-ρΝΛ в 100% ΌΜ8Θ были разбавлены в 80 раз в 0.1 М ВФТгФ буфере с рН 6 для приготовления 3.75 ммоль/л Ρ-ρΝΑ+ Ο-ρΝΛ-субстратного раствора. содержащего Ρ-ρΝΑ и Ο-ρΝΛ в соотношении 1:1. 200 мкл аликвоты из этого аминопептидазного субстратного раствора были распипетировано в отдельные лунки микротитровой планшеты (МТР). МТР предварительно инкубировали при 40°С в Тесап Сешо5 МТР (БаПЬигд. У1еппа) под управлением программного обеспечения Маде11ап4. Реакция начиналась путем добавления 50 мкл подходящего ферментного раствора. таким образом. инкубации проводились при концентрации субстрата 3 мМ. Обычно. применялось разбавление 1:50 жидких ферментных образцов Р1ауошууте. Сого1а§е ЬАР и пролин-специфичной эндопротеазы. Был использован 1% раствор сухого продукта Зип^уте РР.

Развитие желтой окраски. измеренной при длине волны 405 нм с помощью Тесап Оешок МТР. как результат расщепления связи аминокислота-ρNΑ. следовало по меньшей мере через 20 кинетических циклов (около 10 мин). Программное обеспечение генерировало полученные данные как ОИ₄₀₅/мин (ОИ - оптическая плотность).

Измерение пролин-специфичной эндопротеазной активности.

Это измерение проводилось практически аналогично измерению аминопептидазной активности. но в данном случае Ζ-ΑΑΑΡ-ρNΑ применялся только в качестве субстрата в итоговой концентрации 3 ммоль/л. Этот субстрат был растворен путем нагревания суспензии в буфере с рН 6 до 50-55°С. что приводило к образованию прозрачного раствора при комнатной температуре. Измерения проводились при 40°С.

Обычно применялось разбавление 1:50 жидких ферментных образцов Р1ауошууте и Сого1а§е ЬАР. Зип^уте РР применялся как 1% раствор. Пролин-специфичная эндопротеаза обычно использовалась в разведении 1:5000.

Программное обеспечение генерировало данные как ОИ₄₀₅/мин.

Измерение загрязнения не-пролин-специфичных эндопротеазных активностей.

Также эти измерения проводились практически аналогичным образом. как описано для анализа аминопептидазной активности. но в данном тесте в качестве субстрата использовались Ζ-ΑΑΑΡ-ρNΑ и Ζ-ΑΑΑΚ-ρNΑ в соотношении 1:1 и в конечной концентрации 3 ммоль/л. Субстрат Ζ-ΑΑΑΡ-ρNΑ оказался плохорастворимым при тестовых условиях при рН 6.0. но тестовая инкубация с субтилизином привела к быстрому растворению субстрата одновременно с высвобождением ρNΑ. Измерения проводились при 40°С. Однако для компенсации такой плохой растворимости устройство для чтения МТР было запрограммировано на встряхивание между кинетическими циклами.

Аналогично. программное обеспечение генерировало данные как ОЭ₄₀₅/мин.

Измерение загрязнения карбоксипептидазных активностей.

Поскольку не существует чувствительных хромогенных пептидов. пригодных для измерения карбоксипептидазных активностей. используемый способ основан на протоколе Воейппдег для измерения карбоксипептидазы С.

Два исходных раствора Ζ-А-Р и Ζ-А-Р в этаноле по 150 ммоль/л были разбавлены в 80 раз в 0.1 моль/л ВщТгщ буфере с рН 6 для приготовления 3.75 ммоль/л Ζ-Λ-Ε+Ζ-Λ-Β субстратного раствора. содержащего Ζ-А-Р и Ζ-А-Р в соотношении 1:1. Затем 200 мкл субстратного раствора было раскапано в эппендорфную пробирку и предварительно инкубировано при 40°С. Реакция начиналась путем добавления 50 мкл подходящего ферментного раствора. Обычно применялось разбавление 1:50 образцов Р1ауошууте и Сого1а§е ЬАР и пролин-специфичной эндопротеазы. 1% раствор использовался для διιιηίζ.νιη РР. Через 5 мин реакция останавливалась добавлением 250 мкл нингидринового реагента. Нингидриновый реагент был приготовлен из 400 мг нингидрина (Мегск) и 60 мг гидриндантина. растворенных в 15 мл ЭМ8О. к которым добавляли 5 мл 4.0 моль/л буфера ацетата лития с рН 5.2. 4.0 моль/л буфера ацетата лития приготавливали путем растворения ЫОН (81дта). после чего рН раствора доводили до рН 5.2. используя безводную уксусную кислоту (Мегск).

После остановки реакции каждый образец нагревался в течение 15 мин при 95°С для обеспечения формирования окраски. и его последовательно разбавляли в 10 раз чистым этанолом. Образованную окраску измеряли при 578 нм в спектрофотометре Иу1коп. Контрольные пробы приготавливались таким же образом. как образцы для измерения активности. но нингидриновый реагент и фермент не добавлялись. Для определения количества свободных аминокислот. образованных карбоксипептидазной активностью. использовалась аминокислота Ь-фенилаланин для создания калибровочной кривой. Растворы в буфере с

- 13 012972 рН 6, содержащие 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5 и 3,0 ммоль/л Ь-фенилаланин (81дта), обрабатывались аналогично образцам, т.е. по 250 мкл на пробирку. Из полученных значений ΘΌ578 была построена кривая в Ехсе1. Концентрации аминокислот, находящихся в образцах, содержащих субстраты Ζ-Α-Б и Ζ-Α-Κ, были рассчитаны при использовании кривой. Из полученных значений была рассчитана карбоксипептидазная активность в микромолях на минуту на количество тестируемого фермента.

Вычисление индексов активности.

Для установления пригодности различных ферментных препаратов для способа изобретения индексы значимых ферментативных активностей были вычислены. Анализ, основанный на показаниях устройства для чтения МТР, показал, что ферментативные активности характеризуются высвобождением ρΝΑ в динамике по времени, а именно как ДОП₄₀₅/мин. Индексы ферментативных активностей, полученных при использовании устройства для чтения МТР, рассчитывались путем простого деления значений ΔΟΌ/мин, полученных аналогичных индексов фермента.

Однако в случае карбоксипептидазного анализа ΟΌ генерируется, при этом не может сравниваться непосредственно с ΔΟΌ/мин, полученным анализом МТР-ρΝΑ. В данном случае измеренную ΟΌ сначала конвертировали в мкмоль аминокислоты, высвобожденной за минуту (мкмоль/мин). Затем ΔΟΌ/мин высвобожденного ρΝΑ конвертировалось в мкмоль/мин. Для этого калибровочная кривая была получена по показаниям устройства для чтения МТР, где измерялись разбавления чистого ρΝΑ (81дта) 0,25, 0,125, 0,625, 0,0312 и 0,015 ммоль/л и 250 мкл на лунку. Из полученных данных была построена калибровочная кривая в Ехсе1. Из данной калибровочной кривой ΔΟΌ/мин переводился мкмоль/мин, таким образом, измерения, основанные на ρΝΑ, могли сравниваться с измерениями, основанными на нингидрине.

На основании полученных данных вышеуказанных тестов различные используемые ферментные препараты были охарактеризованы в виде желаемых пролин- и аланин-специфичных активностей и загрязненных эндопротеазных, аминопептидазных и карбоксипептидазных активностей. Данные на пролин-специфичные олиго- или эндопротеолитические активности, представленные для каждого ферментного препарата, показаны в табл. 1 в графе Прол-спецактивности. Данные на загрязненные аминопептидазные активности (АР/Прол-спецакт), загрязненные карбоксипептидазные аминопептидазные активности (СРИ/Прол-спецакт) и загрязненные эндопротеолитические активности (Епбо/Прол-спецакт) показаны в соотношении с настоящими пролин-специфичными активностями. Уровень загрязненной амино пептидазной активности по отношению к загрязненной карбоксипептидазной активности, присутствующей в каждом препарате, показан как (ΑΡ/СРИ).

Очевидно, что ни один из коммерческих ферментных препаратов не содержит какие-либо значительные пролин-специфичные олиго- или эндопротеолитические активности. Более того, все тестируемые коммерческие ферментные препараты содержат значительные загрязненные эндо- и экзопротеолитические активности.

Таблица 1

Уровни желаемых (пролин- и аланин-специфичных) эндопротеазных активностей относительно уровней загрязненных эндо- и экзопротеолитических активностей

	Пролспецактивност и*	СЮ/ Прол-спецакт	АР/ Прол-спецакт	Еп<1о/ Прол-спецакт	АР/СРО
8шп1гуте	0,004	21,7	1,2	1,7	0,06
Патоиггуте	0,0007	253,5	25,6	35,5	0,10
Сого!азе БАР	0,0				0,74
Прол-спец А.п1§ег	100	0,005	0,00001	0,000004	0,00

* 8шш/уте измерялся в 1% растворе, Насоигхуте и Сото1а§е как разведение 1:50. Прол-специфичная активность, полученная из Α. шдет, измерялась как разведение 1:5000. Затем данные рассчитывались для определения присутствующей активности в представленном продукте.

Пример 4.

Пролин-специфичная эндопротеаза, полученная из Α. шдет, способна гидролизовать крупные белки, также как и небольшие пептиды и, таким образом, является настоящей эндопротеазой.

Благодаря характерной особенности структуры, пролилолигопептидазы, принадлежащие к семейству 89, не могут разлагать пептиды размером свыше 30 аминокислотных остатков. Это ограничение является очевидным недостатком для фермента, который, как подразумевается, должен гидролизовать различные белки так быстро и эффективно, как только возможно. Для того чтобы выяснить, характерны ли эти ограничения, относящиеся к молекуле субстрата, для пролин-специфичной эндопротеазы, полученной из Α. шдет, авторы инкубировали хроматографически очищенную пролилэндопротеазу из Α. шдет с небольшим синтетическим пептидом, а также с крупной молекулой овальбумина и подвергли образо

- 14 012972 вавшиеся продукты гидролиза анализу с помощью ЗОО-РАСЕ.

Используемый синтетический пептид представлял собой 27-мерный пептид, включающий последовательность МН^ЕКАБПХОКУГОРбКУЕТЬ'ПККЬШРК-СООН, и был подарен компанией Регксап (Ье1у§!аб, Тбе ЫеШепапбк). Как видно из его аминокислотной последовательности, этот пептид содержит 2 пролиновых остатка, один в середине и один возле самого конца пептида.

Интактная молекула овальбумина (Р1егсе ЕщесЕ пузырьки, содержащие 20 мг замороженного высушенного вещества) состоит из 385 аминокислот и имеет молекулярную массу 42750 Да. Эта молекула содержит 14 пролиновых остатков, один из которых расположен в самой С-концевой части молекулы и его нельзя расщепить пролин-специфичной эндопротеазой.

Овальбумин и олигопептид по отдельности инкубировали при 50°С с очищенной пролинспецифичной эндопротеазой, полученной из А. шдег. Через определенные отрезки времени отбирали несколько образцов, которые анализировали, применяя БОЗ-РАСЕ.

Хроматографически очищенную пролин-специфичную эндопротеазу, полученную из А. шдег, с активностью 4,5 Ед/мл разбавляли в 100 раз 0,1М ацетатным буфером с рН 4, содержащим 20 мМ СаСд₂. Овальбумин растворяли в ацетатном буфере с рН 4 до концентрации 1 мг/мл (22 мкМ). 27-мерный пептид растворяли в таком же буфере до достижения концентрации 0,48 мг/мл (152 мкМ). Молярности растворов овальбумина и 27-мера выбирали таким образом, чтобы оба раствора имели одинаковую молярность по отношению к расщепляемым пролиновым остаткам. Овальбумин содержит 13 потенциальных сайта расщепления пролина, тогда как 27-мерный пептид имеет только два. 0,5 мл растворов обоих субстратов инкубировали с 10 мкл (0,45 мЕд) раствора фермента в термомиксере Эппендорфа при 50°С. Через определенные интервалы времени отбирали 10 мкл образцов инкубируемых смесей и до проведения ЗОЗ-РАСЕ хранили при 20°С. Все материалы, использованные для ЗОЗ-РАСЕ и окрашивания, были приобретены у ^Игодеп. Образцы получали, используя буфер ЬОЗ в соответствии с инструкциями производителя, и разделяли на 12% бис-трис-гелях, используя буферную систему МЕЗ-ЗОЗ согласно инструкциям производителя. Окрашивание выполняли, используя краситель З1тр1у В1ие ЗаГе З1а1п (Ο'ο11οάίη1 Ο’οοιικίδ!^ С250).

Как можно видеть на фиг. 3, овальбумин расщепляется ферментом, полученным из АкрегдШик, на дискретную линию, приблизительно 35-36 КДа, в первые 4,75 ч инкубирования (полоса 3). Увеличение продолжительности инкубирования приводит к дальнейшему распаду на более мелкие продукты различной молекулярной массы (полоса 7).

27-мерный пептид также расщепляется, как можно судить по более слабым линиям в полосах 4, 6 и 8 по сравнению с полосой 2. Сдвиг, соответствующий очень малой молекулярной массе продукта (ср. полосы 9 и 8), вероятнее всего, вызван отщеплением аргининового остатка от карбоксильного конца пептида. Разница составляет приблизительно 200 Да (измерена с использованием программного обеспечения А1рЕа1тадег 3.3б на системе А1рЕа1тадег 2000), и аргинин обладает молекулярной массой 174. Этот сдвиг, соответствующий малой молекулярной массе, вероятно, соответствует первой стадии в расщеплении пептида.

Дальнейший распад продукта может быть виден за счет уменьшения интенсивности линии на геле ЗОЗ. Продукты дальнейшего распада невидимы, так как окрашивание в геле красителем кумасси бриллиантовый голубой компонентов с молекулярной массой около 1000 невозможно.

Из этого эксперимента можно сделать вывод, что в отличие от известных пролилолигопептидаз, принадлежащих к семейству З9, пролин-специфичная эндопротеаза, выделенная из А. шдег, не имеет конкретного предпочтения в отношении расщепления пептидов небольшого размера по сравнению со значительно более крупными белками. В силу этого выделенный из А. шдег фермент представляет собой настоящую эндопротеазу и является предпочтительным ферментом для гидролиза различных видов белков. Это наблюдение привело к неожиданному применению фермента, что показано в следующем примере.

Пример 5.

При инкубации казеината калия с пролин-специфичной эндопротеазой из А. шдег быстро выделяются ФР и ЬРР, но не УРР.

В этом эксперименте сверхпродуцирующая и практически чистая пролин-специфичная эндопротеаза из А. шдег инкубировалась с казеинатом калия для тестирования выделения пептидов ГРР и УРР, ингибирующих АСЕ, а также ЬРР. Используемая эндопротеаза была практически чистой, это означает, что не наблюдалось значимой эндопротеолитической активности, за исключением эндопротеолитической активности, свойственной чистой пролин-специфичной эндопротеазе (т.е. карбоксиконцевое расщепление пролиновых и аланиновых остатков). Кроме того, ферментный препарат лишен значимых экзопротеолитических активностей, как описывается в примере 3.

Для ограничения поступления натрия в результате применения пептидов, ингибирующих АСЕ, насколько возможно, казеинат калия использовался в качестве субстрата при данной инкубации.

Казеинат суспендировался в воде при 65°С в концентрации 10% (м/м) белка, после чего рН доводилось до 6,0 при использовании фосфорной кислоты. Затем суспензия охлаждалась до 55°С и добавлялась пролин-специфичная эндопротеаза, полученная из А. шдег, в концентрации 4 ед./г белка (см. раздел

- 15 012972 «Материалы и методы для определения единиц»). При непрерывном перемешивании эта смесь инкубировалась в течение 24 ч. Образцы отбирались через 1, 2, 3, 4, 8 и 24 ч инкубации. Для каждого образца ферментативная активность завершалась путем нагревания образца до 90°С в течение 5 мин. После охлаждения рН каждого образца быстро снижалось до 4,5, используя для этого фосфорную кислоту, после чего суспензия центрифугировалась в течение 5 мин при 3000 грт в центрифуге настольного типа Негеаик. Абсолютно чистый супернатант использовался для анализа ЖХ/МС/МС для определения содержания пептидов УРР, 1РР, ЬРР, УУУРР и УУУРРЕ в супернатанте (см. раздел «Материалы и методы»).

Казеин коровьего молока включает ряд различных белков, включая бета- и каппа-казеин. В соответствии с известными амино-последовательностями бета-казеин охватывает трипептиды 1РР, УРР и ЬРР, ингибирующие АСЕ. В бета-казеине 1РР находится в последовательности -Р₇1-Р₇₂-№₃-1₇₄-Р₇₅-Р₇₆-, УРР содержится в последовательности -Р₈1-У₈₂-У₈₃-У₈₄-Р₈5-Р₈₆- и ЬРР содержится в последовательности -Р15₀-Ь151-Р15₂-Р15₃-. Каппа-казеин, который присутствует в препаратах казеина, полученных путем кислотного осаждения, в молярной концентрации почти 50% от концентрации бета-казеина, включающего только 1РР. В каппа-казеине 1РР содержится в последовательности -А₁₀₇-1₁₀₈-Р₁₀₉-Р₁₁₀-. Другие белковые компоненты казеина не содержат ни 1РР, УРР, ни ЬРР.

Табл. 2 и 3 показывают концентрации пептидов, присутствующих в подкисленных и процентрифугированных супернатантах, вычисленные на грамм казеинат калия, добавленного к инкубационной смеси. Как показано в табл. 2, концентрация 1РР увеличивается через 1 ч инкубации. Помимо этого концентрация 1РР не увеличивается в дальнейшем. Образование пентапептида УУУРР показывает такие же кинетики, что и образование 1РР. Как теоретически предполагается, молярный выход УУУРР аналогичен молярному выходу пептида ЬРР. Выход обоих ЬРР и УУУРР увеличивается почти на 60% от того, что мы теоретически допустили. То, что максимум концентрации ЬРР достигается только через 3 ч инкубации, предполагает, что расщепление этой определенной части молекулы бета-казеина, возможно, является довольно более сложным. По сравнению с УУУРР, гексапептид УУУРРР не формируется вообще. Это наблюдение предполагает, что пролин-специфичная эндопротеаза эффективно расщепляет связь -Р-Е-, вследствие чего образуется УУУРР. Трипептид 1РР образуется сразу же, но его молярный выход составляет не более трети максимального выхода УУУРР или ЬРР. Поскольку трипептид 1РР содержатся как в бета-казеине, так и в каппа-казеине, такой результат является неожиданным. Вероятным объяснением этого результата является то, что пролин-специфичная протеаза может генерировать 1РР, но только из каппа-казеиновой части казеинатов. Учитывая соответствующую аминокислотную последовательность каппа-казеина, предполагается, что пептидная связь -А_1С7-11о₈- расщепляется аланин-специфичной активностью фермента. Если это верно, то количество отделенного 1РР увеличится приблизительно на 40% от количества, которое присутствует в каппа-казеине, однако не более чем приблизительно на 10% от 1РР, которое теоретически присутствует в бета- плюс каппа-казеине. Этот механизм расщепления для высвобождения 1РР также объясняет, почему УРР не может образовываться из его молекулы предшественника УУУРР: просто необходимые эндопротеолитические активности не присутствуют в используемых ферментных препаратах, полученных из А. шдег.

Таблица 2

Молярные пептидные содержания подкисленных супернатантов, вычисленные на грамм добавленного белка

микромоль/грамм белка	ΙΡΡ	ЬРР	УРР	νννρρ	νννρρρ
К-СЯЗ 1 ч	2,8	4,2	<0,2	8,4	<0,2
К-саз 2 ч	2,6	6,1	<0,2	9,1	<0,2
К-саз 3 ч	2,6	8,4	<0,2	9,1	<0,2
К-саз 4 ч	2,3	8,0	<0,2	8,3	<0,2
К-саз 8 ч	2,1	9,4	<0,2	7,2	<0,2
К-саз 24 ч	2,0	9,5	0,4	5,5	<0,2

- 16 012972

Таблица 3

Концентрации пептидов в подкисленных супернатантов, вычисленные в мг/г добавленного белка

миллиграмм/грамм белка	ΙΡΡ	ЬРР	УРР	νννρρ	νννρρρ
К-саз 1 ч	0,9	1,4	<0,05	4,3	<0,05
К-саз 2 ч	0,8	2,0	<0,05	4,6	<0,05
К-саз 3 ч	0,8	2,7	<0,05	4,6	<0,05
К-саз 4 ч	0,8	2,6	<0,05	4,2	<0,05
К-саз 8 ч	0,7	3,0	<0,05	3,6	<0,05
К-саз 24 ч	0,7	3,1	0,1	2,8	<0,05

Пример 6.

Введение стадии осаждения кислого казеина приводит к пятикратному увеличению концентрации пептидов, ингибирующих АСЕ.

Как описывается в примере 5, казеинат калия в концентрации 10% (мас./мас.) белка инкубировался с пролин-специфичной эндопротеазой, полученной из А. шдег, при рН 6,0. Через различные инкубационные периоды образцы нагревались для остановки дальнейшей ферментативной активности, после чего рН опускали до 4,5 для уменьшения растворимости казеина. Не растворенные молекулы казеина удалялись с помощью низкоскоростного центрифугирования. В табл. 2 и 3 мы представляем концентрации пептидов, ингибирующих АСЕ, рассчитанные из расчета исходной концентрации 10% белка. Однако в результате подкисления и последующей стадии центрифугирования, большой процент добавленного белка удалялся. Для учета этого удаленного белкового содержания из подкисленных супернатантов выполнялись анализы содержания общего азота (К)е1ба111). В соответствие с последними данными, было обнаружено, что различные супернатанты содержали уровни белка, приведенные в табл. 4.

Таблица 4

Белковые содержания подкисленных супернатантов

Учитывая эти данные, мы пересчитали концентрацию пептидов, ингибирующих АСЕ, находящихся в каждом супернатанте, но на этот раз используя их истинные белковые содержания. Эти пересчитанные данные приведены в табл. 5.

Таблица 5

Концентрации пептидов в подкисленных супернатантах, рассчитанные на грамм присутствующего белка

миллиграмм/грамм белка	νρρ	ΙΡΡ	ЬРР	νννρρ	νννρρρ
К-саз 1 ч	0,1	4,8	7,1	22,5	<0,05
К-саз 2 ч	0,1	3,4	8,0	18,9	<0,05
К-саз 3 ч	0,1	3,1	10,0	17,0	<0,05
К-саз 4 ч	0,1	2,4	8,5	13,7	<0,05
К-саз 8 ч	0,1	1,9	8,4	10,0	<0,05
К-саз 24 ч	0,3	1,5	7,1	6,4	<0,05

Сравнение данных, представленных в табл. 3 и 5, четко показывают, что стадия простого подкисления с последующим осуществлением промышленно возможной декантации, фильтрации или низкоскоростного центрифугирования приводит к пятикратному увеличению концентрации специфичных пептидов и ингибирующих АСЕ.

Пример 7.

Идентификация новых и активных трипептидов МАР и 1ТР, ингибирующих АСЕ, в концентрированных казеиновых гидролизатах.

Для обеспечения более тщательного анализа присутствующих биоактивных пептидов по препаративному синтезу был приготовлен казеиновый гидролизат, полученный путем ферментации чистой пролин-специфичной эндопротеазы из А. шдег и очищенный путем осаждения кислотой. Для этого 3000 г

- 17 012972 казеинат калия суспендировали в 25 л воды при 75°С. После тщательной гомогенизации рН медленно доводили до 6,0, используя разбавленную фосфорную кислоту. После охлаждения до 55°С получены из А. шдег пролин-специфичные в концентрации 4 ферментативные единицы/грамм казеината (см. раздел «Материалы и методы для определения единиц»). После инкубации (при помешивании) в течение 3 ч при 55°С, рН уменьшали до 4,5 путем медленного добавления концентрированной фосфорной кислоты. В этом препаративном синтезе стадия термической обработки для инактивации пролин-специфичной эндопротеазы в этой части способа упускалась. Затем суспензия быстро охлаждалась до 4°С и сохранялась в течение ночи (без перемешивания) при этой температуре. На следующее утро чистый верхний слой сливался и выпаривался до достижения уровня 40% сухого вещества. Последняя концентрированная жидкость подвергалась обработке ИНТ (ультравысокой температуры) в течение 4 с при 140°С и затем ультрафильтрации при 50°С. После бактериальной фильтрации жидкость высушивалась распылением. Этот материал именуется в дальнейшем как биоактивные пептиды, полученные из казеина (СИВАР (Сазеш ЬегАей Вю-АсГОе РерИйез)). Используя процедуры ЖХ/МС, изложенные в разделе «Материалы и методы», определялось содержание 1РР, ЬРР и УРР порошкового продукта. В зависимости от содержания азота, в порошковом продукте содержание белка составляло около 60% (используя коэффициент пересчёта 6,38). Содержания 1РР, ЬРР и УРР порошка представлено в табл. 6. Аминокислотная композиция продукта СИВАР представлена в табл. 7. Довольно примечательным являлось увеличение молярного содержания пролина в материале, высушенном распылением, полученного после осаждения кислотой: от исходного 12 до приблизительно 24%.

Таблица 6

Содержание 1РР, ЬРР и УРР в СИВАР

ΙΡΡ	ЬРР	УРР
Содержание трипептцда в мг/г порошка
2,5	6,5	<0,1
Содержание трипептида в мг/г белка
4,2	10,8	<0,17

Таблица 7 Аминокислотная композиция казеината калия исходного материала и СИВАР (содержание аминокислот после кислотного гидролиза показано как проценты молярного содержания аминокислоты)

Наличие новых пептидов, ингибирующих АСЕ, в СИВАР изучалось путем использования двумерного хроматографического разделения в сочетании с а!-1те анализа ингибирования АСЕ и массспектрометрии для идентификации. В первом анализе смесь пептидов отделялась на колонке для жидкостной хроматографии (ЖХ) ΘΌ83 и профили ингибирования АСЕ были получены из различных образованных фракций. Во втором анализе фракции из первой колонки, показывающие высокое ингибирование АСЕ, затем отделялись на колонке для ЖХ Вю8Ш1е при использовании различного профиля градиента. Фракции, собранные из второй колонки, разделялись на две части: одна часть использовалась для измерения ингибирования АСЕ а!-1те, в то время как другая часть подвергалась анализам МС и МС-МС для идентификации присутствия пептидов.

Все анализы выполнялись при использовании системы ВЭЖХ АШапсе 2795 (^а!егз, ЕИеп-Ьеиг, (Не №Шег1апЙ8), оснащенной двулучевым УФ-детектором. Для идентификации пептидов ВЭЖХ-система соединялась с масс-спектрометром 0-ТОР того же производителя. В тестах 20 мкл 10% (мас./об.) раство

- 18 012972 ра СЭВАР в Μί11ί-0 воде вводилось в колонку ОЭ83 150x2,1 [пег(811 5 с размером частиц 5 мкм (Уапап, М1ббе1Ьигд, Фе ЫеШепапйк). Подвижная фаза А состояла из 0,1% раствора трифторуксусной кислоты (ТРА) в Μί11ί-0 воде. Подвижная фаза В состояла из 0,1% раствора ТРА в ацетонитриле. Исходная элюентная композиция составляла 100% раствора А. Элюент сохранялся при 100% А в течение 5 мин. Затем линейный градиент начинали в течение 10 мин с 5% В, с последующим линейным градиентом в течение 10 мин до 30% В. Колонка промывалась путем увеличения концентрации раствора В до 70% в течение 5 мин и сохранялась при 70% раствора В в течение последующих 5 мин. После чего элюент менялся на 100% раствор А в течение 1 мин и уравновешивался в течение 9 мин. Общее время пробега составило 50 мин. Скорость потока элюента составляла 0,2 мл-мин^-1 и температура колонки поддерживалась при 60°С. УФ-хроматограмма записывалась при длине волны 215 нм. Фракции элюента собирались в 96луночную планшету, используя одноминутный интервал времени, в результате чего получились объемы фракций в 200 мкл. Элюент в лунках нейтрализовался путем добавления 80 мкл 0,05% водного раствора гидроксида аммония (25%). Растворитель испарялся до сухости в азотной среде при 50°С. После чего остаток разбавлялся в 40 мкл Μί11ί-0 воды и перемешивался в течение 1 мин.

Для а!-11пе анализа ингибирования АСЕ добавлялось 27 мкл 33,4 мЕд мл^-1 АСЕ (фермент получен от 81§та СйеткаЩ в фосфатно-буферном солевом растворе (РВ8) с рН 7,4 с концентрацией хлорида 260 мМ, и смесь инкубировалась в течение 5 мин в смесителе для 96-луночных планшет при 700 ВРМ. После инкубационного периода добавляли 13 мкл 0,35 мМ раствора гиппуровая кислота-гистидинлейцин (ННЬ) в буфере РВ8 и перемешивали в течение 1 мин при 700 ВРМ. Смесь вступала в реакцию в течение 60 мин при 50°С в ГХ-термостате. После завершения реакции планшеты охлаждали в тающем льде.

Затем 96-луночная планшета анализировалась на £1а8Й-ВЭЖХ-колонке. Из реакционной смеси каждой лунки 30 мкл вводилось в ВЭЖХ-колонку СЬгот1йй Р1а8Й РР18е 25x4,6 мм (Мегск, ЭапШабк Сегтапу), оснащенной защитной колонкой РР18е 10x4,6 мм того же производителя. Изократическая подвижная фаза состояла из 0,1% раствора ТРА в воде/ацетонитриле 79/21. Поток элюента составлял 2 мл-мин^-1 и температура колонки составляла 25°С. Введения осуществлялись с интервалом времени в 1 мин. Гиппуровая кислота Н и ННЬ контролировались при 280 нм. Пиковые значения Н и ННЬ измерялись и ингибирование АСЕ (Λ0ΈΙ) каждой фракции рассчитывалось по формуле

АСЕ1а » (ПС» - /(ОС_№»100) где АСЕН - процент ингибирования аналита;

ЭС„ - степень расщепления ННЬ до Н и НЬ в воде посредством АСЕ;

ЭС_а - степень расщепления ННЬ до Н и НЬ для аналита.

Степень расщепления рассчитывали путем выражения пикового значения Н как доли от суммы пиковых значений Н и ННЬ.

Наибольшее ингибирование АСЕ определялось во фракциях, извлеченных между 18 и 26 мин. Эта часть собиралась и повторно вводилась в колонку Вю8ийе 150x2,1 мм с размером частиц 3 мкм (^а!ега, Ейеп-Ьеиг, 111е ЫеШейапйк). Подвижная фаза состояла из 0,1% раствора муравьиной кислоты (РА) в М11110 воде. Подвижная фаза В состояла из 0,1% раствора РА в метаноле. Исходная элюентная композиция являлась 100% А. Элюент сохранялся при 100% А в течение 5 мин. После этого линейный градиент начинался в течение 15 мин с 5% В с последующим линейным градиентом в течение 30 мин с 60% В. Элюент сохранялся при 60% В в течение последующих 5 мин. Окончательно элюент снижался до 100% подвижной фазы А в течение 1 мин и уравновешивался в течение 10 мин. Общее время пробега равнялось 65 мин. Поток элюента составлял 0,2 мл-мин^-1 и температура колонки поддерживалась при 60°С. УФизлучение записывалось при 215 нм. Фракции собирались из колонки Вюкийе при 10-секундном интервале времени. Фракции опять разделялись на две части, одна часть использовалась для измерения активности, используя а!-1ше-способ определения ингибирования АСЕ, описанный ранее, тогда как другая часть использовалась для идентификации активных пептидов, используя анализ МС и МС-МС.

Два хроматографических пика с молекулярными ионами массой 326,2080 Да и два других пика с молекулярными ионами 330,2029 и 318,1488 Да соответствовали повышенному ингибированию АСЕ, измеренные в период между 18 и 26 мин. Используя анализ МС-МС, эти пептиды были определены как структурные изомеры ΙΡΡ и ЬРР (-0,6 ррт), ΙΤΡ (-4,8 ррт) и МАР (+2,8 ррт) соответственно. Белковыми источниками пептидов являлись каппа-казеин £108-110 (ΙΡΡ), β-казеин £151-153 (ЬРР), α-82-казеин £119121 (ΙΤΡ) и β-казеин £102-104 (МАР). ΙΡΡ и ЬРР были представлены ранее как пептиды, ингибирующие АСЕ, со значением Ιί.’₅₀ в 5 и 9,6 мкМ соответственно (Υ. Хакатига, М. УататоЮ. К. 8ака1, А. ОкиЬо, 8. Уатахакк Т. Такапо, I. Эа1гу 8с1. 78 (1995) 777-783; Υ. АгуозЫ, Тгепйз ίη Роой 8с1епсе аий Тескпок 4 (1993) 139-144). Однако трипептиды ПТ и МАР не были представлены, насколько нам известно, ранее как эффективные пептиды, ингибирующие АСЕ.

МАР, ПР и ΙΡΡ были химически синтезированы и активность каждого пептида измерялась при использовании модифицированного анализа Ма!8Ш, описанного ниже.

Количественное определение содержания МАР и ПТ в различных образцах осуществлялось с помощью устройства М1сгота§8 ОиаИго ΙΙ М8, работающего в положительном многореакционном режиме

- 19 012972 мониторинга электрораспыления. Используемый способ ВЭЖХ был подобен способам, описанным выше. МС-настройки (Ε8Ι+) были следующими: напряжение при распылении 37 В, напряжение в капиллярах 4 кВ, осушение азота при 300 л/ч. Температура источника и распылителя 100 и 250°С соответственно. Синтетические пептиды использовались для приготовления калибровочной кривой, используя ионпредшественник 318,1 и суммированные ион-продукты 227,2 и 347,2 для МАР и используя ионпредшественника 320,2 и суммированные ион-продукты 282,2 и 501,2 для ПТ. В соответствии с этим анализом новые трипептиды МАР и ПТ, ингибирующие АСЕ, присутствовали в продукте СОВАР в количествах, соответствующих 2,9 мг МАР/г СОВАР или 4,8 мг МАР/г белка в СОВАР и 0,9 мг ПР/г СОВАР и 1,4 мг ПТ/г белка в СОВАР.

Для определения ингибирующей АСЕ-активности МАР и ΙΤΓ химически синтезированные трипептиды анализировались способом, описанным Майш е1 а1. (Майш, Т. е1 а1. (1992) Вю5сг Вю1есй. Вюсйеш. 56: 517-518) с некоторыми незначительными модификациями. Различные инкубации показаны в табл. 8.

Таблица 8

Процедура для анализа определения ингибирования АСЕ по Майш.

Компоненты добавлялись в 1,5-мл пробирку с итоговым объемом 120 мкл

Компонент	Контроль 1 (мкл)	Контроль 2 (мкл)	Образец 1 (мкл) Образец 2 (мкл)
Н1р-Н18-Ьеи (3 мМ)	75	75	75	75
н2о	25	45	20
Ингибирующий	-	-	25	25
пептид
АСЕ (0,1 Ед/мл)	20	-	20	-

Каждый из четырех образцов содержал 75 мкл 3 мМ гиппурил-гистидин-лейцин (НЕр-Нй-Ьеи, 81дша Сйешкай), растворенного в 250 мМ раствора бората, содержащего 200 мМ ЫаС1, рН 8,3. АСЕ был получен от 8щша Сйетйай. Смеси инкубировались при 37°С и останавливались через 30 мин путем добавления 125 мкл 0,5 М НСй Далее, было добавлено 225 мкл раствора бицин/ЫаОН (1 М ЫаОН: 0,25 М бицина(4:6)), с последующим добавлением 25 мкл 0,1 М ΤNВ8 (2,4,6-Тринитробензолсульфоновая кислота, Ника, 8\\йхег1апб: в 0,1 М Ыа₂НРО₄). После инкубации в течение 20 мин при 37°С добавлялось 4 мл 4 мМ №ь8О₃ в 0,2 М ЫаН₂РО₄ и измерялось поглощение света при длине волны 416 нм на спектрофотометре ИУ/Уй (81итаб/и ИУ-1601 с СР8 контроллером, №1йег1апб§). Величина ингибирующей АСЕ(АСЕ^-активности рассчитывалась как процент ингибирования по сравнению с коэффициентом пересчёта АСЕ при отсутствии ингибирования по следующей формуле:

АСΕI (%) = ((Контроль 1-Контроль 2)-(Образец 1-Образец 2)/(Контроль 1-Контроль 2))х100, где Контроль 1 - поглощение без АСЕ ингибирующего компонента (=макс. АСЕ активности) [АИ];

Контроль 2 - поглощение без АСЕ ингибирующего компонента и без АСЕ (фон) [АИ];

Образец 1 - поглощение при наличии АСЕ и АСЕ ингибирующего компонента [АИ];

Образец 2 - поглощение при наличии АСЕ ингибирующего компонента, но без АСЕ [АИ].

Полученное значение Ιί.'₅₀ химически синтезированных трипептидов МАР и ПТ представлено в табл. 9 вместе со значениями Ι0₅ο, полученными при а!-йпе-измерениях, используемых в фазе скрининга эксперимента. Измерение химически синтезированного ЙРР включалось как внутренний стандарт для различных измерений.

Таблица 9

Значения АСЕ ингибирования (ΙΟ₅₀ значения) МАР, ПТ и ШР, определенные путем а1-йпе АСЕ-анализа и модифицированного анализа Майш

Пентад	Значение 1С50 в мкМ
аМте АСЕ- анализ	модифицированный анализ Майи1
МАР	3,8	0,4
ΙΤΡ	50	10
ΙΡΡ (стандарт)	7,1	2

Пример 8.

Новые пептиды МАР и ΙΤΓ. ингибирующие АСЕ, способны сохраняться в желудочно-кишечном тракте человека.

После употребления диетические белки и пептиды подвергаются различным пищеварительным ферментативным процессам в желудочно-кишечном тракте. Для определения стабильности вновь идентифицированных биоактивных пептидов в желудочно-кишечном тракте человека препарат С.ПВАР (приготовленный, как описывалось в примере 7) подвергался желудочно-кишечной обработке (ΟΙΤ), воспроизводящей пищеварительные условия, обычно найденные в организме человека. Образцы, полученные после различных инкубационных периодов в ΟΙΤ-модельной системе, были проанализированы, исполь

- 20 012972 зуя оп-1ше-систему ВЭЖХ-В1оа88ау-М8 или систему НК8-М8 для количественного определения любых остаточных пептидов МАР и ΙΤΡ. Процедура ΟΙΤ осуществлялась в стандартном смесителе, содержащем 100 мл флакон (как снабжено Уапке1, И8). Температура водяной бани поддерживалась при 37,5°С и лопастная скорость - таким образом, чтобы образец сохранялся в суспензии (100 грт).

Около 3,4 г СЭВ АР (уровень белков приблизительно 60%) было растворено/суспендировано в 100 мл МШ1-0 воды. Во время желудочной стимуляции использовалось 5 М НС1 для уменьшения рН. В конце желудочной стимуляции и во время дуоденальной фазы использовалось 5 М №10Н для увеличения рН.

Суспензия СЭВАР предварительно нагревалась до 37,5°С и 5 мл суспензии извлекалось для растворения 0,31 г пепсина (Ника порядковый номер 77161). При 1=0 мин 5 мл с вновь растворенным пепсином добавлялось обратно в суспензию. Затем значение рН суспензии СЭВАР регулировалось медленно вручную при использовании раздельного рН-метра по следующей схеме:

= 20 мин рН снижается до 3,5

1= 40 мин рН до 3,0 = 50 мин рНдо2,3

1=60 мин рНдо 1,8 = 65 мин рН увеличивалось до 2,7 = 75 мин рНдоЗ,7

I = 80 мин рН до 5,3

При 1=90 мин 0,139 г восьмикратного И8Р панкреатина (81дта порядковый номер Р7545) был аккуратно смешан с другими 5 мл суспензии СЭВАР и немедленно добавлен обратно. Инкубация продолжалась по следующей схеме:

= 93 мин рН до 5,5 = 95 мин рНдо6,3 = 100 мин рН до 7,1

Эксперимент останавливался при 1=125 мин и значение рН сверялось (рН составляло 7). Затем образцы переносились в сосуд и помещались в микроволновую печь. Затем образцы перемещались в стеклянные пробирки и инкубировались при температуре 95°С в течение 60 мин для инактивации всей протеазной активности. После охлаждения образцы помещались в пробирки Еа1соп и центрифугировались в течение 10 мин при 3000хд. Супернатант подвергался лиофилизации. Содержание общего азота полученного порошка определялось и конвертировалось с уровнем белка, используя К)е1баЫ-фактор казеина (6,38). В соответствии с этими данными уровень белка препарата СЭВАР после процедуры ΟΙΤ составлял 48,4%. Уровни МАР и ГГР, сохранившиеся при протеолитической обработке по процедуре 6ΙΤ, определялись, как описано в примере 7, и полученные данные показаны в табл. 10.

В соответствии с результатами экспериментов оба МАР и ПР проявляют высокую устойчивость против расщепления ΟΙΤ. В сочетании с низкими значениями Ιί.'₅₀ для этих трипептидов (как показано в примере 7) данные указывают на значительный потенциал двух новых пептидов, ингибирующих АСЕ, как пептидов, снижающих кровяное давление.

Таблица 10

Концентрации МАР и ПР до и после прохождения через желудочно-кишечный тракт человека (ΟΙΤ процедура)

Образец	Концентрация в мкг г1 порошка
МАР	ΙΤΡ
СПВАР (пример 7)	2851,4	903,7
СОВАР после С1Т	3095,8	889,1

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Трипептид МАР или его соль, используемый для снижения кровяного давления.
2. 2. Трипептид ПР или его соль, используемый для снижения кровяного давления.
3. 3. Белковый гидролизат, содержащий трипептид МАР по п.1 и трипептид ПР по п.2.
4. 4. Белковый гидролизат по п.3, который имеет степень гидролиза (ОН) от 5 до 50%, предпочтительно от 10 до 40%, более предпочтительно от 20 до 35%.
5. 5. Смесь трипептидов, содержащая трипептид МАР или его соль по п.1 и трипептид ПР или его соль по п.2.
6. 6. Смесь трипептидов по п.5, которая содержит по меньшей мере 1 мг МАР/г белка, предпочтительно по меньшей мере 2 мг МАР/г белка, более предпочтительно по меньшей мере 4 мг МАР/г белка.

   - 21 012972
7. 7. Смесь трипептидов по п.4 или 5, в которой количество пептидов, имеющих молекулярную массу (МС) менее 500 Да, составляет по меньшей мере 30 мас.% (сухого вещества) смеси пептидов, предпочтительно между 35 и 70 мас.% (сухого вещества) смеси пептидов.
8. 8. Смесь трипептидов по любому из пп.5-7 или белковый гидролизат по п.3 или 4, который дополнительно содержит ΙΡΡ или ЬРР.
9. 9. Смесь трипептидов по любому из пп.5-7 или белковый гидролизат по п.3 или 4, который содержит от 1 до 90% воды, предпочтительно от 1 до 30% воды, более предпочтительно от 1 до 15% воды.
10. 10. Способ получения трипептида МАР и/или трипептида ΙΤΡ и/или их соли по любому из пп.1, 2, который включает ферментативный гидролиз белка пролин-специфичной протеазой и при необходимости преобразование МАР и/или ΙΤΡ в их соли.

    Фиг. 1

    Специфичность профиля ЭндоПро, тестируемый при рН 4, на ΑΑΧ-ρΝΑ субстратах, где X представляет собой все природные аминокислоты (разведение 1:3000), также включая АР-рНА и Ζ-Ο-Ρ-ρΝΑ