JP3472801B2 - アンジオテンシンｉ変換酵素阻害剤およびその製造法 - Google Patents
アンジオテンシンｉ変換酵素阻害剤およびその製造法Info
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- JP3472801B2 JP3472801B2 JP2000079588A JP2000079588A JP3472801B2 JP 3472801 B2 JP3472801 B2 JP 3472801B2 JP 2000079588 A JP2000079588 A JP 2000079588A JP 2000079588 A JP2000079588 A JP 2000079588A JP 3472801 B2 JP3472801 B2 JP 3472801B2
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、鮫の肉をサーモリ
シンで加水分解した液中に存在するペプチドを有効成分
として含有するアンジオテンシンI変換酵素阻害剤およ
びその製造法に関する。
シンで加水分解した液中に存在するペプチドを有効成分
として含有するアンジオテンシンI変換酵素阻害剤およ
びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】高血圧症の発症にはレニンーアンジオテ
ンシン系が深いかかわりを有していることが良く知られ
ているが、このレニンーアンジオテンシン系には血管内
皮細胞膜などに存在するアンジオテンシンI変換酵素 (E
C3.4.15.1、以下ACEとも言う)が重要な役割を果たして
いる。この場合、ACEは、肝臓から分泌されるアンジオ
テンシノーゲンが腎臓で産生される酵素レニンにより切
断されてできるアンジオテンシンI（Asp-Arg-Val-Tyr-I
le-His-Pro-Phe-His-Leu）に作用し、このものをアンジ
オテンシンII（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）に
変換させる。このアンジオテンシンIIは血管平滑筋を収
縮させて血圧を高め、さらに副腎皮質に作用してアルド
ステロンの分泌を促進させるなどの作用を有する。一
方、血漿中に存在する酵素カリクレインは蛋白質キニノ
ーゲンを切断することにより、血管を拡張させ降圧させ
るブラジキニンを産生するが、このブラジキニンはACE
の作用により分解され不活性化される。このように、AC
Eは一方で昇圧性ペプチドであるアンジオテンシンIIを
生じさせるとともに、他方で降圧性ペプチドであるブラ
ジキニンを分解することにより、血圧を上昇の方向に進
める。したがって、ACEの活性を抑制することによって
血圧上昇を抑制する、あるいは血圧を下げることが可能
である。
ンシン系が深いかかわりを有していることが良く知られ
ているが、このレニンーアンジオテンシン系には血管内
皮細胞膜などに存在するアンジオテンシンI変換酵素 (E
C3.4.15.1、以下ACEとも言う)が重要な役割を果たして
いる。この場合、ACEは、肝臓から分泌されるアンジオ
テンシノーゲンが腎臓で産生される酵素レニンにより切
断されてできるアンジオテンシンI（Asp-Arg-Val-Tyr-I
le-His-Pro-Phe-His-Leu）に作用し、このものをアンジ
オテンシンII（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）に
変換させる。このアンジオテンシンIIは血管平滑筋を収
縮させて血圧を高め、さらに副腎皮質に作用してアルド
ステロンの分泌を促進させるなどの作用を有する。一
方、血漿中に存在する酵素カリクレインは蛋白質キニノ
ーゲンを切断することにより、血管を拡張させ降圧させ
るブラジキニンを産生するが、このブラジキニンはACE
の作用により分解され不活性化される。このように、AC
Eは一方で昇圧性ペプチドであるアンジオテンシンIIを
生じさせるとともに、他方で降圧性ペプチドであるブラ
ジキニンを分解することにより、血圧を上昇の方向に進
める。したがって、ACEの活性を抑制することによって
血圧上昇を抑制する、あるいは血圧を下げることが可能
である。
【０００３】ACE阻害物質としては蛇毒より得られた数
種のペプチドを初めとして、カプトプリル（D-3-mercap
to-2-methylpropanoyl-L-proline）などの合成化合物が
多数知られており、カプトプリルなどは高血圧治療薬と
して使われている。また、近年、種々の食品中から多数
のACE阻害ペプチドが見出され、そのうち、牛乳カゼイ
ン、発酵乳、かつおぶし由来のペプチドを添加した食品
がそれぞれ特定保健用食品として実用化されている（特
許第1299057号（特公昭60-23085号公報）、特許第13843
41号（特公昭61-51562号公報）、特許第1382144号（特
公昭61-51564号公報、Biopolymers, 43, 119 (1997)、B
iopolymers, 43, 129 (1997)）。
種のペプチドを初めとして、カプトプリル（D-3-mercap
to-2-methylpropanoyl-L-proline）などの合成化合物が
多数知られており、カプトプリルなどは高血圧治療薬と
して使われている。また、近年、種々の食品中から多数
のACE阻害ペプチドが見出され、そのうち、牛乳カゼイ
ン、発酵乳、かつおぶし由来のペプチドを添加した食品
がそれぞれ特定保健用食品として実用化されている（特
許第1299057号（特公昭60-23085号公報）、特許第13843
41号（特公昭61-51562号公報）、特許第1382144号（特
公昭61-51564号公報、Biopolymers, 43, 119 (1997)、B
iopolymers, 43, 129 (1997)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述のようにアンジオ
テンシンI変換酵素阻害剤は既に多数報告されている
が、血管内への吸収性、安定性がより高く、安価に生産
可能なアンジオテンシンI変換酵素阻害剤は医薬品とし
てのみならず、特定保健用食品の素材としても常に求め
られている。一方、鰭を採った後の鮫の肉は食用として
の価値が低く、その有効利用が魚肉加工における大きな
課題の一つであった。
テンシンI変換酵素阻害剤は既に多数報告されている
が、血管内への吸収性、安定性がより高く、安価に生産
可能なアンジオテンシンI変換酵素阻害剤は医薬品とし
てのみならず、特定保健用食品の素材としても常に求め
られている。一方、鰭を採った後の鮫の肉は食用として
の価値が低く、その有効利用が魚肉加工における大きな
課題の一つであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鮫の肉を
微生物由来のプロテアーゼで加水分解することによりア
ンジオテンシンI変換酵素阻害剤が得られ、上記課題を
解決できることをつきとめ、本発明を完成させるに至っ
た。
微生物由来のプロテアーゼで加水分解することによりア
ンジオテンシンI変換酵素阻害剤が得られ、上記課題を
解決できることをつきとめ、本発明を完成させるに至っ
た。
【０００６】すなわち本発明は以下のものからなる。
(１) Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp
-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)か
らなるペプチド、その塩、あるいはそれらの混合物を含
むアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。 (２) 製剤学上許容可能な固体または液体の担体をさら
に含む、上記(１)のアンジオテンシンI変換酵素阻害
剤。 (３) 高血圧の治療または予防用である、上記(１)又
は(２)のアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。 (４) Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp
-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)か
らなるペプチド、その塩、あるいはそれらの混合物を含
む食品。
-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)か
らなるペプチド、その塩、あるいはそれらの混合物を含
むアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。 (２) 製剤学上許容可能な固体または液体の担体をさら
に含む、上記(１)のアンジオテンシンI変換酵素阻害
剤。 (３) 高血圧の治療または予防用である、上記(１)又
は(２)のアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。 (４) Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp
-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)か
らなるペプチド、その塩、あるいはそれらの混合物を含
む食品。
【０００７】(５) 鮫の肉をプロテアーゼで加水分解
し、ペプチドを回収することを含む、Met-Trp、Val-Thr
-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp-Ala、Val-Trp、又はPhe-
Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)からなるペプチ
ド、あるいはそれらの混合物の製造方法。 (６) 前記プロテアーゼが、微生物由来である、上記
(５)の方法。 (７) 微生物由来のプロテアーゼが、バチルス（Bacill
us）属またはシュウドモナス(Psudomonas)属細菌由来の
プロテアーゼである、上記(６)の方法。 (８) 前記プロテアーゼが、バチルス・サーモプロテオ
リチカス（Bacillus thermoproteolyticus）由来のサー
モリシンである、上記(７)の方法。
し、ペプチドを回収することを含む、Met-Trp、Val-Thr
-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp-Ala、Val-Trp、又はPhe-
Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)からなるペプチ
ド、あるいはそれらの混合物の製造方法。 (６) 前記プロテアーゼが、微生物由来である、上記
(５)の方法。 (７) 微生物由来のプロテアーゼが、バチルス（Bacill
us）属またはシュウドモナス(Psudomonas)属細菌由来の
プロテアーゼである、上記(６)の方法。 (８) 前記プロテアーゼが、バチルス・サーモプロテオ
リチカス（Bacillus thermoproteolyticus）由来のサー
モリシンである、上記(７)の方法。
【０００８】(９) 加水分解前に、鮫の肉を加熱変性、
ホモジェナイゼーション処理にかけることをさらに含
む、上記(５)の方法。 (10) 加水分解後に、生成物をサイズ分離及び/又はア
ニオン交換クロマトグラフィーにかけることをさらに含
む、上記(5)の方法。 (11) 加水分解を、pH約7．5〜8.5、温度約30℃〜約40
℃で約４〜5時間行う、上記(5)〜(8)のいずれかの方
法。 （12）上記(5)〜(11)のいずれかの方法によって得られ
る、Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp-Al
a、Val-Trp、およびPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列
番号1)からなる群から選択される少なくとも２つのペプ
チドの混合物。
ホモジェナイゼーション処理にかけることをさらに含
む、上記(５)の方法。 (10) 加水分解後に、生成物をサイズ分離及び/又はア
ニオン交換クロマトグラフィーにかけることをさらに含
む、上記(5)の方法。 (11) 加水分解を、pH約7．5〜8.5、温度約30℃〜約40
℃で約４〜5時間行う、上記(5)〜(8)のいずれかの方
法。 （12）上記(5)〜(11)のいずれかの方法によって得られ
る、Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Trp-Al
a、Val-Trp、およびPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列
番号1)からなる群から選択される少なくとも２つのペプ
チドの混合物。
【０００９】本明細書中プロテアーゼとは、本発明に係
るペプチド類を切り出すことが可能であるいずれかのプ
ロテアーゼを意味し、さらに別の表現をすれば、大きな
疎水性側鎖をもつアミノ酸残基のアミノ基側のペプチド
結合を主として切断する性質のある(例えばサーモリシ
ンと同等または類似の基質特異性をもつ)プロテアーゼ
を意味する。また混合物とは、本発明に係る少なくとも
２つのペプチドの混合物を意味する。
るペプチド類を切り出すことが可能であるいずれかのプ
ロテアーゼを意味し、さらに別の表現をすれば、大きな
疎水性側鎖をもつアミノ酸残基のアミノ基側のペプチド
結合を主として切断する性質のある(例えばサーモリシ
ンと同等または類似の基質特異性をもつ)プロテアーゼ
を意味する。また混合物とは、本発明に係る少なくとも
２つのペプチドの混合物を意味する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のMet-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Tr
p-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)
で表されるペプチドあるいはその混合物は例えば、沸騰
水で加熱変性させた鮫の肉をプロテアーゼで処理し、そ
の加水分解物から得ることができる。ここで、該ペプチ
ドを単離する鮫の種類は、特に限定はされないが、（オ
ナガザメAlopias plagicus）、ヨシキリザメ（Prionace
glauca）、アオザメ（Isurus oxyrinchus）、アカシュ
モクザメ（Sphyma lewini）、メジロザメ（Carcharhinu
s plumbeus）、ホシザメ（Mustelus manazo）、ネコザ
メ（Heterodontus japonicus）、フジクジラ（Etmopter
us lucifer）、ヒラガシラ（Rhizoprionodon acutus）
等が好適に用いられる。また、本発明の配列番号１〜５
で表されるペプチドは当該ペプチドと同一のアミノ酸配
列部分を含有する他の生物の蛋白質から上記と同様の酵
素的加水分解法で得ることもできる。あるいは本発明の
上記ペプチドは、有機化学的な合成方法によりアミノ酸
を段階的に導入する通常のペプチド合成法や、遺伝子工
学的手法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合
成法を用いても生産することができる。
本発明のMet-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、Leu-Tr
p-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)
で表されるペプチドあるいはその混合物は例えば、沸騰
水で加熱変性させた鮫の肉をプロテアーゼで処理し、そ
の加水分解物から得ることができる。ここで、該ペプチ
ドを単離する鮫の種類は、特に限定はされないが、（オ
ナガザメAlopias plagicus）、ヨシキリザメ（Prionace
glauca）、アオザメ（Isurus oxyrinchus）、アカシュ
モクザメ（Sphyma lewini）、メジロザメ（Carcharhinu
s plumbeus）、ホシザメ（Mustelus manazo）、ネコザ
メ（Heterodontus japonicus）、フジクジラ（Etmopter
us lucifer）、ヒラガシラ（Rhizoprionodon acutus）
等が好適に用いられる。また、本発明の配列番号１〜５
で表されるペプチドは当該ペプチドと同一のアミノ酸配
列部分を含有する他の生物の蛋白質から上記と同様の酵
素的加水分解法で得ることもできる。あるいは本発明の
上記ペプチドは、有機化学的な合成方法によりアミノ酸
を段階的に導入する通常のペプチド合成法や、遺伝子工
学的手法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合
成法を用いても生産することができる。
【００１１】以下に、本発明のペプチドを鮫の肉より生
産する方法を具体的に説明する。鮫の普通筋を蒸留水に
入れ、蛋白が変性を起こす約70℃以上、好ましくは約80
〜約100℃の温度で加熱変性処理(例えば約5〜約15分)し
た後に、ホモジェナイズ処理する。得られたホモジェネ
ートに酸性〜アルカリ性領域、好ましくは中性〜弱アル
カリ性領域の緩衝液(例えばトリス塩酸)を加え、さらに
ホモジェネートに対し0.1〜10重量％、好ましくは1〜4
重量％のプロテアーゼを添加し、約20〜約70℃の温度で
約0.5〜約24時間攪拌して酵素による加水分解反応を行
わせる。その後、酵素を失活させるため5〜10分間程度
の煮沸処理を行い、生じた沈殿物をろ過して除去し、ろ
液をさらにサイズ分離、例えばゲルろ過または限外ろ過
にかけて分子量10,000以下の低分子量物質を回収する。
使用する限外ろ過膜としては、例えばYM-10（アミコン
社）が挙げられる。
産する方法を具体的に説明する。鮫の普通筋を蒸留水に
入れ、蛋白が変性を起こす約70℃以上、好ましくは約80
〜約100℃の温度で加熱変性処理(例えば約5〜約15分)し
た後に、ホモジェナイズ処理する。得られたホモジェネ
ートに酸性〜アルカリ性領域、好ましくは中性〜弱アル
カリ性領域の緩衝液(例えばトリス塩酸)を加え、さらに
ホモジェネートに対し0.1〜10重量％、好ましくは1〜4
重量％のプロテアーゼを添加し、約20〜約70℃の温度で
約0.5〜約24時間攪拌して酵素による加水分解反応を行
わせる。その後、酵素を失活させるため5〜10分間程度
の煮沸処理を行い、生じた沈殿物をろ過して除去し、ろ
液をさらにサイズ分離、例えばゲルろ過または限外ろ過
にかけて分子量10,000以下の低分子量物質を回収する。
使用する限外ろ過膜としては、例えばYM-10（アミコン
社）が挙げられる。
【００１２】上記低分子量物質をさらに低分子量域分離
用のゲル濾過カラムに負荷し、30％メタノールで溶出し
てアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有する画分を
回収する。必要に応じて次いで、この画分をイオン交換
カラムに負荷して、蒸留水で溶出後、更に0〜1Mの塩化
ナトリウムの直線濃度勾配により溶出される活性画分を
回収する。上記活性画分を逆相カラムを装填した高速液
体クロマトグラフィー(HPLC)に供し、0.1％トリフルオ
ロ酢酸を含む0〜63％のアセトニトリルの直線濃度勾配
により分画する。
用のゲル濾過カラムに負荷し、30％メタノールで溶出し
てアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有する画分を
回収する。必要に応じて次いで、この画分をイオン交換
カラムに負荷して、蒸留水で溶出後、更に0〜1Mの塩化
ナトリウムの直線濃度勾配により溶出される活性画分を
回収する。上記活性画分を逆相カラムを装填した高速液
体クロマトグラフィー(HPLC)に供し、0.1％トリフルオ
ロ酢酸を含む0〜63％のアセトニトリルの直線濃度勾配
により分画する。
【００１３】回収した活性画分を減圧乾固することによ
り、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有する本発
明のペプチドまたはその混合物を得ることができる。上
記プロテアーゼとしては、微生物由来のプロテアーゼ、
例えば、バチルス・サーモプロテオリチカス（Bacillus
thermoproteolyticus）、バチスル・ズブチリス（Baci
llus subutilis）、バチルス・マガテリウム（Bacillus
megaterium）、シュウドモナス・アエルギノサ（Psudo
monas aeruginosa）等を由来とするプロテアーゼが挙げ
られる。具体的には、Bacillus thermoproteolyticus由
来のサーモリシン（EC3.4.24.27；シグマ社製）が好適
に使用される。
り、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有する本発
明のペプチドまたはその混合物を得ることができる。上
記プロテアーゼとしては、微生物由来のプロテアーゼ、
例えば、バチルス・サーモプロテオリチカス（Bacillus
thermoproteolyticus）、バチスル・ズブチリス（Baci
llus subutilis）、バチルス・マガテリウム（Bacillus
megaterium）、シュウドモナス・アエルギノサ（Psudo
monas aeruginosa）等を由来とするプロテアーゼが挙げ
られる。具体的には、Bacillus thermoproteolyticus由
来のサーモリシン（EC3.4.24.27；シグマ社製）が好適
に使用される。
【００１４】本発明のペプチドをペプチド合成法によっ
て得る場合は、固相ペプチド合成法または液相ペプチド
合成法を用いればよく、例えば泉屋信夫著「ペプチド合
成の基礎と実験」（丸善発行）などに記載されている方
法に準じて行えばよい。
て得る場合は、固相ペプチド合成法または液相ペプチド
合成法を用いればよく、例えば泉屋信夫著「ペプチド合
成の基礎と実験」（丸善発行）などに記載されている方
法に準じて行えばよい。
【００１５】また、加水分解酵素の逆反応を利用したペ
プチド合成法により行うこともでき、この場合は、例え
ば、一島英治編「プロテアーゼ」（学会出版センター発
行）などに記載されている方法に準じて行えばよい。本
合成法では、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼＹ
などの酵素を用い、一般に酵素、原料の保護アミノ酸と
も、分解反応における値よりも高濃度を添加し、必要に
応じメタノール、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒
を添加した状態で反応させ、アミノ酸のペプチド結合を
順次形成させる。
プチド合成法により行うこともでき、この場合は、例え
ば、一島英治編「プロテアーゼ」（学会出版センター発
行）などに記載されている方法に準じて行えばよい。本
合成法では、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼＹ
などの酵素を用い、一般に酵素、原料の保護アミノ酸と
も、分解反応における値よりも高濃度を添加し、必要に
応じメタノール、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒
を添加した状態で反応させ、アミノ酸のペプチド結合を
順次形成させる。
【００１６】また、本発明のペプチドを、遺伝子工学的
方法により得る場合は、該ペプチドをコードする遺伝子
を含むDNAを挿入した組み換え体DNAにより、宿主細胞を
形質転換または形質導入し、得られた組み換え宿主を用
いて生産させるという公知の手法（例えばSambrook et
al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9に記載される方法）により行うことが出来る。
方法により得る場合は、該ペプチドをコードする遺伝子
を含むDNAを挿入した組み換え体DNAにより、宿主細胞を
形質転換または形質導入し、得られた組み換え宿主を用
いて生産させるという公知の手法（例えばSambrook et
al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9に記載される方法）により行うことが出来る。
【００１７】上記のようにして得られた本発明のペプチ
ドのアンジオテンシンI変換酵素阻害活性は、川岸舜朗
編「食品中の生体機能調節物質研究法（生物化学実験法
38）」（ 学会出版センター発行）に記載されている方
法で測定することができる。すなわり、アンジオテンシ
ンI変換酵素に緩衝液を加えたものを酵素溶液、またHip
puryl-His-Leu（ペプチド研究所製）を緩衝液に溶解し
たものを基質溶液とし、本発明の試料溶液と上記酵素溶
液とを混合し、さらに上記基質溶液を加えて酵素反応さ
せて、反応停止後に遊離してくるHippuric acid（馬尿
酸）をHPLCにより定量し、阻害率を算出すればよい。
ドのアンジオテンシンI変換酵素阻害活性は、川岸舜朗
編「食品中の生体機能調節物質研究法（生物化学実験法
38）」（ 学会出版センター発行）に記載されている方
法で測定することができる。すなわり、アンジオテンシ
ンI変換酵素に緩衝液を加えたものを酵素溶液、またHip
puryl-His-Leu（ペプチド研究所製）を緩衝液に溶解し
たものを基質溶液とし、本発明の試料溶液と上記酵素溶
液とを混合し、さらに上記基質溶液を加えて酵素反応さ
せて、反応停止後に遊離してくるHippuric acid（馬尿
酸）をHPLCにより定量し、阻害率を算出すればよい。
【００１８】本発明のペプチドまたはその塩は、そのま
まで、または通常用いられる固体担体、液体担体、乳化
分散剤等により錠剤、粉剤、水和剤、乳剤、溶液剤、懸
濁剤、カプセル剤等の形に製剤化してアンジオテンシン
I変換酵素阻害剤、好ましくは高血圧の治療または予防
用の医薬品として使用することができる。上記担体とし
ては、水、生理食塩水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸
マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。ま
た、本発明のペプチドまたはその塩はさまざまな食品中
に添加して機能性食品、特定保健用食品などとして用い
ることができる。かかる食品として、清涼飲料、乳酸飲
料、スープ、チーズ、ハム、菓子類などが挙げられる。
まで、または通常用いられる固体担体、液体担体、乳化
分散剤等により錠剤、粉剤、水和剤、乳剤、溶液剤、懸
濁剤、カプセル剤等の形に製剤化してアンジオテンシン
I変換酵素阻害剤、好ましくは高血圧の治療または予防
用の医薬品として使用することができる。上記担体とし
ては、水、生理食塩水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸
マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。ま
た、本発明のペプチドまたはその塩はさまざまな食品中
に添加して機能性食品、特定保健用食品などとして用い
ることができる。かかる食品として、清涼飲料、乳酸飲
料、スープ、チーズ、ハム、菓子類などが挙げられる。
【００１９】上記本発明のペプチドの塩としては、製剤
学上許容されうる酸付加塩および塩基付加塩である。製
剤学上許容されうる酸付加塩として、例えば、塩酸、硫
酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、プロ
ピオン酸、グリコール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石
酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸との塩等が
挙げられ、また製剤学上許容されうる塩基付加塩として
は、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属
塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウ
ム、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘ
キシルアミン等のアミン類との塩等が挙げられる。
学上許容されうる酸付加塩および塩基付加塩である。製
剤学上許容されうる酸付加塩として、例えば、塩酸、硫
酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、プロ
ピオン酸、グリコール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石
酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸との塩等が
挙げられ、また製剤学上許容されうる塩基付加塩として
は、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属
塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウ
ム、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘ
キシルアミン等のアミン類との塩等が挙げられる。
【００２０】本発明のペプチドを有効成分として含有す
るアンジオテンシンI変換酵素阻害剤の使用形態として
は、例えば静脈注射、直腸投与等の非経口的投与、ある
いは経口的投与が例示される。
るアンジオテンシンI変換酵素阻害剤の使用形態として
は、例えば静脈注射、直腸投与等の非経口的投与、ある
いは経口的投与が例示される。
【００２１】アンジオテンシンI変換酵素阻害剤中にお
ける本発明のペプチドの含有量は、その投与経路、剤形
によって適宜変更しうるが、例えば、製剤全重量に対し
て本発明のペプチドまたはその混合物を5〜90重量％、
好ましくは10〜60重量％含有させる。また、機能性食
品、特定保健用食品に添加して用いる場合には、例えば
該食品中における本発明のペプチドまたはその混合物を
0.01〜50重量％含有させる。
ける本発明のペプチドの含有量は、その投与経路、剤形
によって適宜変更しうるが、例えば、製剤全重量に対し
て本発明のペプチドまたはその混合物を5〜90重量％、
好ましくは10〜60重量％含有させる。また、機能性食
品、特定保健用食品に添加して用いる場合には、例えば
該食品中における本発明のペプチドまたはその混合物を
0.01〜50重量％含有させる。
【００２２】
【実施例】以下、本発明を実施例、試験例に基づいて説
明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。 実施例１ アンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドの
精製 鮫（オナガザメ、Alopias plagicus）の普通筋35gを蒸
留水35mlに入れ、10分間沸騰させて熱変性させた後、ポ
リトロンを用いてホモジェナイズした。これに50mlのト
リス塩酸緩衝液（100mM、pH8.2、10mM塩化カルシウムを
含む）を加え、35mgのサーモリシン（シグマ社製）を添
加し、37℃で4.5時間撹拌した。100℃で10分間加熱後、
氷水中で急冷し、ろ紙で沈殿物を除去した後、分画分子
量10,000の限外濾過膜YM-10（アミコン社）に付して、
通過する低分子量の物質を回収した。この試料を濃縮
後、セファデックスLH-20カラム（ファルマシア社、26
x 900 mm）に負荷し、30％メタノールで溶出し、アンジ
オテンシンI変換酵素阻害活性（測定法については後記
試験例１に記述）を有する画分Ａ（250〜270mlの画分）
及び画分Ｂ（350〜370mlの画分）を回収した。
明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。 実施例１ アンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドの
精製 鮫（オナガザメ、Alopias plagicus）の普通筋35gを蒸
留水35mlに入れ、10分間沸騰させて熱変性させた後、ポ
リトロンを用いてホモジェナイズした。これに50mlのト
リス塩酸緩衝液（100mM、pH8.2、10mM塩化カルシウムを
含む）を加え、35mgのサーモリシン（シグマ社製）を添
加し、37℃で4.5時間撹拌した。100℃で10分間加熱後、
氷水中で急冷し、ろ紙で沈殿物を除去した後、分画分子
量10,000の限外濾過膜YM-10（アミコン社）に付して、
通過する低分子量の物質を回収した。この試料を濃縮
後、セファデックスLH-20カラム（ファルマシア社、26
x 900 mm）に負荷し、30％メタノールで溶出し、アンジ
オテンシンI変換酵素阻害活性（測定法については後記
試験例１に記述）を有する画分Ａ（250〜270mlの画分）
及び画分Ｂ（350〜370mlの画分）を回収した。
【００２３】次いで、この画分ＡをDEAEトヨパール650M
カラム（東ソー社、16 x 650 mm）に負荷し、蒸留水で
溶出される活性画分（未吸着画分）を回収した。これを
更に、SPトヨパール650Sカラム（東ソー社、16 x 650 m
m）に負荷し、０〜１Mの塩化ナトリウムの直線濃度勾配
により溶出される活性画分A-1（0.4Mの塩化ナトリウム
で溶出される位置）を回収した。この活性画分は更にμ
Bondapak C18カラム（ウォーターズ社3.9 x 300 mm）を
用いたHPLCで、0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％の
アセトニトリルの直線濃度勾配溶出により分画した。ア
セトニトリル濃度24％及び50％付近に溶出される活性画
分（それぞれA-1-1、A-1-2）を得た。
カラム（東ソー社、16 x 650 mm）に負荷し、蒸留水で
溶出される活性画分（未吸着画分）を回収した。これを
更に、SPトヨパール650Sカラム（東ソー社、16 x 650 m
m）に負荷し、０〜１Mの塩化ナトリウムの直線濃度勾配
により溶出される活性画分A-1（0.4Mの塩化ナトリウム
で溶出される位置）を回収した。この活性画分は更にμ
Bondapak C18カラム（ウォーターズ社3.9 x 300 mm）を
用いたHPLCで、0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％の
アセトニトリルの直線濃度勾配溶出により分画した。ア
セトニトリル濃度24％及び50％付近に溶出される活性画
分（それぞれA-1-1、A-1-2）を得た。
【００２４】また、セファデックスLH-20カラムの画分
ＢはSPトヨパール650Sカラムに負荷し、蒸留水で溶出さ
れる活性画分（未吸着画分）を回収した。これを更にDE
AEトヨパール650Mカラムに負荷し、０〜１Mの塩化ナト
リウムの直線濃度勾配により溶出される活性画分B-1
（塩化ナトリウム0.5Mの位置）、 B-2（塩化ナトリウム
0.7Mの位置）、B-3（塩化ナトリウム0.8Mの位置）を回
収した。それぞれの活性画分は更にμBondapak C18カラ
ム（ウォーターズ社3.9 x 300 mm）を用いたHPLCで、0.
1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセトニトリルの
直線濃度勾配溶出により分画した。B-1画分からはアセ
トニトリル濃度50％付近に溶出される活性画分B-1-1を
得た。B-2画分からはアセトニトリル濃度50％付近に溶
出される活性画分B-2-1及びアセトニトリル濃度53％付
近に溶出される活性画分B-2-2を得た。また、B-3画分か
らはアセトニトリル濃度53％付近に溶出される活性画分
B-3-1を得た。回収した6種類の物質は、減圧乾固し最終
標品とした。阻害物質の構造はアプライドバイオシステ
ムズ社プロテインシークエンサー491型により解析した
ところ、A-1-1のペプチドはVal-Thr-Arg、A-1-2のペプ
チドはPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)、B-1-
1のペプチドはVal-Ser-Trp、B-2-1のペプチドはVal-Tr
p、B-2-2のペプチドはLeu-Trp-Ala、B-3-1のペプチドは
Met-Trpで表されるアミノ酸配列を有するペプチドあっ
た。
ＢはSPトヨパール650Sカラムに負荷し、蒸留水で溶出さ
れる活性画分（未吸着画分）を回収した。これを更にDE
AEトヨパール650Mカラムに負荷し、０〜１Mの塩化ナト
リウムの直線濃度勾配により溶出される活性画分B-1
（塩化ナトリウム0.5Mの位置）、 B-2（塩化ナトリウム
0.7Mの位置）、B-3（塩化ナトリウム0.8Mの位置）を回
収した。それぞれの活性画分は更にμBondapak C18カラ
ム（ウォーターズ社3.9 x 300 mm）を用いたHPLCで、0.
1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセトニトリルの
直線濃度勾配溶出により分画した。B-1画分からはアセ
トニトリル濃度50％付近に溶出される活性画分B-1-1を
得た。B-2画分からはアセトニトリル濃度50％付近に溶
出される活性画分B-2-1及びアセトニトリル濃度53％付
近に溶出される活性画分B-2-2を得た。また、B-3画分か
らはアセトニトリル濃度53％付近に溶出される活性画分
B-3-1を得た。回収した6種類の物質は、減圧乾固し最終
標品とした。阻害物質の構造はアプライドバイオシステ
ムズ社プロテインシークエンサー491型により解析した
ところ、A-1-1のペプチドはVal-Thr-Arg、A-1-2のペプ
チドはPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)、B-1-
1のペプチドはVal-Ser-Trp、B-2-1のペプチドはVal-Tr
p、B-2-2のペプチドはLeu-Trp-Ala、B-3-1のペプチドは
Met-Trpで表されるアミノ酸配列を有するペプチドあっ
た。
【００２５】次に、上記で表されるペプチドと同一の配
列を有する化学合成ペプチドの下記条件下におけるHPLC
ピークの保持時間を鮫から得られたペプチドの保持時間
と比較した。 HPLCの条件： カラム：μBondasphere C18（ウォーターズ社3.9 x 150
mm） 溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配（20分） 流速：１ml/min 検出：210nmの紫外部吸収
列を有する化学合成ペプチドの下記条件下におけるHPLC
ピークの保持時間を鮫から得られたペプチドの保持時間
と比較した。 HPLCの条件： カラム：μBondasphere C18（ウォーターズ社3.9 x 150
mm） 溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配（20分） 流速：１ml/min 検出：210nmの紫外部吸収
【００２６】化学合成したペプチドVal-Thr-Arg、Phe-A
rg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn、Val-Ser-Trp、Val-Trp、Leu-
Trp-Ala、Met-Trpの保持時間はそれぞれ5.30、11.30、1
1.31、10.63、11.45、11.36分であり、鮫の酵素加水分
解物から精製したそれぞれのペプチドの保持時間と一致
した。なお、Val-Trpで表されるペプチドはThe Journal
of Biological Chemistry,Vol.255, p.401 (1980)に記
載されたアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドと同
一であることが判明した。
rg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn、Val-Ser-Trp、Val-Trp、Leu-
Trp-Ala、Met-Trpの保持時間はそれぞれ5.30、11.30、1
1.31、10.63、11.45、11.36分であり、鮫の酵素加水分
解物から精製したそれぞれのペプチドの保持時間と一致
した。なお、Val-Trpで表されるペプチドはThe Journal
of Biological Chemistry,Vol.255, p.401 (1980)に記
載されたアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドと同
一であることが判明した。
【００２７】試験例１ アンジオテンシンI変換酵素阻
害活性の測定 実施例１におけるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性
の測定は下記の方法により行った。シグマ社より購入し
たウサギ肺由来アンジオテンシンI変換酵素を緩衝液（2
2mMホウ酸緩衝液、pH8.3）に溶解し、60 mU/mlの酵素溶
液とした。また、ペプチド研究所(大阪)より購入したHi
p-His-Leu （Hippuryl-L-histidyl-L-leucine）及び塩
化ナトリウムを上記ホウ酸緩衝液に溶解し、それぞれ7.
6mM、608mMの濃度（反応液中での終濃度はそれぞれ5m
M、400mMになる）とし、基質溶液とした。0.5ml容量の
プラスチックチューブに、試料溶液15μl、上記酵素溶
液50μlを入れ、37℃で5分間保温した後、上記基質溶液
125μlを加えよく混合して、37℃で30分の反応を行っ
た。その後、10％トリフルオロ酢酸20μlを添加するこ
とにより反応を停止させた。反応停止後、酵素反応によ
り遊離した馬尿酸を下記条件下でHPLCにより定量した。 HPLC測定条件： カラム：μBondasphere 5μC8 300Å（ウォーターズ社
3.9 x 150 mm） 溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配（20分） 流速：１ml/min 検出：228nmの紫外部吸収
害活性の測定 実施例１におけるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性
の測定は下記の方法により行った。シグマ社より購入し
たウサギ肺由来アンジオテンシンI変換酵素を緩衝液（2
2mMホウ酸緩衝液、pH8.3）に溶解し、60 mU/mlの酵素溶
液とした。また、ペプチド研究所(大阪)より購入したHi
p-His-Leu （Hippuryl-L-histidyl-L-leucine）及び塩
化ナトリウムを上記ホウ酸緩衝液に溶解し、それぞれ7.
6mM、608mMの濃度（反応液中での終濃度はそれぞれ5m
M、400mMになる）とし、基質溶液とした。0.5ml容量の
プラスチックチューブに、試料溶液15μl、上記酵素溶
液50μlを入れ、37℃で5分間保温した後、上記基質溶液
125μlを加えよく混合して、37℃で30分の反応を行っ
た。その後、10％トリフルオロ酢酸20μlを添加するこ
とにより反応を停止させた。反応停止後、酵素反応によ
り遊離した馬尿酸を下記条件下でHPLCにより定量した。 HPLC測定条件： カラム：μBondasphere 5μC8 300Å（ウォーターズ社
3.9 x 150 mm） 溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配（20分） 流速：１ml/min 検出：228nmの紫外部吸収
【００２８】このような実験を複数回行い、阻害率を次
の式より算出した。 阻害率＝ (A - B) / A × 100 (％) ［式中、Ａ：阻害剤を含まない場合の馬尿酸のピーク面
積、Ｂ：阻害剤添加の場合の馬尿酸のピーク面積］ また、上記阻害率が50％になるペプチド濃度をIC50値で
表した。このようにして得られたIC50値を表1に示す。
の式より算出した。 阻害率＝ (A - B) / A × 100 (％) ［式中、Ａ：阻害剤を含まない場合の馬尿酸のピーク面
積、Ｂ：阻害剤添加の場合の馬尿酸のピーク面積］ また、上記阻害率が50％になるペプチド濃度をIC50値で
表した。このようにして得られたIC50値を表1に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【発明の効果】本発明により、アンジオテンシンI変換
酵素阻害活性を有するペプチドが提供される。本発明の
ペプチドは高血圧治療や予防のための医薬品、特定保健
用食品の素材として、あるいは新しい化合物をデザイン
するリード化合物としての試薬として利用することがで
きる。
酵素阻害活性を有するペプチドが提供される。本発明の
ペプチドは高血圧治療や予防のための医薬品、特定保健
用食品の素材として、あるいは新しい化合物をデザイン
するリード化合物としての試薬として利用することがで
きる。
【００３１】
SEQUENCE LISTING
<110> Director General, Agency of Industrial Scien
ce and Technology <120> Inhibitors for angiotensin converting enzyme
and processes for preparing the same <130> 11900314 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Alopias plagicus <400> 1 Phe Arg Val Pro Thr Pro Asn 1 5
ce and Technology <120> Inhibitors for angiotensin converting enzyme
and processes for preparing the same <130> 11900314 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Alopias plagicus <400> 1 Phe Arg Val Pro Thr Pro Asn 1 5
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 5/08 Ｃ０７Ｋ 7/06
7/06 Ｃ１２Ｎ 9/99
Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/06
Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ６１Ｋ 37/64
(56)参考文献 特開 平３−251543（ＪＰ，Ａ)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1973，Ｖ
ｏｌ．16，Ｎｏ．３，ｐ．166−８
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 5/06,5/08,7/06
C12P 1/00 - 41/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
Claims (12)
- 【請求項１】 Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、
Leu-Trp-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列
番号1)からなるペプチド、その塩、あるいはそれらの混
合物を含むアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。 - 【請求項２】 製剤学上許容可能な固体または液体の担
体をさらに含む、請求項１に記載のアンジオテンシンI
変換酵素阻害剤。 - 【請求項３】 高血圧の治療または予防用である、請求
項１又は２に記載のアンジオテンシンI変換酵素阻害
剤。 - 【請求項４】 Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-Trp 、
Leu-Trp-Ala、又はPhe-Arg-Val-Pro-Thr-Pro-Asn(配列
番号1)からなるペプチド、その塩、あるいはそれらの混
合物を含む食品。 - 【請求項５】 鮫の肉をプロテアーゼで加水分解し、ペ
プチドを回収することを含む、Met-Trp、Val-Thr-Arg、
Val-Ser-Trp 、Leu-Trp-Ala、Val-Trp、又はPhe-Arg-Va
l-Pro-Thr-Pro-Asn(配列番号1)からなるペプチド、ある
いはそれらの混合物の製造方法。 - 【請求項６】 前記プロテアーゼが、微生物由来であ
る、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 微生物由来のプロテアーゼが、バチルス
（Bacillus）属またはシュウドモナス(Psudomonas)属細
菌由来のプロテアーゼである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記プロテアーゼが、バチルス・サーモ
プロテオリチカス（Bacillus thermoproteolyticus）由
来のサーモリシンである、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 加水分解前に、鮫の肉を加熱変性、ホモ
ジェナイゼーション処理にかけることをさらに含む、請
求項５に記載の方法。 - 【請求項１０】 加水分解後に、生成物をサイズ分離及
び/又はアニオン交換クロマトグラフィーにかけること
をさらに含む、請求項５に記載の方法。 - 【請求項１１】 加水分解を、pH約7．5〜8.5、温度約3
0℃〜約40℃で約４〜5時間行う、請求項５〜８のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１２】 請求項５〜１１のいずれかに記載の方
法によって得られる、Met-Trp、Val-Thr-Arg、Val-Ser-
Trp 、Leu-Trp-Ala、Val-TrpおよびPhe-Arg-Val-Pro-Th
r-Pro-Asn(配列番号1)からなる群から選択される少なく
とも２つのペプチドの混合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000079588A JP3472801B2 (ja) | 2000-03-22 | 2000-03-22 | アンジオテンシンｉ変換酵素阻害剤およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000079588A JP3472801B2 (ja) | 2000-03-22 | 2000-03-22 | アンジオテンシンｉ変換酵素阻害剤およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001261698A JP2001261698A (ja) | 2001-09-26 |
| JP3472801B2 true JP3472801B2 (ja) | 2003-12-02 |
Family
ID=18596820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000079588A Expired - Lifetime JP3472801B2 (ja) | 2000-03-22 | 2000-03-22 | アンジオテンシンｉ変換酵素阻害剤およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2841473B1 (fr) * | 2002-06-27 | 2004-09-17 | Ingredia | Utilisation d'au moins un peptide de la caseine s2 a activite inhbitrice de l'enzyme de conversion de l'engiotensine i pour la preparation de medicaments, d'aliments et de complements alimentaires |
| JP4828890B2 (ja) * | 2005-08-12 | 2011-11-30 | プリマハム株式会社 | 食肉タンパク質由来の抗疲労ペプチド |
| JP6296722B2 (ja) * | 2012-07-31 | 2018-03-20 | サンスター株式会社 | 米糠酵素処理組成物 |
| JP5963093B2 (ja) * | 2014-02-18 | 2016-08-03 | 株式会社 レオロジー機能食品研究所 | Ｔｒｐ含有ペプチドの製造方法 |
| JPWO2021059840A1 (ja) * | 2019-09-27 | 2021-10-07 | 太陽化学株式会社 | アンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
-
2000
- 2000-03-22 JP JP2000079588A patent/JP3472801B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７３，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．３，ｐ．１６６−８ |
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