JPH03251543A - アンジオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な活性ペプチドを含有するアンジオテン
シン変換酵素阻害剤に関するものであり。

このものは、高血圧の治療もしくは予防に対して有用性
が期待できるものである。

（従来の技術） アンジオテンシン■は、アミノ酸１０個からなるデカペ
プチドである。腎臓に存在するタンパク分解酵素レニン
が血清中に存在するアンジオテンシンゲンに作用するこ
とにより、アンジオテンシンエが生成する。アンジオテ
ンシン変換酵素は。

アンジオテンシンＩのＣ末端よりジペプチドを開裂遊離
させ、アンジオテンシン■として知られているオクタペ
プチドを生成させる。アンジオテンシン■は１強力な昇
圧作用を有している。また。

アンジオテンシン変換酵素は、降圧作用を有する生体内
物質のブラジキニンを分解し、不活性化させることも知
られている。従って、アンジオテンシン変換酵素阻害剤
は、臨床的には高血圧症の予防、治療に有効である。

従来、天然に見出されるアンジオテンシン変換酵素阻害
活性を有する物質としては、蛇毒ペプチド及びその類縁
体あるいは牛乳カゼインをトリプシンにより分解して得
られたペプチド類が知られている（特開昭５８−１０９
４２５号公報、同５９−４４３２３号公報、同６１−３
６２２６号公報参照）。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、上記したような物質は、トリプシンなど
の酵素処理により得られるので、精製が煩雑となるだけ
でなく、高価なトリプシンが必要であるという問題を有
していた。

天然には、未発見のアンジオテンシン変換酵素阻害作用
物質の存在する可能性があり、天然物の酵素処理や酸加
水分解によるこれら降圧物質の探索が望まれている。

本発明は、入手容易な微生物の菌体抽出物を酸加水分解
するだけで容易に得られるアンジオテンシン変換酵素阻
害剤を提供することを目的としている。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記課題を解決するた於、鋭意検討した
結果、好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフィルス
の菌体抽出液の加水分解液中にアンジオテンシン変換酵
素阻害作用を有する物質が数種存在することを突き止め
、さらに、その物質を同定したところ、オリゴペプチド
であることを見出して本発明を完成した。

すなわち、第１の本発明は、下式で示されるデカペプチ
ド （ａ）　Ｇ　Ｉｙ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　１ｕ−４１ｅｕ−Ｉ
ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ−
Ａ　ｒｇを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻
害剤。

第２の本発明は、下式で示されるデカペプチド（ｂ）Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒを有効成分とするアンジオ
テンシン変換酵素阻害剤。

第３の本発明は、下式で示されるオクタペプチド （Ｃ）Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕを有効成分とするアンジオテン
シン変換酵素阻害剤を要旨とするものである。

以下１本発明の詳細な説明する。

第１〜３の本発明の有効成分であるペプチドは。

菌体抽出物を処理することによって、あるいは化学合成
法によって得ることができる。

先ず、菌体抽出物を処理して本発明の有効成分を得る方
法について説明する。

菌体としては、バチルス属、クロストリジウム属、ロイ
コノストック属あるいはストレプトコツカス属などの微
生物があげられる。その中でも連続培養が容易で菌体が
得やずいという点で、バチルス属が好ましい。

菌体を得る方法としては、バッチ式あるいは連続式の培
養方法がある。

抽出物を得る方法としては、菌体を、界面活性剤、リゾ
チームなどの酵素あるいはＥＤＴＡなどの薬剤と処理す
る方法、または圧力をかける。ガラスピーズと磨り潰す
、凍結融解を緩り返す、超音波処理するなどの物理的方
法さらには菌体を自己消化させる方法があげられる。特
に、操作が簡便で安価であることから、自己消化により
菌体抽出物を得る方法が好ましい。

上記のようにして得られた抽出物の処理の方法としては
、酢酸、塩酸、トリフルオロ酢酸などの酸と菌体抽出物
を加温して、一定時間加水分解する方法があげられる。

これらのなかで、酢酸−塩酸の混合液中にて菌体抽出物
を加水分解するのが好ましい。

酢酸−塩酸での処理条件としては、酢酸濃度０゜０１〜
ＩＯＭ、塩酸濃度１〜１００ｍＭ、温度は５０〜１５０
℃が好ましい。

上記のようにして得られた菌体抽出液の加水分解物は、
粗物質のままでもよいし、また精製して純粋にしてもよ
い。

精製の方法としては、イオン交換樹脂、疎水性樹脂又は
多孔性樹脂などを用いたカラムクロマトグラフィー法、
向流分配法、電気泳動法などがあげられる。

上記したような方法により１本発明の有効成分である３
種類のペプチドが得られるが、特に望ましくは、以下の
ようにしてすればよい。

スナわチ、バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡｌ
　５０３　（ＡＴＣＣ２９６０９）、ＵＫ７８８（微工
研条寄第２３７３号）、ＵＫ５６３（微工研菌寄第７２
７５号）、ＡＴＣＣ７９５３，ＡＴＣＣ８００５，ある
いはＡＴＣＣ１０１４９などの菌株を連続培養し、得ら
れた菌体を自己消化して抽出液を得る。ついでこれを、
１Ｍ酢酸−２０ｍＭ塩酸混塩酸中で、１２０℃、１時間
の条件で酸加水分解し、これを単離・精製すればよい。

菌体抽出液から本発明のペプチドを単離・精製するには
、菌体抽出液を酸加水分解した後１種々のカラムクロマ
トグラフィーに付し、実施することができる。例えば、
アンバーライト■Ｉ　ＲＣ−５０（ローム・アンド・ハ
ース社１ｉ１）　、　タウエックス■ＭＷＣ−１（ダウ
ケミカル社製）等のイオン交換樹脂を充填したカラムク
ロマトグラフィーセファデックス■Ｇ−２５（ファルマ
シア社製）。

アサヒバツク■Ｇ５−３２０（旭化成社製）等を充填し
たゲルカラムクロマトグラフィー　アサヒバツク■０Ｄ
Ｐ−５０（旭化成社製）、マイクロボンダパック■（ウ
ォーターズ社製）等を充填カラムとする高速液体クロマ
トグラフィー等により実施できる。

その他、向流分配法や電気泳動法等、ペプチド化合物精
製の常套手段を適用して精製することができる。

次に、液相法、固相法の常套のペプチド合成法により製
造する方法を説明する。

すなわち、一方のアミノ酸のアミノ基をベンジルオキシ
カルボニル基又はｔ−ブトキシカルボニル基などで保護
し、他方のアミノ酸又はペプチドのカルボニル基をベン
ジルエステルなどで保護し。

ＤＤＣ（Ｎ、Ｎ’　−ジシクロへキシルカルボジイミド
）などでカップリングさせる。この操作を繰り返し、保
護基を離脱させる。というような周知の方法を用いて製
造することができる。

本発明のペプチドは、薬学的に許容される製剤用担体、
賦形剤、結合剤、その他の添加剤とともに、常法に従っ
て９錠剤、カプセル剤、＠粒剤等の形態で経口投与され
るか、あるいは液剤、用時溶解型の凍結乾燥粉末剤等の
注射剤等に調製され。

静脈注射の形で投与される。

その投与量としては２通常、動物体重１ｋｇ当たり静注
で０．００１〜１０ｍｇで、これを１日１〜４回投与す
る。

本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害剤は。

生体内に該酵素を内生ずる哺乳類など１例えばヒト、ラ
ット、犬などに適用できる。

（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

参考例１ （アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定法）実施例
中の分離・精製過程での阻害活性画分の追跡及び得られ
た最終精製物質であるペプチドの阻害活性は、　Ｃｕｓ
ｈｍａｎｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ、、２０．　１６３７〜１６４８　　（１９７１
）　）に従い、以下に示す操作にて測定した。

（ｉ）アンジオテンシン変換酵素の調製先ず、うさぎ肺
アセトン粉末（シグマ社製）を５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８，３）に４℃で溶解し、３７０００Ｘｇ
で３０分間遠心分離した。上澄み液を上記緩衝液にて透
析し、低分子物質を除いたアンジオテンシン変換酵素を
得た。

（ｉｉ）アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定０、
３　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８，３）に最終濃度が２．５ｍＭになるようにヒ
ブリルーし一ヒスチジルーＬロイシン（ペプチド研究所
）を加えて酵素基質液を調製した。これにアンジオテン
シン変換酵素、水及び検体を加えて最終容量を０゜２５
−とじ、３７℃で３０分間反応させた。

次に、　　ＩＮ　ＨＣｌ　０．２５ｍ１’を加えて反応
を停止させ、酢酸エチル１．５−を加え、遊離した馬尿
酸を抽出した。酢酸エチル層の１−を採取し、溶媒を蒸
発させて乾固した。溶媒除去後、得られた残渣に蒸留水
１ｍＩ！を加えて２２８ｎｍの吸光度を測定し、馬尿酸
の量を求め、これを酵素活性とした。

検体を含む場合の吸光度（Ａ）と検体を含まない場合の
吸光′度（Ｂ）から阻害率を次式により算出し、阻害率
５０％を示すときの検体の濃度をＩＣｓ。とじた。

実ｍ例１　　（バチルス・ステアロサーモフィルス菌か
らペプチドの分離・精製） ０．３５％（％は重量％を表す。以下同様）のブドウ糖
、０．３０％の酵母エキス、０．１０％のペプトン、０
．２０％のリン酸−カリウム、０．２０％のリン酸二ナ
トリウム、ｏ、ｉｏ％の硫酸マグネシウム、　　０．０
０５％の硫酸第一鉄、　０．０００１％の硫酸マンガン
、　０．０００１％のモリブデン酸ナトリウムを含む培
地４００１にバチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡ
−１５０３株（ＡＴＣＣ２９６０９）を接種し、６０℃
でｐＨ７にて培養した後、遠心分離して菌体を得、得ら
れた菌体を凍結して保存した。

このようにして得られた凍結菌体をＩＭのブドウ糖、４
ｍＭのＥＤＴＡを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，６）に懸濁させて、４０℃で３時間放置させ
た後、遠心分離により抽出液を得た。

抽出液１１に酢酸６０−２濃塩酸２−を加え。

オートクレーブ中１２０℃にて１時間加熱した。

遠心分離後、上澄みにＯＤＳ樹脂（ワットマン社製、５
５〜１０５μｍ）１０ｇを加え、１時１ｓｌ［拌した。

濾過後、樹脂を４％酢酸１１で洗浄後。

１５％アセトニトリル水溶液で溶出した。溶出液ヲ乾固
し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム−アセトニトリル混液（
８０：２０ｖ／ｖ）の高速液体クロマトグラフィーの展
開溶媒に溶解し、アサヒバツク■Ｇ５−３２０のカラム
（旭化成社製、０゜７６Ｘ８０ｃｍ）に付し、流速１ｍ
１ｉ！／ｍｉｎで展開した。

阻害活性は溶出容積が１３〜１４ｍ１（フラクションＩ
と呼ぶ）、１５〜１６−（フラクション■と呼ぶ）及び
２３〜２６ｄ（フラクション■と呼ぶ）の画分に認約ら
れた。

これらそれぞれの阻害活性物質を含む溶出液フラクショ
ンエ〜■を濃縮した後、フラクションＩ及び■を５％か
ら３０％アセトニトリルを含む０゜０５％塩酸水溶液の
直線グラジェント溶出によるデベロジル０ＤＳ−７カラ
ム（野村化学社製、０゜４６Ｘ２５ｃｍ）を用いた高速
液体クロマトグラフィーにて精製した。流速は２＋ｎｌ
／ｍｉｎであり、フラクションエは１８〜２０−の溶出
画分に、フラクション■は２２〜２４−の溶出画分に阻
害活性が観察された。

一方、フラクション■はアセトニトリルのグラジェント
溶出を１０％から５０％に変えた以外はフラクションＩ
及び■の場合と全く同様にして精製したところ、２１〜
２３ｒｎ１．の溶出画分に阻害活性が観察された。

得られた３種類の阻害活性物質を気相プロテインシーク
ネーター（アプライドバイオシステムズ社製、モデル４
７０Ａ型）を用いて分析した結果。

フラクションエ、■及び■から精製された阻害活性物質
は、それぞれ （ａ）　Ｇ　１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ−Ｉ
ｌｅｕ−Ｌ−Ｉ　１ｅｕ−Ｌ−Ｖａ　１−Ｌ−Ｌ　ｙｓ
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｒｇ。

（ｂ）　Ｇ　ｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｍｅ　ｔ−Ｌ−Ｖ
ａ　１−Ｌ−Ｌｙ　５−Ｌ−Ｖａ　］　−Ｌ−Ｖ　ａ　
Ｉ　−ＬＳｅｒ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｙｒ＋及び（Ｃ）
　Ｌ−Ａ　１ａ−Ｌ−Ｔ　ｙ　ｒ−Ｌ−Ｉ　１ｅｕ−Ｌ
−Ａ　１ａ−Ｌ−３ｅ　ｒ−Ｌ−Ｌｙ　ｓ−Ｇ　１　ｙ
−Ｌｅｕ であることが確認された。

上記したペプチド（ａ）（ｂ）（Ｃ）のＩＣ５ｏを測定
したところ、それぞれ、７５．１ｇｇ／−、８．０μｇ
／ｍｆ及び２８．８μｇ　／　ｍＲであった。

（発明の効果） 本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害剤は。

優れたアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し。

高血圧の治療あるいは予防の為の医薬として有用性が期
待できる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下式で示されるデカペプチド Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅｕ−Ｉｌｅｕ−Ｖａｌ
   −Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
2. （２）下式で示されるデカペプチド Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖ
   ａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒを有効成分とするアンジ
   オテンシン変換酵素阻害剤。
3. （３）下式で示されるオクタペプチド Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−
   Ｇｌｙ−Ｌｅｕを有効成分とするアンジオテンシン変換
   酵素阻害剤。