JP2000078971A - Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物 - Google Patents
Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 医薬分野で広く利用されている抗生物質およ
びホルモン類に使用され得るオリゴペプチドを合成する
酵素、その酵素を生産する微生物、およびその酵素また
は微生物を用いるオリゴペプチド合成方法を提供するこ
と。 【解決手段】 Ｄ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ
酸エステルのいずれをも基質としてオリゴペプチド合成
反応を触媒する新規酵素およびこの酵素を生産する微生
物、およびこの酵素または微生物を用いるオリゴペプチ
ド合成方法。微生物は、好ましくはバチルス ミコイデ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）である。
びホルモン類に使用され得るオリゴペプチドを合成する
酵素、その酵素を生産する微生物、およびその酵素また
は微生物を用いるオリゴペプチド合成方法を提供するこ
と。 【解決手段】 Ｄ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ
酸エステルのいずれをも基質としてオリゴペプチド合成
反応を触媒する新規酵素およびこの酵素を生産する微生
物、およびこの酵素または微生物を用いるオリゴペプチ
ド合成方法。微生物は、好ましくはバチルス ミコイデ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−アミノ酸エス
テルもしくはＬ−アミノ酸エステルを基質としてオリゴ
ペプチド合成反応を触媒する新規酵素およびこの酵素を
生産する微生物、およびこの酵素または微生物を用いる
オリゴペプチド合成方法に関する。
テルもしくはＬ−アミノ酸エステルを基質としてオリゴ
ペプチド合成反応を触媒する新規酵素およびこの酵素を
生産する微生物、およびこの酵素または微生物を用いる
オリゴペプチド合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで、Ｄ−アミノ酸エステルおよび
Ｌ−アミノ酸エステルのいずれをも基質としてオリゴペ
プチド合成反応を触媒し、かつペプチド加水分解活性を
示さない酵素、およびこのような酵素を生産し得る微生
物は知られていなかった。本発明者らは、Ｄ−アミノ酸
のみに作用してオリゴペプチド合成反応を触媒する酵素
を見出し、特開平９−１７３０６２号公報に詳細を開示
した。
Ｌ−アミノ酸エステルのいずれをも基質としてオリゴペ
プチド合成反応を触媒し、かつペプチド加水分解活性を
示さない酵素、およびこのような酵素を生産し得る微生
物は知られていなかった。本発明者らは、Ｄ−アミノ酸
のみに作用してオリゴペプチド合成反応を触媒する酵素
を見出し、特開平９−１７３０６２号公報に詳細を開示
した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、医薬分野で
広く利用されている抗生物質およびホルモン類に使用さ
れ得るオリゴペプチドの合成に有用なものであり、その
目的とするところは、オリゴペプチドを合成する酵素、
その酵素を生産する微生物、およびその酵素または微生
物を用いるオリゴペプチド合成方法を提供することであ
る。
広く利用されている抗生物質およびホルモン類に使用さ
れ得るオリゴペプチドの合成に有用なものであり、その
目的とするところは、オリゴペプチドを合成する酵素、
その酵素を生産する微生物、およびその酵素または微生
物を用いるオリゴペプチド合成方法を提供することであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、新たに単離し
たバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌からＤ
−、またはＬ−アミノ酸エステルからオリゴペプチドを
合成する新規酵素を単離し、これに基づいて、本発明を
完成するに至った。
を解決するために鋭意検討を行った結果、新たに単離し
たバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌からＤ
−、またはＬ−アミノ酸エステルからオリゴペプチドを
合成する新規酵素を単離し、これに基づいて、本発明を
完成するに至った。
【０００５】本発明は、アミノ酸エステルとアミン成分
とを基質とするオリゴペプチド合成反応を触媒する酵素
であって、該アミノ酸エステルとして、Ｄ−アミノ酸エ
ステルおよびＬ−アミノ酸エステルのいずれをも利用し
得る酵素を提供する。
とを基質とするオリゴペプチド合成反応を触媒する酵素
であって、該アミノ酸エステルとして、Ｄ−アミノ酸エ
ステルおよびＬ−アミノ酸エステルのいずれをも利用し
得る酵素を提供する。
【０００６】本明細書において「アミノ酸エステル」と
は、アミノ酸のアルキルエステルをいう。アルキルエス
テルは、好ましくは炭素数が４個以下の低級アルキルエ
ステルであり、より好ましくはメチルエステルまたはエ
チルエステルであり、もっとも好ましくはメチルエステ
ルである。他に特定されない限り「アミノ酸エステル」
には、当該アミノ酸エステルをＣ末端に有するオリゴペ
プチドも含まれる。
は、アミノ酸のアルキルエステルをいう。アルキルエス
テルは、好ましくは炭素数が４個以下の低級アルキルエ
ステルであり、より好ましくはメチルエステルまたはエ
チルエステルであり、もっとも好ましくはメチルエステ
ルである。他に特定されない限り「アミノ酸エステル」
には、当該アミノ酸エステルをＣ末端に有するオリゴペ
プチドも含まれる。
【０００７】なお、本発明の酵素が作用する基質は、必
ずしもアミノ酸エステルのみに限定されることはなく、
任意の適切なカルボキシル基誘導体を有するアミノ酸も
また基質となり得る。
ずしもアミノ酸エステルのみに限定されることはなく、
任意の適切なカルボキシル基誘導体を有するアミノ酸も
また基質となり得る。
【０００８】本明細書において「オリゴペプチド」と
は、天然型Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸、
および／または非天然型アミノ酸が、任意の順序でアミ
ド結合により縮合したものをいう。非天然型アミノ酸
は、フェニルグリシン、ｐ−ヒドロキシフェニルグリシ
ンなどの公知化合物を含むが、これらには限定されず、
例えば、アミノ酸から誘導されるアミノ基およびカルボ
キシル基を有する任意の化合物を含み得る。「オリゴペ
プチド」の重合度（アミノ酸残基の数）は、代表的には
２〜１０、好ましくは２〜７、より好ましくは２〜４で
あるが、これらに限定はされない。
は、天然型Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸、
および／または非天然型アミノ酸が、任意の順序でアミ
ド結合により縮合したものをいう。非天然型アミノ酸
は、フェニルグリシン、ｐ−ヒドロキシフェニルグリシ
ンなどの公知化合物を含むが、これらには限定されず、
例えば、アミノ酸から誘導されるアミノ基およびカルボ
キシル基を有する任意の化合物を含み得る。「オリゴペ
プチド」の重合度（アミノ酸残基の数）は、代表的には
２〜１０、好ましくは２〜７、より好ましくは２〜４で
あるが、これらに限定はされない。
【０００９】本明細書において「アミン成分」とは、ア
ミノ基を有する任意の化合物を指し、代表的にはＤ−ア
ミノ酸またはＬ−アミノ酸である。他に特定されない限
り、アミン成分としての「アミノ酸」には、当該アミノ
酸をＮ末端に有するオリゴペプチドも含まれる。
ミノ基を有する任意の化合物を指し、代表的にはＤ−ア
ミノ酸またはＬ−アミノ酸である。他に特定されない限
り、アミン成分としての「アミノ酸」には、当該アミノ
酸をＮ末端に有するオリゴペプチドも含まれる。
【００１０】本発明の酵素（以下「本酵素」ともいう）
は次の特性により特定され得る。 （１）Ｄ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸エステ
ルのいずれに対しても作用して、オリゴペプチド合成反
応を触媒する。 （２）オリゴペプチド合成反応の基質であるアミン成分
は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸のいずれであって
もよい。 （３）プロテアーゼ活性、ペプチダーゼ活性、およびエ
ステラーゼ活性のいずれをも有しない。 （４）反応液のｐＨが４〜９の範囲で活性を有し、特に
ｐＨが６〜７の範囲で活性が高く、至適ｐＨは６．５±
０．５である。 （５）０〜６０℃の反応温度で活性を示し、特に反応温
度が３０〜４０℃の範囲で活性が高く、至適温度は３５
±５℃である。 （６）ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が２９
±３ｋＤａである。
は次の特性により特定され得る。 （１）Ｄ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸エステ
ルのいずれに対しても作用して、オリゴペプチド合成反
応を触媒する。 （２）オリゴペプチド合成反応の基質であるアミン成分
は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸のいずれであって
もよい。 （３）プロテアーゼ活性、ペプチダーゼ活性、およびエ
ステラーゼ活性のいずれをも有しない。 （４）反応液のｐＨが４〜９の範囲で活性を有し、特に
ｐＨが６〜７の範囲で活性が高く、至適ｐＨは６．５±
０．５である。 （５）０〜６０℃の反応温度で活性を示し、特に反応温
度が３０〜４０℃の範囲で活性が高く、至適温度は３５
±５℃である。 （６）ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が２９
±３ｋＤａである。
【００１１】本酵素は、少なくとも上記（１）の特性を
有し、好ましくは上記（１）および（２）の特性を有す
る。本酵素は、上記（１）に加えて、上記（２）から
（６）までの特性の少なくとも１つを有し得、またはこ
れらの２つ以上を組み合せて有し得る。最も好ましく
は、本酵素は上記（１）から（６）までの特性の全てを
有する。
有し、好ましくは上記（１）および（２）の特性を有す
る。本酵素は、上記（１）に加えて、上記（２）から
（６）までの特性の少なくとも１つを有し得、またはこ
れらの２つ以上を組み合せて有し得る。最も好ましく
は、本酵素は上記（１）から（６）までの特性の全てを
有する。
【００１２】なお、本明細書において、プロテアーゼ活
性を有しないとは、３０℃に保温した０．６％ミルクカ
ゼイン溶液（ｐＨ７．２）に、当該酵素を加えて、１０
分間インキュベートしたとき、プロテアーゼ反応の進行
が検出し得ないことをいう。ペプチダーゼ活性を有しな
いとは、０．０２ＭのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−フェ
ニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−Ｐｈｅ
−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ、およびＬ−Ｐ
ｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅをそれぞれ含む、ｐＨ６．５の０．１
Ｍリン酸緩衝液に、当該酵素を加えて、３０℃で、５時
間放置したとき、４種類のいずれのペプチドについて
も、検出し得る遊離のフェニルアラニンを生成しないこ
とをいう。エステラーゼ活性を有しないとは、０．５ｍ
ｌのプロピオン酸メチルまたは酪酸メチル、２ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）および当該酵素を
含む混合溶液を２５℃で３０分間インキュベートしたと
き、検出し得る遊離した酸を生成しないことをいう。
性を有しないとは、３０℃に保温した０．６％ミルクカ
ゼイン溶液（ｐＨ７．２）に、当該酵素を加えて、１０
分間インキュベートしたとき、プロテアーゼ反応の進行
が検出し得ないことをいう。ペプチダーゼ活性を有しな
いとは、０．０２ＭのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−フェ
ニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−Ｐｈｅ
−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ、およびＬ−Ｐ
ｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅをそれぞれ含む、ｐＨ６．５の０．１
Ｍリン酸緩衝液に、当該酵素を加えて、３０℃で、５時
間放置したとき、４種類のいずれのペプチドについて
も、検出し得る遊離のフェニルアラニンを生成しないこ
とをいう。エステラーゼ活性を有しないとは、０．５ｍ
ｌのプロピオン酸メチルまたは酪酸メチル、２ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）および当該酵素を
含む混合溶液を２５℃で３０分間インキュベートしたと
き、検出し得る遊離した酸を生成しないことをいう。
【００１３】本酵素はまた、その極めて広い基質特異性
によって特徴付けられ得る。すなわち、オリゴペプチド
合成反応におけるアミノ酸エステルおよびアミン成分と
して、それぞれ、親水性アミノ酸（酸性アミノ酸および
塩基性アミノ酸を含む）および疎水性アミノ酸のいずれ
をも利用し得る。
によって特徴付けられ得る。すなわち、オリゴペプチド
合成反応におけるアミノ酸エステルおよびアミン成分と
して、それぞれ、親水性アミノ酸（酸性アミノ酸および
塩基性アミノ酸を含む）および疎水性アミノ酸のいずれ
をも利用し得る。
【００１４】当業者には明らかなように、本酵素をプロ
テアーゼなどで処理して、本酵素の活性を維持したより
低分子量の活性フラグメントを得ることも可能である。
そのような活性フラグメントおよびその利用もまた、本
発明の範囲に含まれ得る。同様に、公知のタンパク質修
飾技術によって本酵素に適当な修飾を施して、酵素の機
能、理化学的性質などをさらに改善することも可能であ
る。そのような修飾タンパク質およびその利用もまた、
本発明の範囲に含まれ得る。
テアーゼなどで処理して、本酵素の活性を維持したより
低分子量の活性フラグメントを得ることも可能である。
そのような活性フラグメントおよびその利用もまた、本
発明の範囲に含まれ得る。同様に、公知のタンパク質修
飾技術によって本酵素に適当な修飾を施して、酵素の機
能、理化学的性質などをさらに改善することも可能であ
る。そのような修飾タンパク質およびその利用もまた、
本発明の範囲に含まれ得る。
【００１５】本発明はまた、本酵素を生産する微生物を
提供する。本発明の微生物は、好ましくは、平成１０年
８月２８日に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命
研と略称する）に寄託したバチルス ミコイデス ＡＳ
−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−
１）（生命研菌寄第１６９６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１６
９６９）である。
提供する。本発明の微生物は、好ましくは、平成１０年
８月２８日に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命
研と略称する）に寄託したバチルス ミコイデス ＡＳ
−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−
１）（生命研菌寄第１６９６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１６
９６９）である。
【００１６】本発明の微生物には、上記バチルス ミコ
イデス株と分類学上近縁の微生物（代表的には同一の
属、好ましくは同一または近縁の種）であって、本酵素
を生産し得る微生物も含まれ得る。そのような微生物
は、例えば、上記（１）の特性を基準としたスクリーニ
ングによって得ることができる。
イデス株と分類学上近縁の微生物（代表的には同一の
属、好ましくは同一または近縁の種）であって、本酵素
を生産し得る微生物も含まれ得る。そのような微生物
は、例えば、上記（１）の特性を基準としたスクリーニ
ングによって得ることができる。
【００１７】上記特性を有するＤ−あるいはＬ−アミノ
酸オリゴペプチド合成酵素およびこれを生産する微生物
はこれまで知られていない。
酸オリゴペプチド合成酵素およびこれを生産する微生物
はこれまで知られていない。
【００１８】本発明はまた、本酵素または本酵素を生産
する微生物をオリゴペプチド合成反応に使用する工程を
含むオリゴペプチドの合成方法を提供する。
する微生物をオリゴペプチド合成反応に使用する工程を
含むオリゴペプチドの合成方法を提供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】本発明の酵素は、生産菌は限定されるもの
ではないが例えば、バチルス ミコイデス ＡＳ−１
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−１）
（生命研菌寄第１６９６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１６９６
９）により生産される。この微生物は本発明者らが、土
壌から、アミノ酸エステルを基質としてオリゴペプチド
合成反応を触媒する酵素の生産菌をスクリーニングした
結果、分離された微生物である。以下、この微生物の性
状について述べる。
ではないが例えば、バチルス ミコイデス ＡＳ−１
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−１）
（生命研菌寄第１６９６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１６９６
９）により生産される。この微生物は本発明者らが、土
壌から、アミノ酸エステルを基質としてオリゴペプチド
合成反応を触媒する酵素の生産菌をスクリーニングした
結果、分離された微生物である。以下、この微生物の性
状について述べる。
【００２１】（１）形態および培養 本微生物は、脂肪酸定量その他の同定試験の結果から、
乾燥その他のストレスに抵抗性のある内生胞子を形成す
る枯草菌バチルス ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｙｃｏｉｄｅｓ）に属することが示された。
乾燥その他のストレスに抵抗性のある内生胞子を形成す
る枯草菌バチルス ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｙｃｏｉｄｅｓ）に属することが示された。
【００２２】次に、本微生物から本発明の酵素を生産す
るための条件について説明する。本微生物は液体培養に
より当該酵素を生産し得る。本細菌を生育させる培地と
しては特に限定されず、通常の液体培地が用いられる。
炭素源としてはグルコースが用いられ得る。窒素源とし
てはペプトン、肉エキスを使用し得る。これらの培地成
分は本細菌の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素
源は通常０.５％〜５重量％、好ましくは１〜３重量
％、窒素源は通常１〜５％、好ましくは１〜２重量％で
ある。培地は、通常ｐＨを６〜８に調整し、滅菌して使
用する。培養温度は本細菌が生育し得る温度であればよ
く、通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃であ
る。本細菌を液体培養する場合は、通気培養または振と
う培養が好ましい。培養時間は、種々の培養条件によっ
て異なるが、通気培養または振とう培養の場合は通常３
〜５日間が好ましい。
るための条件について説明する。本微生物は液体培養に
より当該酵素を生産し得る。本細菌を生育させる培地と
しては特に限定されず、通常の液体培地が用いられる。
炭素源としてはグルコースが用いられ得る。窒素源とし
てはペプトン、肉エキスを使用し得る。これらの培地成
分は本細菌の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素
源は通常０.５％〜５重量％、好ましくは１〜３重量
％、窒素源は通常１〜５％、好ましくは１〜２重量％で
ある。培地は、通常ｐＨを６〜８に調整し、滅菌して使
用する。培養温度は本細菌が生育し得る温度であればよ
く、通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃であ
る。本細菌を液体培養する場合は、通気培養または振と
う培養が好ましい。培養時間は、種々の培養条件によっ
て異なるが、通気培養または振とう培養の場合は通常３
〜５日間が好ましい。
【００２３】（２）培養液からの本酵素の分離精製 本細菌の培養液から本発明の酵素を分離精製するには、
既知の精製法、例えば脱塩、透析、塩析、各種クロマト
グラフィー、電気泳動が単独もしくは併用して利用され
得る。
既知の精製法、例えば脱塩、透析、塩析、各種クロマト
グラフィー、電気泳動が単独もしくは併用して利用され
得る。
【００２４】培養後、菌体などの不溶物を遠心分離、ま
たは濾紙または濾布などによる濾過などにより除去し、
本酵素を含む粗酵素液を回収する。硫安による分画（塩
析）、透析、各種クロマトグラフィーなどの一般に用い
られる酵素の精製法により、得られた粗酵素液から本酵
素が精製され得る。例えば、上記粗酵素液を塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグ
ラフィーに順次供することにより、精製された高活性の
本酵素を含む画分が得られる。
たは濾紙または濾布などによる濾過などにより除去し、
本酵素を含む粗酵素液を回収する。硫安による分画（塩
析）、透析、各種クロマトグラフィーなどの一般に用い
られる酵素の精製法により、得られた粗酵素液から本酵
素が精製され得る。例えば、上記粗酵素液を塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグ
ラフィーに順次供することにより、精製された高活性の
本酵素を含む画分が得られる。
【００２５】（３）本酵素の活性の測定 本発明の酵素の活性は、例えば、０．４ＭのＤ−フェニ
ルアラニンメチルエステル（Ｄ−ＰｈｅＯＭｅ）を基質
として用い、５０ｍＭリン酸緩衝液中、３０℃で５時間
反応させることにより測定し得る。反応生成物は、反応
液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によ
って分析することにより確認し得る。
ルアラニンメチルエステル（Ｄ−ＰｈｅＯＭｅ）を基質
として用い、５０ｍＭリン酸緩衝液中、３０℃で５時間
反応させることにより測定し得る。反応生成物は、反応
液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によ
って分析することにより確認し得る。
【００２６】本酵素の活性は、Ｄ−ＰｈｅＯＭｅを基質
として用い、１時間に１μｍｏｌのＤ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐ
ｈｅＯＭｅを生成する酵素量を、１単位（Ｕ；ユニッ
ト）と定義した。
として用い、１時間に１μｍｏｌのＤ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐ
ｈｅＯＭｅを生成する酵素量を、１単位（Ｕ；ユニッ
ト）と定義した。
【００２７】（４）酵素反応物の同定 酵素反応（オリゴペプチド合成反応）による生成物は、
例えば、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）での分取後、アミノ酸分析および／また
は質量分析に付すことにより同定し得る。従って、当業
者は、所望のオリゴペプチド生成物を得るための適切な
反応条件（基質の比率および濃度、反応時間など）を容
易に設定し得る。
例えば、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）での分取後、アミノ酸分析および／また
は質量分析に付すことにより同定し得る。従って、当業
者は、所望のオリゴペプチド生成物を得るための適切な
反応条件（基質の比率および濃度、反応時間など）を容
易に設定し得る。
【００２８】以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
【００２９】
【実施例】実施例において、培地成分、アミノ酸、およ
びその他の試薬は、いずれも市販品を使用した。ＴＬＣ
では、反応液約１μｌをシリカゲル薄層プレート（メル
ク社製）にスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水
（４：１：１）混合液で展開し、ニンヒドリン試薬を噴
霧した後、約１２０℃で、５分間加熱して発色させた。
逆相ＨＰＬＣには島津製ＬＣ−９Ａを、アミノ酸分析に
は島津製ＡＬＣ−１０００を、そして質量分析には日本
電子ＪＭＳ−ＤＸ３０３Ｈ（ＦＡＢ−ＭＳ分析）を、そ
れぞれ使用した。
びその他の試薬は、いずれも市販品を使用した。ＴＬＣ
では、反応液約１μｌをシリカゲル薄層プレート（メル
ク社製）にスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水
（４：１：１）混合液で展開し、ニンヒドリン試薬を噴
霧した後、約１２０℃で、５分間加熱して発色させた。
逆相ＨＰＬＣには島津製ＬＣ−９Ａを、アミノ酸分析に
は島津製ＡＬＣ−１０００を、そして質量分析には日本
電子ＪＭＳ−ＤＸ３０３Ｈ（ＦＡＢ−ＭＳ分析）を、そ
れぞれ使用した。
【００３０】（実施例１）バチルス ミコイデスの培養 １００ｍｌのブイヨン培地（２％ポリペプトン、１％肉
エキス、０.３％食塩、ｐＨ７．０）を含む５００ｍｌ
の振とうフラスコに、本細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙ
ｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−１（生命研菌寄第１６９６９号；
ＦＥＲＭ Ｐ−１６９６９））を接種し、２８℃で、４
日間振とう培養した。
エキス、０.３％食塩、ｐＨ７．０）を含む５００ｍｌ
の振とうフラスコに、本細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙ
ｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−１（生命研菌寄第１６９６９号；
ＦＥＲＭ Ｐ−１６９６９））を接種し、２８℃で、４
日間振とう培養した。
【００３１】（実施例２）本酵素の精製 実施例１で得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒ
ｐｍ、１０分間）して得られた上清を粗酵素液とした。
この粗酵素液に８０％飽和となるように硫安（硫酸アン
モニウム）を添加し、生じた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６.０）に溶解し、同緩衝液に対して透析し
た。この透析液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０Ｍカラム（東ソー社製）にアプライし、同
緩衝液で洗浄後、０Ｍから１Ｍまでの食塩（ＮａＣｌ）
の濃度勾配をかけて、カラムに吸着された本酵素を溶出
した。活性画分を集めて限外濾過膜を用いて濃縮した。
この濃縮物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００（ファ
ルマシア社製）カラムを用いて、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）を含む０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液を溶離
液として、ゲル濾過に付した。活性画分を集めて限外濾
過膜を用いて濃縮後、終濃度が２０％飽和となるよう硫
安を添加した。この酵素液を２０％飽和の硫安で平衡化
したブチルトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）に
アプライし、２０％飽和から０％飽和までの硫安濃度勾
配をかけて、カラムに吸着された本酵素を溶出し、精製
された酵素を得た。上記の精製工程全体を通じての、活
性酵素の回収率は８％、精製度は約２００倍であった。
ｐｍ、１０分間）して得られた上清を粗酵素液とした。
この粗酵素液に８０％飽和となるように硫安（硫酸アン
モニウム）を添加し、生じた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６.０）に溶解し、同緩衝液に対して透析し
た。この透析液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０Ｍカラム（東ソー社製）にアプライし、同
緩衝液で洗浄後、０Ｍから１Ｍまでの食塩（ＮａＣｌ）
の濃度勾配をかけて、カラムに吸着された本酵素を溶出
した。活性画分を集めて限外濾過膜を用いて濃縮した。
この濃縮物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００（ファ
ルマシア社製）カラムを用いて、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）を含む０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液を溶離
液として、ゲル濾過に付した。活性画分を集めて限外濾
過膜を用いて濃縮後、終濃度が２０％飽和となるよう硫
安を添加した。この酵素液を２０％飽和の硫安で平衡化
したブチルトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）に
アプライし、２０％飽和から０％飽和までの硫安濃度勾
配をかけて、カラムに吸着された本酵素を溶出し、精製
された酵素を得た。上記の精製工程全体を通じての、活
性酵素の回収率は８％、精製度は約２００倍であった。
【００３２】（実施例３）本酵素の分子量測定 実施例２で得られた精製酵素の分子量は、Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０カラム（１×３０ｃｍ）
（ファルマシア社製）を用いるゲル濾過により測定し
た。分子量既知の標準蛋白質としてファルマシア社製ア
ルドラーゼ（１５０ｋＤ）、牛血清アルブミン（６８ｋ
Ｄ）、オボアルブミン（４５ｋＤ）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（３２ｋＤ）およびリゾチーム（１４．５ｋ
Ｄ）を用いて検量線を作成した。その結果、本酵素の分
子量は２９±３ｋＤａであった。
ｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０カラム（１×３０ｃｍ）
（ファルマシア社製）を用いるゲル濾過により測定し
た。分子量既知の標準蛋白質としてファルマシア社製ア
ルドラーゼ（１５０ｋＤ）、牛血清アルブミン（６８ｋ
Ｄ）、オボアルブミン（４５ｋＤ）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（３２ｋＤ）およびリゾチーム（１４．５ｋ
Ｄ）を用いて検量線を作成した。その結果、本酵素の分
子量は２９±３ｋＤａであった。
【００３３】（実施例４）本酵素の酵素活性のｐＨ依存
性 酵素活性のｐＨ依存性は、ブリットン−ロビンソン（Ｂ
ｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用い
て３０℃で測定した。基質として０．０２Ｍのアセチル
−Ｄ−フェニルアラニンメチルエステルと０．２ＭのＬ
−ロイシンアミドとを用い、ジペプチドであるアセチル
−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンアミドの生成量
を逆相ＨＰＬＣで測定した。その結果、少なくともｐＨ
４〜９の範囲では活性が認められ、最適ｐＨは６．５±
０．５であった。本酵素のｐＨ特性を図１に示す。
性 酵素活性のｐＨ依存性は、ブリットン−ロビンソン（Ｂ
ｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用い
て３０℃で測定した。基質として０．０２Ｍのアセチル
−Ｄ−フェニルアラニンメチルエステルと０．２ＭのＬ
−ロイシンアミドとを用い、ジペプチドであるアセチル
−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンアミドの生成量
を逆相ＨＰＬＣで測定した。その結果、少なくともｐＨ
４〜９の範囲では活性が認められ、最適ｐＨは６．５±
０．５であった。本酵素のｐＨ特性を図１に示す。
【００３４】（実施例５）本酵素の酵素活性の温度依存
性 酵素活性の温度依存性は、０．２ＭのＤ−フェニルアラ
ニンメチルエステルを基質としてｐＨ６．５の５０ｍＭ
リン酸緩衝液中、０〜６０℃の温度範囲で５時間作用さ
せて測定した。その結果、この温度範囲全体にわたって
活性が認められ、最適温度は３５±５℃であった。本酵
素の温度特性を図２に示す。
性 酵素活性の温度依存性は、０．２ＭのＤ−フェニルアラ
ニンメチルエステルを基質としてｐＨ６．５の５０ｍＭ
リン酸緩衝液中、０〜６０℃の温度範囲で５時間作用さ
せて測定した。その結果、この温度範囲全体にわたって
活性が認められ、最適温度は３５±５℃であった。本酵
素の温度特性を図２に示す。
【００３５】（実施例６）本酵素のプロテアーゼ活性 ３０℃に保温した０．６％ミルクカゼイン溶液（ｐＨ
７．２）２ｍｌに、本酵素の酵素液０．４ｍｌ（３０
Ｕ）を加えて、１０分間インキュベートした後、トリク
ロロ酢酸溶液２ｍｌを加えて、１０分間放置した。混合
物を濾紙で濾過した後、濾液の２７５ｎｍでの吸光度を
測定することにより、プロテアーゼ反応の有無を調べ
た。その結果、本酵素には検出し得るプロテアーゼ活性
のないことが示された。
７．２）２ｍｌに、本酵素の酵素液０．４ｍｌ（３０
Ｕ）を加えて、１０分間インキュベートした後、トリク
ロロ酢酸溶液２ｍｌを加えて、１０分間放置した。混合
物を濾紙で濾過した後、濾液の２７５ｎｍでの吸光度を
測定することにより、プロテアーゼ反応の有無を調べ
た。その結果、本酵素には検出し得るプロテアーゼ活性
のないことが示された。
【００３６】（実施例７）本酵素のペプチダーゼ活性 ０．０２ＭのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラ
ニン（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐ
ｈｅ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ、およびＬ−Ｐｈｅ−Ｌ
−Ｐｈｅをそれぞれ含む、ｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸
緩衝液に、本酵素の酵素液０．１ｍｌを加えた後、３０
℃で、５時間放置した。アミノ酸分析計でフェニルアラ
ニンの生成量を調べた。その結果、本酵素は、上記４種
類のいずれのペプチドについても遊離のフェニルアラニ
ンを生成せず、検出し得るペプチダーゼ活性のないこと
が示された。
ニン（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐ
ｈｅ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ、およびＬ−Ｐｈｅ−Ｌ
−Ｐｈｅをそれぞれ含む、ｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸
緩衝液に、本酵素の酵素液０．１ｍｌを加えた後、３０
℃で、５時間放置した。アミノ酸分析計でフェニルアラ
ニンの生成量を調べた。その結果、本酵素は、上記４種
類のいずれのペプチドについても遊離のフェニルアラニ
ンを生成せず、検出し得るペプチダーゼ活性のないこと
が示された。
【００３７】（実施例８）本酵素のエステラーゼ活性 ０．５ｍｌのプロピオン酸メチルまたは酪酸メチル、２
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）および本酵
素の酵素液０．１ｍｌを含む混合溶液を２５℃で３０分
間インキュベートした後、２０ｍｌのエタノールを加
え、０．０５Ｎの水酸化カリウムで遊離した酸を滴定し
た。その結果、本酵素は、上記２種類のいずれのエステ
ルについても遊離の酸を生成せず、検出し得るエステラ
ーゼ活性のないことが確認された。
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）および本酵
素の酵素液０．１ｍｌを含む混合溶液を２５℃で３０分
間インキュベートした後、２０ｍｌのエタノールを加
え、０．０５Ｎの水酸化カリウムで遊離した酸を滴定し
た。その結果、本酵素は、上記２種類のいずれのエステ
ルについても遊離の酸を生成せず、検出し得るエステラ
ーゼ活性のないことが確認された。
【００３８】（実施例９）本酵素の基質特異性 実施例２で精製された本酵素を種々の０.２ＭのＤ−ア
ミノ酸メチルエステルに３０℃、ｐＨ６.５で５時間作
用させ、その反応液をシリカゲルＴＬＣおよび逆相ＨＰ
ＬＣに供した。ＴＬＣ分析の結果を図３に示す。図３の
下欄は、アミノ酸の種類を通常の１文字記号で示す。Ｒ
（ＮＯ2）はニトロアルギニンである。本酵素が、極め
て広い基質特異性を示すことが理解される。
ミノ酸メチルエステルに３０℃、ｐＨ６.５で５時間作
用させ、その反応液をシリカゲルＴＬＣおよび逆相ＨＰ
ＬＣに供した。ＴＬＣ分析の結果を図３に示す。図３の
下欄は、アミノ酸の種類を通常の１文字記号で示す。Ｒ
（ＮＯ2）はニトロアルギニンである。本酵素が、極め
て広い基質特異性を示すことが理解される。
【００３９】Ｄ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｄ
−ＰｈｅＯＭｅ）を基質とした場合の、出発物および５
時間後の反応液の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４
に示す。逆相カラムとしてケムコソルブ（ケムコ社製）
を用い、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１
０％から７０％までのアセトニトリルの濃度勾配により
溶出した。反応生成物は、アミノ酸分析および質量分析
により、Ｄ−フェニルアラニンのオリゴペプチド（重合
度２〜６）であることが確認された。
−ＰｈｅＯＭｅ）を基質とした場合の、出発物および５
時間後の反応液の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４
に示す。逆相カラムとしてケムコソルブ（ケムコ社製）
を用い、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１
０％から７０％までのアセトニトリルの濃度勾配により
溶出した。反応生成物は、アミノ酸分析および質量分析
により、Ｄ−フェニルアラニンのオリゴペプチド（重合
度２〜６）であることが確認された。
【００４０】上記と同様に、本酵素を種々のＬ−アミノ
酸メチルエステルに作用させた場合のシリカゲルＴＬＣ
分析の結果を図５に示す。図３および図５の結果から、
本酵素はＤ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸エス
テルのいずれをも基質としてオリゴペプチド合成反応を
触媒し得ることが理解される。
酸メチルエステルに作用させた場合のシリカゲルＴＬＣ
分析の結果を図５に示す。図３および図５の結果から、
本酵素はＤ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸エス
テルのいずれをも基質としてオリゴペプチド合成反応を
触媒し得ることが理解される。
【００４１】（実施例１０）本酵素を用いる用いるオリ
ゴペプチド合成 実施例２で精製された本酵素（４０Ｕ）を、０.０２Ｍ
のアセチル−Ｄ−フェニルアラニンメチルエステル（Ａ
ｃ−Ｄ−ＰｈｅＯＭｅ）と０.２ＭのＬ−ロイシンアミ
ド（Ｌ−ＬｅｕＮＨ2）とを含む水溶液（ｐＨ６.５）
に、３０℃で５時間作用させた。反応生成物を、逆相Ｈ
ＰＬＣで分取した。逆相カラムとしてケムコソルブ（ケ
ムコ社製）を用い、実施例９と同じ条件で溶出した。逆
相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図６に示す。分取した生
成物を質量分析に供することにより、生成物がアセチル
−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンアミド（Ａｃ−
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＮＨ2）であることが確認され
た。質量スペクトルを図７に示す。
ゴペプチド合成 実施例２で精製された本酵素（４０Ｕ）を、０.０２Ｍ
のアセチル−Ｄ−フェニルアラニンメチルエステル（Ａ
ｃ−Ｄ−ＰｈｅＯＭｅ）と０.２ＭのＬ−ロイシンアミ
ド（Ｌ−ＬｅｕＮＨ2）とを含む水溶液（ｐＨ６.５）
に、３０℃で５時間作用させた。反応生成物を、逆相Ｈ
ＰＬＣで分取した。逆相カラムとしてケムコソルブ（ケ
ムコ社製）を用い、実施例９と同じ条件で溶出した。逆
相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図６に示す。分取した生
成物を質量分析に供することにより、生成物がアセチル
−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンアミド（Ａｃ−
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＮＨ2）であることが確認され
た。質量スペクトルを図７に示す。
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、種々のアミノ酸オリゴ
ペプチドを合成する酵素、およびこの酵素を生産する微
生物が提供される。そのため、本酵素は、医療分野で広
く利用されているペプチド性抗生物質、ホルモンなどの
製造に有用である。
ペプチドを合成する酵素、およびこの酵素を生産する微
生物が提供される。そのため、本酵素は、医療分野で広
く利用されているペプチド性抗生物質、ホルモンなどの
製造に有用である。
【図１】 本酵素のｐＨ特性を示す。
【図２】 本酵素の温度特性を示す
【図３】 本酵素を０.２Ｍの各種Ｄ−アミノ酸メチル
エステルと、ｐＨ６.５、３０℃で５時間インキュベー
トした後のシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。
エステルと、ｐＨ６.５、３０℃で５時間インキュベー
トした後のシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。
【図４】 本酵素を０.２ＭのＤ−フェニルアラニンメ
チルエステルと、ｐＨ６.５、３０℃で５時間インキュ
ベートした場合の（ａ）出発物および（ｂ）５時間後の
反応液の逆相高速液体クロマトグラムを示す。
チルエステルと、ｐＨ６.５、３０℃で５時間インキュ
ベートした場合の（ａ）出発物および（ｂ）５時間後の
反応液の逆相高速液体クロマトグラムを示す。
【図５】 本酵素を０.２Ｍの各種Ｌ−アミノ酸メチル
エステルと、ｐＨ６.５、３０℃で５時間インキュベー
トした後のシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。
エステルと、ｐＨ６.５、３０℃で５時間インキュベー
トした後のシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。
【図６】 本酵素を０.０２Ｍのアセチル−Ｄ−フェニ
ルアラニンメチルエステルと０.２ＭのＬ−ロイシンア
ミドとを含む水溶液（ｐＨ６.５）に、３０℃で５時間
作用させた後の反応液の逆相高速液体クロマトグラムを
示す。
ルアラニンメチルエステルと０.２ＭのＬ−ロイシンア
ミドとを含む水溶液（ｐＨ６.５）に、３０℃で５時間
作用させた後の反応液の逆相高速液体クロマトグラムを
示す。
【図７】 本酵素を０.０２Ｍのアセチル−Ｄ−フェニ
ルアラニンメチルエステルと０.２ＭのＬ−ロイシンア
ミドとを含む水溶液（ｐＨ６.５）に、３０℃で５時間
作用させた後の生成物の質量スペクトルを示す。
ルアラニンメチルエステルと０.２ＭのＬ−ロイシンア
ミドとを含む水溶液（ｐＨ６.５）に、３０℃で５時間
作用させた後の生成物の質量スペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 竹西 繁行 奈良県奈良市神功１丁目６番地平城第１団 地19−302 (72)発明者 島田 裕司 大阪府大阪市東住吉区北田辺４丁目６番13 号 (72)発明者 室 哲雄 京都府宇治市五ヶ庄西川原32番地の８ ユ ニライフ宇治Ａ棟 310号 (72)発明者 永尾 寿浩 大阪府大阪市生野区生野西４丁目18番６号 (72)発明者 渡辺 嘉 大阪府大阪市城東区森之宮２丁目７番809 号 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF03E FF04E FF05E FF11E FF12E LL01 LL05 4B064 AG01 CA02 CA21 CB30 CD13 CE03 CE04 CE06 CE07 CE10 CE11 DA01 DA16 4B065 AA15X AC14 AC15 BB01 BC01 BC03 BC26 BD14 BD15 BD17 BD18 BD33 BD50 CA27 CA29 CA44
Claims (9)
- 【請求項１】 アミノ酸エステルとアミン成分とを基質
とするオリゴペプチド合成反応を触媒する酵素であっ
て、該アミノ酸エステルとして、Ｄ−アミノ酸エステル
およびＬ−アミノ酸エステルのいずれをも利用し得る、
酵素。 - 【請求項２】 前記アミン成分として、Ｄ−アミノ酸お
よびＬ−アミノ酸のいずれをも利用し得る、請求項１に
記載の酵素。 - 【請求項３】 プロテアーゼ活性、ペプチダーゼ活性、
およびエステラーゼ活性のいずれをも有しない、請求項
１または２に記載の酵素。 - 【請求項４】 ｐＨが４〜９の範囲でオリゴペプチド合
成反応を触媒し、至適ｐＨが６．５±０．５である、請
求項１から３のいずれかに記載の酵素。 - 【請求項５】 ０〜６０℃の温度範囲でオリゴペプチド
合成反応を触媒し、至適温度が３５±５℃である、請求
項１から３のいずれかに記載の酵素。 - 【請求項６】 ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子
量が２９±３ｋＤａである、請求項１から３のいずれか
に記載の酵素。 - 【請求項７】 請求項１から６のいずれかに記載の酵素
を生産する微生物。 - 【請求項８】 バチルス ミコイデス ＡＳ−１（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＡＳ−１）（生命研
菌寄第１６９６９号；ＦＥＲＭ Ｐ−１６９６９）であ
る、請求項７に記載の微生物。 - 【請求項９】 請求項１から６のいずれかに記載の酵
素、または請求項７または８に記載の微生物をオリゴペ
プチド合成反応に使用する工程を包含する、オリゴペプ
チドの合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10251650A JP2000078971A (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10251650A JP2000078971A (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000078971A true JP2000078971A (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=17225983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10251650A Withdrawn JP2000078971A (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000078971A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003010189A1 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing dipeptide, peptide synthase to be used therein and process for producing peptide synthase |
| WO2004011653A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | 新規ペプチド生成酵素遺伝子 |
| US7749742B2 (en) | 2002-07-26 | 2010-07-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing tripeptides and/or peptides longer than tripeptides |
| JP2011152075A (ja) * | 2010-01-27 | 2011-08-11 | Tottori Univ | Ｄ−，ｌ−ペプチドの立体選択的合成法 |
-
1998
- 1998-09-04 JP JP10251650A patent/JP2000078971A/ja not_active Withdrawn
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003010189A1 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing dipeptide, peptide synthase to be used therein and process for producing peptide synthase |
| US7754466B2 (en) | 2001-07-26 | 2010-07-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing dipeptides |
| US7749742B2 (en) | 2002-07-26 | 2010-07-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing tripeptides and/or peptides longer than tripeptides |
| US7531340B2 (en) | 2002-07-26 | 2009-05-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene |
| US7736871B2 (en) | 2002-07-26 | 2010-06-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene |
| US7736876B2 (en) | 2002-07-26 | 2010-06-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene |
| US7288389B2 (en) | 2002-07-26 | 2007-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene |
| WO2004011653A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | 新規ペプチド生成酵素遺伝子 |
| US8039232B2 (en) | 2002-07-26 | 2011-10-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a dipeptide |
| US8329428B2 (en) | 2002-07-26 | 2012-12-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Enzyme that catalyzes a peptide-forming reaction from a carboxy component and an amine component, microbe producing the same, and a method of producing a dipeptide using the enzyme or microbe |
| US8389241B2 (en) | 2002-07-26 | 2013-03-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Enzyme that catalyzes a peptide-forming reaction from a carboxy component and an amine component, microbe producing the same, and a method of producing a dipeptide using the enzyme or microbe |
| US8753841B2 (en) | 2002-07-26 | 2014-06-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Enzyme that catalyzes a peptide-forming reaction from a carboxy component and an amine component, microbe producing the same, and a method of producing a dipeptide using the enzyme or microbe |
| JP2011152075A (ja) * | 2010-01-27 | 2011-08-11 | Tottori Univ | Ｄ−，ｌ−ペプチドの立体選択的合成法 |
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