JPH0482898A - 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は新規なペプチドおよび該ペプチドまたはその塩
を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関
する。

［従来の技術］ 血圧上昇をもたらす代表的な生体内因子としてレニン・
アンジオテンシン基が、また血圧降下に働く代表的な生
体内因子としてカリクレイン・キニン系が知られている
が、アンジオテンシン変換酵素（以後ｒＡＣＥＪという
）はこのいずれの系にも大きく関与している。

その機構を簡単に説明する。まず、レニン・アンジオテ
ンシン系では、血中に分泌された腎臓の酵素レニンが血
中のアンジオテンシノーゲンに作用してデカペプチドで
あるアンジオテンシン系を生成する。このアンジオテン
シンＩは血圧上昇作用を示さないが、これにＡＣＥが作
用するとオクタペプチドであるアンジオテンシン■を生
成する。このアンジオテンシン■は末梢血管を収縮させ
るとともに、副腎皮質に作用してアルドステロンの産出
を促し、アルドステロンは腎臓に作用してナトリウムの
再吸収・体液量増加を招いて心拍出量の増大をもたらし
、そのいずれもが血圧を大きく上昇させる。

一方、カリクレイン・キニン系では血中の前駆体タンパ
ク質であるキニノーゲンに血中酵素のカリクレインが作
用してキニンを遊離産出するが、このキニンは末梢血管
を拡張させるとともにホスホリパーゼＡ２を活性化して
ブクスタグラジンの合成を促進して血圧を降下させる。

ところがこのカリクレイン・キニン系にＡＣＥが働くと
、ＡＣＥは末梢血管の拡張作用およびホスホリパーゼＡ
２の活性化作用を有する上記キニンを分解・不活性化し
てしまうために、血圧の降下が生じなくなる。

したがって、ＡＣＨの上記のような働きを阻害する物質
（ＡＣＥ阻害剤）が存在すると、血圧上昇物質であるア
ンジオテンシン■のＩｌｔが抑制され、且つ血圧降下物
質として働くキニンの分解が防止されて、血圧の上昇抑
制および血圧降下が可能になる。

かかる点から近年ＡＣＥ阻害剤の研究開発が色々行われ
ており、天然タンパク質由来の、または合成による特定
のペプチド類がＡＣＥ阻害作用を有することが報告され
ている。これまでに報告された天然タンパク質由来のＡ
ＣＥ阻害ペグチドとしては、マムシ由来のブラジキニン
・ポテンシェークーＢ　（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒ。

Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−１ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）お
よびブラジキニン・ポテンシエーターＣ（Ｐｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）　
［いずれもＨ，ＫａＬ。

ａｎｄ　　Ｔ、　　５ｕｚｕｋｉ　　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、１０．ｐ、９７２（１９７１）に記載され
ている］、牛乳カゼイン由来のペプチドである　Ｐｈｅ
−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　（特公昭６０
−２３０８５号公報）、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ　（特開昭５９−４４３２３号公報）、Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（特開平
２２０２６３号公報）、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ａｒｇｓ魚類タ魚類タンパ米質由
来チドであるＴｙｒ−ＬｙｓＳｅｒ−ＰＭ−１１ｅ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ、　Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ、　　トウモロコシアーゼイン由来のペプチ
ドであるＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−ＰｒｏＸＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒ。

Ｐｒｏ等を挙げることができるが、その大半はアミノ酸
が５個以上結合したペプチドである。

［発明の内容］ 上記のような状況下に本発明者らもＡＣＥ阻害作用を有
する物質について研究を進めてきた。

その結果、上記既知のＡＣＥ阻害ペプチドとは異なった
アミノ酸配列を有する、ロイシンリジン−プロリンが配
列した新規なトリペプチド　Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　
　を乳清タンパク質の加水分解物から単離することがで
き、そしてこのトリペプチドがＡＣＥ阻害作用を有する
ことを見出しｌこ。

したがって、本発明は、下記の式 ％式％ で表されるペプチドおよびその塩である。

更に、本発明は上記式で表されるペプチドまたはその塩
を有効成分とするＡＣＥ阻害剤を包含する。

本発明の上記ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドは、最初
は乳清タンパク質のプロテアーゼによる加水分解処理生
成物として発見されたものであり、その場合には上記３
種のアミノ酸Ｌｅｕ。

ＬｙｓおよびＰｒｏはいずれもし一アミノ酸である。

しかしながら、それに限定されず上記のアミノ酸配列を
有するｌ−リペプチドであればいずれの光学異性体であ
ってもよく、該３種のアミノ酸の全部がＤ−アミノ酸か
らなるトリペプチドおよび３種のアミノ酸のうちのいず
れか１つまたは２つがし一アミノ酸であって残りがＤ−
アミノ酸からなるトリペプチドも包含され、それらは化
学合成により製造することができる。

本発明のトリペプチドの調製法の例を挙げると以下のと
おりである。

乳清タンパク質の加水分解による方法 乳清タンパク質をプロテアーゼを使用して加水分解して
水溶性の乳清タンパク質由来ペプチド混合物を調製する
。その際に、乳清タンパク質を水等の液体中に分散また
は溶解させた状態で加水分解を行うのが、操作のし易さ
、目的物の収量や純度の点から好ましい。

プロテアーゼとしては、酸性で作用するプロテアーゼ、
特に酵素の活性中心にアスパラギン酸残基とアスパラギ
ン酸のカルボン酸イオンが関与するアスパルティックプ
ロテイナーゼを使用するのがよい。そのような７０テア
ーゼの例としでは、ペプシン、ヒイロタケ起源のアスバ
ルティックプロテイナーゼ、アスペルギルス起源のアス
パルティックプロテイナーゼ、ペニシリウム起源のアル
バルティックプロテイナーゼを挙げることができ、特に
ペプシン、アスペルギルス起源のアスパルティックプロ
テイナーゼが目的物を高収率で得ることができる点で好
ましい。プロテアーゼは１種類のみを使用しても、また
はプロテアーゼ同士がお互いに悪影響を及ぼさないかぎ
りは複数種を併用してもよい。複数のプロテアーゼを使
用する場合は、該複数のプロテアーゼを同時に存在させ
て加水分解を行っても、または１種類ずつ逐次に用いて
加水分解を行ってもよい。また、プロテアーゼはフリー
の状態で使用しても、固定化して使用してもよい。プロ
テアーゼの使用量はいずれの場合も乾燥したグルテン１
００　ｇ当たりプロテアーゼ約５，０００〜１００．０
００　ｕｎｉｔｓを用いるのがよい。

ここで本明細書中のプロテアーゼ活性（ｕｎｉｖ）はす
べて下記の方法により測定したものである。

プロテアーゼ活性の測定法 基質として米国メルク社製のハラ−スティンカゼ１２１
％溶液を用い、アンソン−萩原変法［赤堀四部編パ酵素
研究法″第２巻、第２３７頁（昭和３６年１月１０日、
朝食書店発行）］により測定した。反応は３０°Ｃで３
０分間行い、１分間に１Ｐｇのチロシン相当量を遊離す
るのに要する酵素量を１ｕｎｉｔとした。

プロテアーゼ処理は、各々の状況（例えばプロテアーゼ
の種類、プロテアーゼの使用形態等）に応じて最適のｐ
Ｈ１温度、プロテアーゼ量、処理速度、処理時間等の条
件を選択して行うのがよく、例えば上で挙げたプロテア
ーゼを使用する場合にはｐｎ約１．５〜５．０、温度約
３０〜５０°Ｃで、０．７５Ｍ　ト！Ｊクロロ酢酸への
溶解率が約４０〜７０％になるまで加水分解を行うとよ
い。

目的とする加水分解状態が達成された時点で加熱および
／またはｐＨ調整してプロテアーゼを失活させ、失活し
た酵素、未分解乳清タンパり質等の不溶性固形物を遠心
分離等の適当な手段で分離除去し、残留液中に含まれて
いるペプチド混合物を乾燥等により回収する。

次いで、このペプチド混合物を水等に溶解させた状態で
膜分画、イオン交換分画、ゲル濾過分画等により分離精
製し、それを更に高速液体クロマトグラフィー（例えば
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等）等
により処理して上記トリペプチドを純粋な形態で単離す
る。

上記したペプチド混合物を含有する水溶液の分離精製お
よびトリペプチドの単離は、例えば次の（ａ）〜（ｆ）
の工程からなる方法で行うことができる。

（ａ）ペプチド混合物を合材する水溶液のｐＨを約３．
０〜５．０に調整し、これをイオン交換クロマトグラフ
ィーにかけ（例えば東ソー株式会社製の５Ｐ−Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ　５５０Ｃを充填したカラムに通過させる）
、このクロマトグラフィーに吸着した成分をＯＭから０
．５Ｍまでの直線濃度勾配を有するＮａＣｌ水溶液で溶
離し、得られる各画分の中から高い阻害活性を有する両
分（ＮａＣＩ水溶液濃度が約０．４〜０．５Ｍの範囲で
溶離してくる両分）を回収する、 （ｂ）上記高い阻害活性を有する画分を分子ふるい処理
して（例えばバイオラッド社製のバイオゲルＰ−２を充
填したカラムを通過させる）、更にいくつかの両分に蒸
留水で溶出分離してその中から更に高い阻害活性を有す
る両分を回収する、 （ｃ）上記（ｂ）で回収した画分を高速液体クロマトグ
ラフィー（例えば東ソー株式会社製の０ＤＳ２２０Ｔ）
に通過させ、吸着成分を０．２％トリフルオロ酢酸水溶
液（Ａ液）とアセトニトリルを５０％含有する０、１％
トリフルオロ酢酸水溶液（Ｂ液）七の混合液であって混
合液中のＢ液の濃度が０％から１００％まで直線的に増
加する直線濃度勾配溶離液を用いて溶離すると、アセ１
−二トリルの濃度が約２０〜２２％の範囲の溶離液区分
に高吸収ピークが現れ、この画分のＡＣＥ阻害活性を測
定確認して回収する、 （ｄ）必要に応じて上記（ｃ）の工程を繰返す、（ｅ）
（ｄ）工程で得られた画分から溶媒を乾燥等により除去
して白色の固体を回収し、そして（ｆ）上記白色固体と
して得られた生成物のアミノ酸配列を例えば高滓製作所
製の気相式プロティンシーケンサ−（ＰＳＱ−１システ
ム）等を使用して調べ、Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏか
らなるトリペプチドであることを確認する。

また、本発明のトリペプチドを化学合成により製造する
場合は、例えば次の方法を採用することができる。

本発明のトリペプチドの化学合成法 ペプチド合成装置［ファルマシア社（スエデン）製のＢ
ｉｏｌｙｎｘ　４１７０］　を使用して合成する。

具体的には、ポリアミド樹脂にＦｍｏｃ・プロリンを縮
合させた後そのＦｍｏｃ基を除去して末端アミノ基を遊
離させ、この遊離アミノ基にＦｍｏｃ・リジンを縮合さ
せてから　Ｆｍｏｃ基を除去し、更にＦｍｏｃ・ロイシ
ンを縮合してからＦｍｏｃ基を除去して上記樹脂で保護
されたペプチドを形成する。

これを９５％トリフルオロ酢酸水溶液と室温で６０分間
反応させて樹脂を分離させた後、樹脂を濾去する。トリ
フルオロ酢酸水溶液を減圧留去した後、残留物を０．Ｉ
Ｎ酢酸に溶解し、その溶液を高速液体クロマトグラフィ
ー（ＯＤＳ−１２０Ｔ　’）に通して不純物を除去する
ことによって純度の高いＬｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏを
単離する。

本発明のＡＣＥ阻害剤は人間および種々の動物に投与す
ることができ、少量の投与によって顕著な血圧降下およ
び上昇抑制を達成することができる。

本発明のＡＣＥ阻害剤の好適な投与量は、投与される人
間や動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種
々の条件によって異なる。

そして、本発明のＡＣＥ阻害剤は経口投与および非経口
投与のいずれによっても投与可能であり、更に単独で投
与しても、また製薬工業において通常使用されている固
体担体や液状担体と−緒に投与してもよく、或は他の薬
剤と混合または組合わせて使用することができる。また
投与形態は、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水
溶液、注射剤等の任意の形態が可能である。

更に、本発明のＡＣＥ阻害剤は、食品や飼料中に添加し
て、またはそれらと−緒に投与することもでき、その場
合には天然タンパク質に由来するＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｙ
ｓ　−Ｌ−Ｐｒｏが望ましい。

以下に、本発明を例を挙げて具体的に説明するが本発明
はそれらによって限定されない。

実施例 乳清タンパク質（日本プロティン株式会社ＡＬＡＣＥＮ
　１３２）　５　ｇを０．０３Ｎ塩酸１００ｍ１２に分
散溶解させた後、蒸留水を加えて全ｉ２００ｍ（＋にし
た。

ＩＮ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整した後、ペプシン
（米国ングマ社製）　５０００ｕｎｉｔｓを加え、３７
°Ｃで１５時間反応させた。次に、５Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨを４４に調整した後、アスペルギルス起
源のアルパルティックプロテイナーゼ（大野製薬社製の
プロテアーゼＭ）１０００ｕｎｉｔｓを加えて４５°Ｃ
で５時間反応させた。次いで、５Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液でｐＨを６．０に調整した後９０°Ｃで２０分間加
熱して酵素を失活させるとともに未溶物を沈澱させた。

室温に冷却した後、１００００Ｇで２０分間遠心分離し
て固形物を分離除去した。上澄液を回収して凍結乾燥し
てペプチド混合物４．０ｇを得た。

上記で得たペプチド混合物５００ｍｇを５ｍＭ酢酸緩衝
液５０ｍ１２に溶解した後、ＩＮ塩酸でｐＨ３，５に調
整した。

これを直径１６ｍｍ、長さ２００ｍｍのカラムに東ソ株
式会社製の５Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　５５０Ｃを４
０ｍ（ｌ充填したイオン交換クロマトカラムに１．ｏｍ
（２／分の流速で通過させた後、このクロマトカラムに
吸着した成分をＯＭから０．５Ｍまでの直線濃度勾配を
有するＮａＣｌ水溶液からなる溶離液１２０ｍ１２をｌ
　ｍ０１分の流速で流してカラムから溶離したところ、
ＮａＣＩ水溶液濃度が０．４〜０゜５Ｍの部分に高い阻
害活性を有する画分を得たのでこれを回収　し　プこ　
。

次いで、上記画分をバイオランド社製のバイオゲルＰ−
２を２００ｍＱ、充填したカラム（カラム直径１５ｍｍ
、長さ１００１００Ｏに旧３３ｍ０．／分の流速で通し
て分子ふるい処理し、次に蒸留水で溶離してその中から
高い阻害活性を有する画分を回収しｌこ　。

上記画分を東ソー株式会社製の高速液体クロマトグラフ
ィー０ＤＳ−１２０ＴにｉｍＱ１分の流速で通過させた
後、吸着成分を０１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）
とアセトニトリルを５０％含有する０、１％トリフルオ
ロ酢酸水溶液（Ｂ液）との混合液であって混合液中のＢ
液の濃度が０％から１００％まで直線的に増加する直線
濃度勾配溶離液をｌ　ｍＱ／分の流速で通して溶離する
と、アセトニトリルの濃度が２０〜２２％の溶離液区分
が高い阻害活性を有していたのでこの画分を回収し、こ
の高速液体クロマトグラフィー処理を再度繰返した。

得られた両分から溶媒を乾燥除去して白色の固体１２０
０μｇを回収した。この白色固体を高滓製作所製の気相
式プロティンシーケンサ−（ＰＳＱｌシステム）を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ、Ｎ末端から順次
Ｌ−Ｌｅｕ、　Ｌ−ＬｙｓおよびＬ　−Ｐ　ｒ　ｏが遊
離してきた。このことから式Ｈ−ＬＬｅｕ　−Ｌ−Ｌｙ
ｓ−Ｌ−Ｐｒｏ　・ＯＨで表されるトリペプチドである
ことが確認された。

上記で調製したトリペプチドおよび既知のＡＣＥ阻害ペ
プチドのＡＣＥ阻害活性を下記の方法で測定したところ
、下記の表に示す結果を得た〇 ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定法 試料液５０μａを試験管にとり、これにＡＣＥ液（米国
シグマ社製のうさぎ肺由来のＡＣＥの１ｕｎｉｔを水５
ｍ＋２に溶解させたもの）２０μＱを加える。

３７°Ｃに５分間保った後、基質（５ｍＭ　Ｈｉｐ−Ｈ
ｉｓＬｅｕ　：　ｐＨ８，３）を加えて３７°Ｃで３０
分反応させ、次いで０．３Ｍ水酸化す］・リウム水溶液
１ｍ（２を加えて反応を停止させる。蛍光試薬オルト−
フタルアルデヒド液１００μＱを加えて室温で１０分間
反応させる。次に３Ｎ塩酸２００ｍ４加え、蒸留水で５
０倍に希釈する。約３０分後に分光蛍光光度計で励起波
長３００ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍにおける蛍光強度（
Ａ）を測定する。試料液の代わりに蒸留水５０μＱを同
様に処理して蛍光強度（Ｂ）を測定する。

阻害活性はＢ−Ａ／Ｂにより求められる。

試料液の濃度を変えて、阻害活性を上記と同様に測定し
、活性を５０％阻害する濃度を求めてこれをＩＣ３゜と
じて表した。

［ペプチドのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ６゜）］ペプチド　
　　　　１ｃｓｏ（μＭ） Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ　・ＯＨ（本
発明）２．２ブラジキニン・ポテンシェークーＢ６．４
ブラジキニン・ポテンシューター０２９０上記表の結果
から、本発明のＡＣＥ阻害剤は既知のＡＣＥ阻害剤ブラ
ジキニン・ボテンシェーク−ＢおよびＣに比べて極めて
低濃度液で、すなわちごく少量の使用でＴＣ５ｏを達成
することができ、ＡＣＥ阻害活性が非常に高いことがわ
かる。

［発明の効果］ 本発明のＡＣＥ阻害剤は、極めて少量の投与でＡＣＨの
活性を阻害して血圧降下および血圧上昇抑制を達成する
ことができる。

また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、白色の水溶性粉末であ
るために、そのままでまたは水等に溶解させて経口投与
および非経口投与のいずれの方法によっても極めて簡単
に投与することができる。

その上、本発明の新規なトリペプチドＬｅｕＬｙｓ−Ｐ
ｒｏ　　は、３個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡
単な構造を有する低分子量化合物であるため、化学合成
によっても簡単に製造することができ、しかも投与した
場合に体内での吸収性がよく高い血圧降下作用を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記の式 Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ で表されるペプチドおよびその塩。 ２）下記の式 Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ で表されるペプチドまたはその塩を有効成分とするアン
   ジオテンシン変換酵素阻害剤。