CN101643767A - 一种从杏仁粕中制备杏仁肽的方法 - Google Patents

一种从杏仁粕中制备杏仁肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从杏仁粕中制备杏仁肽的方法，通过将杏仁粕干燥、粉碎、过筛后加入去离子水，调pH值，在一定温度下搅拌浸提、离心、取上清液；再用HCL调至pH4.5，离心，取沉淀层水洗；收集沉淀置于酶解罐中，按照固液比1∶(10－15)添加去离子水，搅拌混合加热至40－55℃，以HCL调节pH值5－8，按照蛋白酶∶粗杏仁蛋白为(1－2)∶100的质量比加入蛋白酶酶解反应后，调节pH值5.5，并升温到90℃，维持20min，经酶灭活处理后冷却至室温，将酶解液在5000r/min下离心20min取上清液，并利用阳阴离子交换树脂将杏仁蛋白酶解液进行脱盐处理后，经超滤分离获得杏仁蛋白肽具有广泛应用价值。

Description

一种从杏仁粕中制备杏仁肽的方法
发明领域
本发明涉及肽提取技术领域。具体的说，本发明涉及果仁粕中提取肽的技术领域。
背景技术
近年来，多肽在生物体内的生理功能受到越来越多的重视。大量研究结果表明，蛋白质由于其分子量大，结构复杂，摄入人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥。多肽是比蛋白质结构简单，分子量小，由2-16个氨基酸通过肽键连接的一类化合物，按氨基酸组成数目可人为分为短肽(2-5个氨基酸)，多肽(6-16个氨基酸)。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。科学发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切相关，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。由于多肽具有调节植物神经系统、活化细胞免疫机能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，这为开发肽药物、肽类保健食品提供了理论依据。可见，进行多肽的研究和开发有着十分重要的研究意义和应用前景。
在国外，多肽开发与应用方面的研究越来越广泛，主要研究的多肽包括酪蛋白肽、大豆肽、小麦肽、玉米肽、血蛋白肽、水产蛋白肽等。美国早在20世纪70年代就成立了专门研究机构，开展了大量多肽方面的研究工作，并取得了较大的进展。日本自20世纪80年代也在动植物蛋白多肽方面进行了广泛的研发，并将大豆多肽用于多肽功能性食品的生产中。韩国、欧洲等国家也都相继成立了专门从事多肽研制的生产经营相关产业。
我国于20世纪80年代中后期开始研究大豆多肽，开展了大量有关大豆蛋白肽的酶法生产、功能性质和生理活性的研究，并取得了一定的成效。目前，我国多肽保健品和多肽食品的开发应用也日益广泛，但由于技术、规模等因素的局限，多肽的研究仍处于初步阶段，有待于进一步发展。
杏仁为蔷薇科植物杏或山杏的种子，含丰富的蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、维生素P以及钙、磷、铁、硒等营养成分，其中蛋白质含量为24％～27％。杏仁油脂含量高达50％左右，杏仁油生产厂提取油脂后的饼粕中仍含有大量的优质蛋白质，但长期以来它们大多被作为饲料、肥料或被当成残余物废弃，这造成了营养资源的极大浪费。杏仁蛋白质中含有人体所需得18种氨基酸，且氨基酸组成比例平衡，是一种良好的蛋白质营养强化剂和药食兼用的植物蛋白质。探讨通过杏仁粕提取杏仁肽，弃废为宝具有重要现实意义。
发明内容
针对目前未见有关从杏仁粕中制备杏仁肽的报道，本发明弃废为宝，利用杏仁原料带给提取杏仁肽的重要功能，克服了杏仁粕提取杏仁肽的技术难题。
本发明提供了一种从杏仁粕中制备杏仁肽的方法，将榨取杏仁油后的杏仁粕，干燥后用粉碎机粉碎，过40-60目筛后，按固液比1∶(20-25)的质量比加入去离子水，用NaOH调至pH值为7.5-9.5，在温度40-55℃搅拌浸提1-3小时，于3000-6000r/min离心10-30min，取上清液，用HCL调至pH4.5，于3000-6000r/min离心10-30min，取沉淀层水洗1-3遍。收集沉淀置于酶解罐中，按照固液比1∶(10-15)的质量比添加去离子水，搅拌混合加热至40-55℃，以HCL调节pH值5-8，按照蛋白酶∶粗杏仁蛋白为(1-2)∶100的质量比加入蛋白酶，进行酶解反应2-6小时后，调节pH值到5.5，并迅速升温到85-90℃，维持20min，经酶灭活处理后迅速冷却至室温，将已经失活的酶解液在5000r/min下离心10-20min取上清液，并利用阴阳离子交换树脂将杏仁蛋白酶解液进行脱盐处理后，经超滤分离获得不同需求的杏仁蛋白肽。
本发明可根据需要获得不同氨基酸组成数目的杏仁蛋白肽，采用超滤技术对脱盐后的杏仁蛋白酶解液进一步进行分离纯化，并用截留分子量为5KDa的超滤膜对杏仁多肽进行一级超滤，再采用分子截留量为1KDa的超滤膜对滤过液进行二级超滤处理获得相应不同的杏仁蛋白短肽、杏仁蛋白多肽。
本发明中，加入的蛋白酶优选选择木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，可通过市场任意获得。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
本发明通过对杏仁进行冷榨后所剩的蛋白粕进行深加工，增加其附加值，使其变废为宝。本发明的杏仁蛋白肽的得率为82.35％，大豆肽的行业标准规定一级大豆肽的纯度需达到80％以上(干基)，所以本发明所制备的肽高于一级肽的标准。另外，本发明所得到的肽的抗氧化性和血管紧张素转化酶(ACE)抑制效果十分明显。杏仁蛋白肽对羟自由基(OH·)的清除率为69.7％，对超氧阴离子自由基的清除率达到了84.6％；血管紧张素转化酶(ACE)抑制率高达75.1％。
附图说明
(无)
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
实施例一：
(1)将干燥后的杏仁粕，用粉碎机粉碎后过40目筛。
(2)向杏仁粕粉中加入去离子水，以质量比计，按固液比为1∶20，用NaOH调至pH值为7.5，温度40℃，在此条件下搅拌浸提1小时，于3000r/min离心10min，取上清液。用HCL将上清液调至pH4.5，于3000r/min离心30min，取沉淀层水洗1遍。收集沉淀。
(3)将上述所得沉淀置于酶解罐中，按照粗杏仁蛋白∶去离子水为1∶10的质量比添加去离子水，搅拌混合，加热至40℃，以HCL调节pH值5，按照蛋白酶∶粗杏仁蛋白为1∶100的质量比加入木瓜蛋白酶进行酶解反应2小时。
(4)调节pH值到5.5并迅速升温到85℃维持20min，对酶进行灭活处理。将经失活的酶解液迅速冷却后在5000r/min下离心10min取上清液。
(5)利用阳离子交换树脂及阴离子交换树脂将杏仁蛋白酶解液进行脱盐处理。脱盐后的杏仁蛋白酶解液利用截留分子量为5KDa的超滤膜对杏仁多肽进行一级超滤，再采用分子截留量为1KDa的超滤膜对滤过液进行二级超滤处理。
(6)分别收集小于1KDa及1KDa-5KDa的杏仁多肽超滤液进行真空浓缩，再将浓缩后的杏仁多肽溶液经冷冻干燥制成干粉。
(7)通过上述提取制备工艺杏仁蛋白肽的得率为82.35％，具体指标如下：
  样品   杏仁蛋白粉   杏仁蛋白   粗肽   分子量为2KD
  得率(％)   100   44.8   36.89   所含肽为23.98
实施例二：
(1)将榨取杏仁油后的杏仁粕，干燥后用粉碎机粉碎，过60目筛。
(2)向杏仁粕粉中加入去离子水，按固液比为1∶25的质量比，用NaOH调至pH值为9.5，温度55℃，在此条件下搅拌浸提3小时，于6000r/min离心30min，取上清液。用HCL将上清液调至pH4.5，于6000r/min离心30min，取沉淀层水洗3遍。收集沉淀。
(3)将上述所得沉淀置于酶解罐中，按照粗杏仁蛋白∶去离子水为1∶15的质量比添加去离子水，搅拌混合，加热至55℃，调节pH值8，按照蛋白酶∶粗杏仁蛋白为2∶100的质量比加入中性蛋白酶进行酶解反应6小时。
(4)调节pH值到5.5并迅速升温至90℃维持20min，对酶进行灭活处理。将经失活的酶解液迅速冷却至室温，在5000r/min下离心10min取上清液。
(5)将杏仁蛋白酶解液分别通过阳离子交换树脂及阴离子交换树脂进行脱盐处理。脱盐后的杏仁蛋白酶解液利用截留分子量为5KDa的超滤膜对杏仁多肽进行一级超滤，再采用分子截留量为1KDa的超滤膜对滤过液进行二级超滤处理。
(6)分别收集小于1KDa及1KDa-5KDa的杏仁多肽超滤液进行真空浓缩，再将浓缩后的杏仁多肽溶液经冷冻干燥制成干粉。
(7)通过上述提取制备工艺杏仁蛋白肽的得率为83.22％。
实施例三：
(1)将榨取杏仁油后的杏仁粕，干燥后用粉碎机粉碎，过50目筛。
(2)向杏仁粕粉中加入去离子水，按固液比为1∶23的质量比，用NaOH调至pH值为8.0，温度50℃，在此条件下搅拌浸提2小时，于5000r/min离心20min，取上清液。用HCL将上清液调至pH4.5，于4500r/min离心20min，取沉淀层水洗2遍。收集沉淀。
(3)将上述所得沉淀置于酶解罐中，按照粗杏仁蛋白∶去离子水为1∶13的质量比搅拌混合，加热至50℃，调节pH值7，按照蛋白酶∶粗杏仁蛋白为1.5∶100的质量比加入中性蛋白酶进行酶解反应4小时。
(4)调节pH值到5.5并迅速升温至88℃维持20min，对酶进行灭活处理。将经失活的酶解液迅速冷却至室温，在5000r/min下离心15min取上清液。
(5)将杏仁蛋白酶解液分别通过阳离子交换树脂及阴离子交换树脂进行脱盐处理。脱盐后的杏仁蛋白酶解液利用截留分子量为5KDa的超滤膜对杏仁多肽进行一级超滤，再采用分子截留量为1KDa的超滤膜对滤过液进行二级超滤处理。
(6)分别收集小于1KDa及1KDa-5KDa的杏仁多肽超滤液进行真空浓缩，再将浓缩后的杏仁多肽溶液经冷冻干燥制成干粉。
(7)通过上述提取制备工艺杏仁蛋白肽的得率为81.69％.
实施例四：
经过上述实施例，将杏仁肽测定采用SDS-PAGE电泳法。杏仁蛋白酶解后，样品电泳带与低分子量标准蛋白质带比较，分子量大大降低，说明木瓜蛋白酶作用杏仁蛋白水解的肽分子量集中在2KD左右。
实施例五：
杏仁蛋白肽的羟自由基(OH·)清除能力的测定采用邻二氮菲-Fe2+氧化法，测得结果为：杏仁蛋白肽对羟自由基(OH·)的清除率为69.7％；杏仁蛋白肽的超氧阴离子自由基(O2 -)的清除能力的测定采用邻苯三酚法，测定结果为：杏仁蛋白肽对超氧阴离子自由基(O2 -)的清除率达到84.6％；杏仁蛋白肽ACE抑制活性的RP-HPLC测定，测定结果为：ACE的抑制率为75.1％。

Claims (4)

1、一种从杏仁粕中制备杏仁肽的方法，其特征在于，将榨取杏仁油后的杏仁粕，干燥后用粉碎机粉碎，过40-60目筛后，加入去离子水，用NaOH调节pH值，在温度40-55℃搅拌浸提1-3小时后离心，取上清液，用HCL调至pH4.5，离心，取沉淀层水洗1-3遍；收集沉淀置于酶解罐中，按照粗杏仁蛋白∶去离子水为1∶(10-15)的质量比添加去离子水，搅拌混合加热至40-55℃，以HCL调节pH值5-8，按照蛋白酶∶粗杏仁蛋白为(1-2)∶100的质量比加入蛋白酶，进行酶解反应2-6小时后，调节pH值到5.5，并迅速升温到85-90℃，维持20min，经酶灭活处理后迅速冷却至室温，将已经失活的酶解液在5000r/min下离心10-20min取上清液，并利用阴阳离子交换树脂将杏仁蛋白酶解液进行脱盐处理后，经超滤分离获得杏仁蛋白肽。
2、如权利要求1所述的从杏仁粕中制备杏仁肽的方法，其特征在于，所述的将杏仁粕经干燥、粉碎、目筛后，按固液比1∶(20-25)的质量比加入去离子水。
3、如权利要求1所述的从杏仁粕中制备杏仁肽的方法，其特征在于，所述的用NaOH调节pH值为7.5-9.5。
4、如权利要求1所述的从杏仁粕中制备杏仁肽的方法，其特征在于，所述的在温度40-55℃搅拌浸提1-3小时后离心，在3000-6000r/min条件下离心10-30min。
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