CN110079574A - 一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在于提供一种多酶分步酶解法从冷榨杏仁粕中制备低聚肽及其制备方法。本方法能够改善杏仁蛋白加工特性，释放蛋白中的功能性肽段，解决现有技术的发展瓶颈，促进蛋白溶解，提高提取效率，同时改善蛋白的功能特性，获得产物为小分子低聚肽，产物活性较高且具有较强的抗氧化功能。凭借酶解反应较高的特异性使得制备过程易于控制反应、副产物生成少。本申请所提供的工艺可以丰富杏仁蛋白深加工产品，提高杏仁深加工利用率和产品附加值，推动整个杏仁蛋白产业的发展。

Description

一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁肽的方法
发明领域
本发明属于生物活性肽的制备技术领域，具体的，本发明涉及一种多酶分步酶解法从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的技术领域。
背景技术
甜杏仁粕是杏仁油加工过程中产生的重要副产物，常被人们用作廉价的动物饲料，只有部分用于生产蛋白粉及其深加工产品。冷榨甜杏仁饼中蛋白质变性较小，脱脂后含量在50％左右，其氨基酸种类齐全，必需氨基酸占比趋近于1973年FAO/WHO修正的标准模式谱，因此冷榨甜杏仁粕蛋白是一种较优的植物蛋白资源。通常甜杏仁蛋白在加热和高压处理下会产生变性，导致蛋白溶解性降低，难于提取，限制了它在食品中的应用。
以植物性蛋白为原料制备的功能性肽类因具有许多特殊生理功能(抗高血压、抗氧化、增强免疫力等)而成为国内外研究的热点。但是以冷榨杏仁粕为原料制备杏仁功能性短肽的相关研究，国内外报道较少，杏仁多肽的组成、结构尚不够清楚，市场上也缺乏杏仁功能性短肽相关产品。蛋白质越来越多地用于改善食品配方中的功能特性。由于酶解具有较高的特异性、易于控制反应、副产物生成少等优点，酶解被广泛应用于改善蛋白质的功能和营养特性。一些植物蛋白经过酶解的情况下，发泡和乳化性能得到了改善，而在其他情况下，这些特性发生了变化。确实，通过有限的酶解进行修饰会伴随着分子量的降低和隐藏的疏水基团在界面的暴露。由此看来酶解可以很好地修饰蛋白质的功能和结构，从而改变蛋白质的溶解度、表面特征和乳化性能。因此以冷榨杏仁粕为原料制备杏仁功能性短肽可以改善杏仁蛋白加工特性，释放蛋白中的功能性肽段，丰富我国杏仁蛋白深加工产品，提高杏仁深加工利用率和产品附加值，推动整个杏仁蛋白产业的发展；同时促进农业增效和农民脱贫，带动农民致富。
发明内容
针对现有技术中杏仁肽提取率低的技术问题，本发明旨在于提供一种从冷榨杏仁粕中制备的低聚杏仁肽粉及其制备方法。本方法采用的多酶分步酶解技术能够改善杏仁蛋白加工特性，释放蛋白中的功能性肽段，制得的低聚杏仁肽粉具有很强的抗氧化能力，丰富杏仁蛋白深加工产品，提高杏仁深加工利用率和产品附加值，推动整个杏仁蛋白产业的发展。
本发明通过提供一种从冷榨杏仁粕中制备的低聚杏仁肽粉及其制备方法，通过将脱脂后的杏仁粉进行碱溶、酸沉、分步酶解、过滤、浓缩、脱色、干燥等步骤，制备获得具有很强的抗氧化能力的低聚杏仁肽。
本发明提供一种从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法，其具体制备方法步骤如下：
(1)将冷榨杏仁粕与石油醚按W/V比例1：2混合，并连续搅拌60min，静止至上层有机溶剂澄清，回收有机溶剂，重复操作至脱脂完全，自然风干12h得到脱脂杏仁粕；
(2)将脱脂杏仁粕粉碎，过60目筛，得到脱脂杏仁粕粉； (3)将上述步骤获得的脱脂杏仁粉与水按W/V 1：(25-45)混合，加入0.5mol/L NaOH调整pH至8.0-12.0，温度40-60℃，搅拌提取50-90min，3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比按W/V1：10提取两次，并将三次上清液混合；酸沉采用 0.5mol/L HCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；
(4)将杏仁蛋白按质量体积比(W/V)为1：10，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶进行第一步酶解，Alcalase酶的用量为4500-6500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；
(5)调节所述第一酶解液的pH值为6.0-8.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶解进行第二步酶解，中性蛋白酶与风味蛋白酶加入按照质量比例为1：1混合，复合酶总用量为3000-7000U/g，45- 65℃酶解90-210min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；
(6)将低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用 1000-100nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用50-4nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液；
(7)将上述步骤获取的滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入 3-11g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
优选的，脱脂杏仁粉与水按W/V比例为1：35。
优选的，碱溶步骤中液体pH为9.0，温度50℃。
优选的，第二步酶解过程中，中性蛋白酶与风味蛋白酶总用量为5000U/g。
优选的，第二步酶解过程中，溶液pH为7.0，反应温度 55℃，水解时间210min。
优选的，低聚肽粗液滤清液用500nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。
优选的，浓缩液中加入活性炭的添加量为7g。
本发明中，利用上述制备方法制备的杏仁低聚肽相对分子质量为100～800，其氨基酸组成及序列为QIVSISPA(Gln-Ile-Val-Ser-IlE- Ser-Pro-Ala)，是现有技术未见报道一种杏仁低聚肽，并具有较强的抗氧化活性，对于DPPH自由基的清除率高达91％、超氧阴离子自由基的清除率高达87％、羟自由基·OH捕获能力高达70％。
通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：
(1)本发明通过上述具体提供的一种从冷榨杏仁粕中制备低聚肽粉的方法，将Alcalase酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶配合使用，利用对杏仁粕脱脂干燥、碱溶酸沉提取蛋白、分步酶解、陶瓷膜过滤等技术步骤制得杏仁低聚肽。本发明采用的多酶分步酶解制备低聚肽的方法可以解决现有技术的发展瓶颈，促进蛋白溶解，提高提取效率，同时改善蛋白的功能特性，获得产物为活性较高的小分子低聚肽，凭借酶解反应较高的特异性使得制备过程易于控制反应、副产物生成少。
(2)本发明的方法生产得到的杏仁低聚肽粉具有较强的抗氧化活性，对于DPPH自由基的清除率高达91％、超氧阴离子自由基的清除率高达87％、羟自由基·OH捕获能力高达70％。
(3)本发明中，利用上述制备方法制备的杏仁低聚肽相对分子质量为100～800，其氨基酸组成及序列为QIVSISPA(Gln-Ile-Val- Ser-IlE-Ser-Pro-Ala)，经与现有技术披露的低聚肽氨基酸序列结构比对，证实本发明制备获得的杏仁低聚肽现有技术未见报道。
附图说明
图1所示为从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的工艺流程图。
图2所示为从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的分子量图。
图3显示为脱脂杏仁粉与水比例和溶解pH交互响应面图。
图4显示为脱脂杏仁粉与水比例和搅拌提取时间交互响应面图。
图5显示为溶解pH和搅拌提取时间交互响应面图。
图6显示为凝胶色谱G-25分离杏仁蛋白酶解物的图谱图。
图7显示为杏仁低聚肽各组分自由基清除率图。
图8显示为组分的一级质谱图。
图9显示为组分的二级质谱图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中材料有：石油醚、蒸馏水、NaOH、HCl、陶瓷膜、活性炭、Alcalase酶、中性蛋白酶购于南宁庞博公司、风味蛋白酶购于诺维信公司。所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法
本发明提供一种从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法，其具体制备方法步骤如下：
(1)将冷榨杏仁粕与石油醚按W/V比例1：2混合，并连续搅拌60min，静止至上层有机溶剂澄清，回收有机溶剂，重复操作至脱脂完全，自然风干12h得到脱脂杏仁粕；
(2)将脱脂杏仁粕粉碎，过60目筛，得到脱脂杏仁粕粉； (3)脱脂杏仁粉与水按1：(25-45)(W/V)混合，加入 0.5mol/L NaOH调整pH至8.0-12.0，温度40-60℃，搅拌提取50-90min，3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10 (W/V)提取两次，并将三次上清液混合；酸沉采用0.5mol/L HCl 调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；
(4)将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶进行第一步酶解，Alcalase酶的用量为4500-6500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；
(5)调节所述第一酶解液的pH值为6.0-8.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶解进行第二步酶解，中性蛋白酶与风味蛋白酶加入比例为1：1，复合酶总用量为3000-7000U/g，45-65℃酶解90- 210min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；
(6)低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用 1000-100nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用50-4nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液；
(7)将滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入3-11g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
实施例二：从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法
基于实施例一，脱脂杏仁粉与水按1：25(W/V)混合，加入 0.5mol/L NaOH调整pH至8.0，温度40℃，搅拌提取50min， 3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V) 提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶4500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为6.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1：1，复合酶总量为3000U/g，45℃酶解 90min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用1000nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用50nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。制备杏仁低聚肽粉：将滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入3g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
实施例三：从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法
基于实施例一，脱脂杏仁粉与水按1：30(W/V)混合，加入 0.5mol/L NaOH调整pH至9.0，温度45℃，搅拌提取60min， 3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V) 提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至 4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶5000U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为6.5，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1:1，复合酶总量为4000U/g，50℃酶解120min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用800nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用50nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。制备杏仁低聚肽粉：将滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入5g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
实施例四：从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法
基于实施例一，脱脂杏仁粉与水按1：35(W/V)混合，加入 0.5mol/L NaOH调整pH至10.0，温度50℃，搅拌提取70min， 3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V) 提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至 4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9.0，加入Alcalase酶5500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为7.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1:1，复合酶总量为5000U/g，55℃酶解 150min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用500nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。制备杏仁低聚肽粉：将滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入7g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
实施例五：从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法
基于实施例一，脱脂杏仁粉与水按1：40(W/V)混合，加入 0.5mol/L NaOH调整pH至11.0，温度55℃，搅拌提取90min， 3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V) 提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至 4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶6000U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为7.5，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶的比例为1：1，复合酶总用量为6000U/g，60℃酶解180min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用200nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。制备杏仁低聚肽粉：将滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入9g 活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
实施例六：从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法
基于实施例一，脱脂杏仁粉与水按1：45(W/V)混合，加入 0.5mol/L NaOH调整pH至12.0，温度60℃，搅拌提取90min，3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V) 提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至 4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶6500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为8.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1：1，复合酶总用量为7000U/g，65℃酶解 210min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用100nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用4nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。制备杏仁低聚肽粉：将滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加11g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
实施例七：杏仁蛋白提取工艺优化
为确定制备杏仁低聚肽最佳加工过程，以杏仁粗蛋白含量为指标，对杏仁粗蛋白获取过程中脱脂杏仁粉与水比例、溶解pH、提取温度、搅拌提取时间进行单因素实验。在此基础上，以杏仁粗蛋白提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合方法，进行响应面分析实验。
1、检验方法
按照实施例二至实施例六中的制备工艺制得杏仁低聚肽，杏仁粗蛋白含量的检测方法按照国家标准GB/T5009.5进行检测。
2、单因素试验
(1)脱脂杏仁粉与水比例对杏仁粗蛋白提取率的影响
脱脂杏仁粉与水按1：(25-45)(W/V)混合，设置5个处理组，每组分别加入脱脂杏仁粉与水按1：25、1：30、1：35、1： 40、1：45(W/V)混合，0.5mol/L NaOH调整pH至9.0，温度 50℃，搅拌提取70min，3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V)提取两次，并将三次上清液混合；用 0.5mol/L HCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水 2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9.0，加入Alcalase酶 5500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为7.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1：1，复合酶用量为，5000U/g，55℃酶解150min；将酶解液温度升至 95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液3000rpm离心，清液用 500nm陶瓷膜粗滤，收取滤过液，再用20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。蒸发浓缩后，向浓缩液中加7g活性炭，搅拌脱色 30min过滤，真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。检测杏仁粗蛋白含量。脱脂杏仁粉与水比例对杏仁粗蛋白提取率的影响实验结果见表 1所示。
表1：脱脂杏仁粉与水比例对杏仁粗蛋白提取率的影响
脱脂杏仁粉与水比例 杏仁粗蛋白提取率/％
1：25 77.6
1：30 77.9
1：35 78.1
1：40 75.5
1：45 70.2
实验结果表1所示，不同脱脂杏仁粉与水比例对杏仁粗蛋白提取率有显著影响。其中，脱脂杏仁粉与水比例为1：35时，杏仁粗蛋白提取率为77.9％，高于其他实验组结果。因此，综合考虑生产实际，脱脂杏仁粉与水比例设定为1：35为较优水平。
(2)溶解pH对杏仁粗蛋白提取率的影响
脱脂杏仁粉与水按1：35(W/V)混合，设置5个处理组，每组分别0.5mol/L NaOH调整pH至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、 12.0，设定溶解温度为50℃，搅拌提取70min，3500r/min离心 25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V)提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为 1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至 9.0，加入Alcalase酶5500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为7.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1:1，复合酶用量为，5000U/g，55℃酶解150min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液3000rpm离心，清液用500nm陶瓷膜粗滤，收取滤过液，再用 20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。蒸发浓缩后，向浓缩液中加 7g活性炭，搅拌脱色30min过滤，真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。检测杏仁粗蛋白含量及小分子肽含量(分子量小于1000Da)。溶解pH对杏仁粗蛋白提取率的影响实验结果见表2所示。
表2：溶解pH对杏仁粗蛋白提取率的影响
溶解pH 杏仁粗蛋白提取率/％
8.0 73.2
9.0 78.7
10.0 80.5
11.0 64.5
12.0 52.3
实验结果表2所示，不同溶解pH对杏仁粗蛋白提取率有显著影响，其中，溶解pH为10.0时，获得的杏仁粗蛋白提取率为 80.5％，高于其他实验组结果。因此，综合考虑生产实际，溶解pH 为10.0设定为10.0为较优水平。
(3)提取温度对杏仁粗蛋白提取率的影响
脱脂杏仁粉与水按1：35(W/V)混合，0.5mol/L NaOH调整 pH至10.0，设置5个处理组，每组分别设定溶解温度为40℃、 45℃、50℃、55℃、60℃，搅拌提取70min，3500r/min离心 25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V)提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/L HCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10(W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至 9.0，加入Alcalase酶5500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为7.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1：1，复合酶用量为，5000U/g，55℃酶解150min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液 3000rpm离心，清液用500nm陶瓷膜粗滤，收取滤过液，再用 20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。蒸发浓缩后，向浓缩液中加 7g活性炭，搅拌脱色30min过滤，真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。检测杏仁粗蛋白含量及小分子肽含量(分子量小于 1000Da)。提取温度对杏仁粗蛋白提取率的影响实验结果见表3所示。
表3：提取温度对杏仁粗蛋白提取率的影响
提取温度/℃ 杏仁粗蛋白提取率/％
40 72.5
45 77.7
50 79.8
55 79.1
60 77.9
实验结果表3所示，提取温度对杏仁粗蛋白提取率有显著影响，其中，提取温度为55℃，获得的杏仁粗蛋白提取率为79.8％，高于其他实验组结果。因此，综合考虑生产实际，提取温度设定为 70min为较优水平。
(4)搅拌提取时间对杏仁粗蛋白提取率的影响
脱脂杏仁粉与水按1：35(W/V)混合，0.5mol/L NaOH调整 pH至10.0，溶解温度为50℃，设置5个处理组，每组分别搅拌提取50min、60min、70min、80min、90min，3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比1：10(W/V)提取两次，并将三次上清液混合；用0.5mol/LHCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；将杏仁蛋白按质量体积比为1：10 (W/V)，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9.0，加入Alcalase酶5500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH值为7.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶比例为1：1，复合酶用量为5000U/g，55℃酶解150min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；过滤低聚肽粗液：低聚肽粗液3000rpm离心，清液用500nm陶瓷膜粗滤，收取滤过液，再用20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。蒸发浓缩后，向浓缩液中加7g活性炭，搅拌脱色30min过滤，真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。检测杏仁粗蛋白含量及小分子肽含量(分子量小于1000Da)。搅拌提取时间对杏仁粗蛋白提取率的影响实验结果见表4所示。
表4：搅拌提取时间对杏仁粗蛋白提取率的影响
搅拌提取时间/min 杏仁粗蛋白提取率/％
50 73.2
60 75.8
70 77.8
80 77.6
90 76.53
实验结果表4所示，搅拌提取时间对杏仁粗蛋白提取率有显著影响，其中，搅拌提取时间为70min，获得的杏仁粗蛋白提取率为 77.8％，高于其他实验组结果。因此，综合考虑生产实际，搅拌提取时间设定为70min为较优水平。
3、响应面优化试验
在单因素试验基础上，选取脱脂杏仁粉与水比例、溶解pH、搅拌提取时间，影响杏仁粗蛋白提取率较高的三个因素进行Box- Behnken中心组合实验并结合实际实验条件选取合理水平，以杏仁粗蛋白提取率作为响应值设计了三因素三水平的响应面分析实验，其组合设计水平取值及编码见表5。
表5：因素水平编码表
在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取脱脂杏仁粉与水比例(A)、溶解pH(B)、搅拌提取时间 (C)进行三因素三水平响应面分析，以杏仁粗蛋白提取率(Y1) 作为响应值，试验设计方案和结果见表6。利用DesignExpert8.0软件对数据进行回归分析。
表6：响应面试验方案及结果
根据表6的实验结果，为了考察各个交互项对杏仁粗蛋白提取率的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert8.05 软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应面图，如附图3、附图4和附图5所示。
表7：Y1回归模型的方差分析
注：*P<0.05，差异显著；**p<0.01，差异极显著。
对表7中数据进行回归拟合，得到自变量与杏仁粗蛋白提取率 (Y1)的二次多项回归方程为：
Y1＝＝80.15+1.08A+2.78B-0.69C-0.86AB-1.48AC-2.85BC- 3.66A2+0.12B2-4.87C2。
进一步对回归模型进行的方差分析，由表7结果可知，模型p ＜0.0001，表明回归模型达到极显著水平，因变量与所有自变量之间的线性关系显著(R2＝0.9718)。失拟项p＝0.0545＞0.05，模拟失拟项不显著；该回归模型的矫正决定系数R2 Adj＝0.9355，表明响应值变化的93.55％能用该模型解释。变异系数CV＝0.014，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，故该回归方程模型成立，可用此模型对杏仁低聚肽提取工艺结果进行分析及预测。
4、响应面优化及验证
利用Design-Expert软件，通过杏仁粗蛋白提取率取最大值对简化后的回归方程进行联合求解，得到制备杏仁蛋白的优化工艺条件。考虑到实际实验过程中的可操作性及简便性，将脱脂杏仁粉与水比例设定为1：30、溶解pH设定为9、搅拌提取时间设定为 70min。为了检验所得结果的准确性和有效性，采用上述优化参数进行了3次平行实验，所得结果如表8所示。从表8中可以看出，实验结果值与响应面理论预测值较接近，因此，认为基于该响应曲面法所得的优化配方参数准确可靠。
表8：响应面软件预测最佳工艺条件
实施例八：制备杏仁低聚肽酶解工艺优化
基于上述实施例二至实施例六中提供的方案进行杏仁低聚肽第二步酶解工艺优化。检测杏仁粗蛋白含量及小分子肽含量(分子量小于1000Da)。
1.正交优化制备杏仁低聚肽酶解工艺
设计单因素实验，分别探究第二步酶解过程中的复合酶总用量，溶液pH，反应温度，酶解时间对制备杏仁低聚肽工艺中获得小分子肽质量的影响。在单因素实验的基础上进行四因素三水平正交实验，见表9。
表9：正交试验因素与水平
正交优化试验结果及分析，见表10。
表10：正交试验结果及分析
从表10可以看出，在试验设计的范围内，复合酶总用量对制备杏仁低聚肽的影响最大，其次为酶解时间，反应温度和溶液pH。制备杏仁低聚肽的最佳工艺配为A1B2C2D2，复合酶总用量5000U/g，溶液pH7.0，反应温度55℃，酶解时间150min，按照实施例四提供的制备工艺制得杏仁低聚肽。
实施例九：杏仁低聚肽感官评定
按照实施例二至实施例六中所提供的杏仁低聚肽制备工艺所获得的样品分别编码为M1-M5。杏仁低聚肽的感官评定主要包括形态、色泽、气味和杂质四个方面，由20名具有一定经验的专业人员，对本申请实施例四中所提供的杏仁低聚肽生产工艺制得的进行感官评价。各项指标取平均分，各项指标满分均为25分。感官评定结果如表11。
表11：杏仁低聚肽感官评分表
通过感官评定可知，本发明提供的实施例二至实施例六所提供的杏仁低聚肽制备工艺所制得的杏仁低聚肽具有较好的感官特性，粉末状，无结块白色、淡黄色、黄色，具有本产品应有的滋味与气味，无其它异味，无肉眼可见的其它杂质，符合标准DB50/T669- 2016低聚肽品质鉴定中的感官要求。其中实施例四所提供的杏仁低聚肽的感官评定结果明显优于其它实施例所提供的工艺所制得的杏仁低聚肽，即清液用500nm陶瓷膜粗滤，再用20nm陶向浓缩液中加如7g活性炭所制得的杏仁低聚肽具有较好的品质。
实施例十：杏仁低聚肽品质
采用国标方法对实施例四中制得的杏仁低聚肽中各组分进行检测，其中：杏仁粗蛋白含量的检测方法为GB/T5009.5，低聚肽的检测方法参照大豆肽粉GB/T22492-2008，水分检测方法为 GB/T5009.3，灰分的检测方法GB/T5009.4，各理化指标参考国标 GB/T22492-2008。检测结果如表12所示：
表12：杏仁低聚肽最佳工艺理化指标测定结果
成份 国标 实测值
粗蛋白含量(以干基记)％ ≥90 90.4％
低聚肽含量(以干基记)％ ≥80 88.75
≥80％的肽段相对质量 ≤2000 ≤1000
灰分/％ ≤6.5 2.98
水分/％ ≤7.0 4.05
由表12可知，按照实施例四中所提供的制作工艺所获得的杏仁低聚肽在蛋白含量(以干基记)、低聚肽含量(以干基记)、≥80％的肽段相对质量、灰分、水分各项指标均优于其它方案所获得的杏仁低聚肽。
实施例十一：杏仁低聚肽抗氧化活性测定
(1)杏仁低聚肽清除DPPH自由基的作用
将1毫升实施例四中制备获得的杏仁低聚肽溶液与1mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合，搅拌均匀，在室温下置于黑暗中放置 20min。用分光光度计在517nm处测量混合物的吸光度。空白组：测定1mL浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液与1mL乙醇混合液的吸光值，对照组用蒸馏水代替样品。DPPH自由基清除活性计算如下:
式中：A0-试样吸光度；Ai-对照组的吸光度；Aj-为空白组的吸光度。
(2)杏仁低聚肽清除超氧阴离子自由基的测定
将1mL实施例四中制备获得的杏仁低聚肽溶液与1.8mL 50mmo1/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)混合，然后加入0.1mL 10mmo1/L 焦性没食子酸在25℃下反应10min，测定溶液在320nm处的吸光度，每30s记录一次，持续4min。吸光度线的斜率反映了样品中焦性没食子酸的氧化速率(ΔAs)；空白组：1.0mL蒸馏水代替样品，吸光度线斜率代表焦性没食子酸氧化速率(ΔAc)。所有试验均为一式三份。计算其清除超氧阴离子自由基的能力为：
(3)杏仁低聚肽的羟自由基·OH捕获能力的测定
将1.0mL(1.865mM)邻二氮菲和2.0mL实施例四中制备获得的杏仁低聚肽溶液与1.0mL(1.865mM FeSO4·7H2O溶液)在损伤管中混合，加入1.0mL(0.03％，v/v)H2O2发生芬顿反应，生成羟基自由基。然后将反应体系在37℃的水浴60min，最后用分光光度计在536nm处测定反应混合物的吸光度。抗坏血酸作为阳性对照。所有试验均为一式三份。羟基自由基清除活性计算公式如下：
式中:As-吸收率；不含抗氧化剂的阴性对照的吸光度；An-无 H2O2的空白吸光度。Ab-无H2O2的空白吸光度。
将处理好的Sephadex G-25装成1.6cm×150cm的玻璃层析柱，用纯净水将杏仁低聚肽配置成20mg/mL的溶液，上样量为5mL，用在线分光光度计测定280nm处的吸光度，得到洗脱曲线如图6所示，用蒸馏水以20mL/h的流速收集各洗脱峰，冷冻干燥各级洗脱组分，以捕获各自由基能力为检测指标筛选抗氧化活性最高的抗氧化肽。检测结果如图7所示。
实施例十二：杏仁低聚肽结构鉴定
点0.5μL的实施例四中制备获得的杏仁低聚肽溶液于MALDI 不锈钢靶板上，自然干燥后，再点上0.5μL 0.5g/Lα-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)溶液(溶剂为0.1％三氟乙酸+50％的乙睛)中，在室温下自然干燥。另点0.5μL 0.5g/L CCA溶液(不加样品)作为空白对照。激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为20kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。仪器先用myoglobin酶解肽段进行外标校正。基质和杏仁低聚肽溶液的PMF质量扫描范围为相对分子质量为100～800。选择与对照基质的PMF图有差异的肽段离子进行MS/MS分析。分析结果如附图8、附图9所示分析可知，本申请制备的杏仁低聚肽相对分子质量为100～800，其氨基酸组成及序列为QIVSISPA(Gln-Ile-Val-Ser-IlE-Ser-Pro-Ala)，是现有技术未见报道一种新的杏仁低聚肽。
根据本发明中记载的实施例一至实施例六中所提供的从冷榨杏仁粕中制备低聚肽方法制备获得的低聚肽产品，按照上述方法进行结构鉴定。鉴定结果显示其共性特征与实施例四中所提供的而技术方案较为一致，具体特征参见附图8与，附图9可知，制备的杏仁低聚肽相对分子质量为100～800，其氨基酸组成及序列为 QIVSISPA(Gln-Ile-Val-Ser-IlE-Ser-Pro-Ala)，通过对获得的低聚肽氨基酸组成情况进行检索，目前尚无相同氨基酸组成的杏仁低聚肽报道，是现有技术未见报道一种新的杏仁低聚肽，本发明所获得的杏仁低聚肽氨基酸组成及其序列尚属首次报道。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种从冷榨杏仁粕中制备低聚肽的方法，其具体制备方法步骤如下：
（1）将冷榨杏仁粕与石油醚按W/V比例1：2混合，并连续搅拌60min，静止至上层有机溶剂澄清，回收有机溶剂，重复操作至脱脂完全，自然风干12h得到脱脂杏仁粕；
（2）将脱脂杏仁粕粉碎，过60目筛，得到脱脂杏仁粕粉；
（3）将上述步骤获得的脱脂杏仁粉与水按W/V1：（25-45）混合，加入0.5mol/L NaOH调整pH至8.0-12.0，温度40-60℃，搅拌提取50-90min，3500r/min离心25min，取上清液，沉淀再按固液比按W/V1：10提取两次，并将三次上清液混合；酸沉采用0.5mol/L HCl调上清液pH至4.5，离心，收集沉淀，水洗2-4遍后得到杏仁蛋白；
（4）将杏仁蛋白按质量体积比（W/V）为1：10，加水2L搅拌均匀，用0.5mol/L NaOH调pH至9，加入Alcalase酶进行第一步酶解，Alcalase酶的用量为4500-6500U/g，55℃酶解45min，得到第一酶解液；
（5）调节所述第一酶解液的pH值为6.0-8.0，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶解进行第二步酶解，中性蛋白酶与风味蛋白酶加入按照质量比例为1：1混合，复合酶总用量为3000-7000U/g，45-65℃酶解90-210min；将酶解液温度升至95℃，维持10min，然后冷却至室温，离心分离，收取清液，制得低聚肽粗液；
（6）将低聚肽粗液先经3000rpm的转速进行离心，将清液用1000-100nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用50-4nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液；
（7）将上述步骤获取的滤过液蒸发浓缩后，向浓缩液中加入3-11g活性炭，搅拌脱色30min，过滤除去活性炭，最后用真空冷冻干燥制成杏仁低聚肽粉。
2.如权利要求1所述的一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法，其特征在于，脱脂杏仁粉与水按W/V比例为1：35。
3.如权利要求1所述的一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法，其特征在于，碱溶步骤中液体pH为10.0，温度50℃。
4.如权利要求1所述的一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法，其特征在于，第二步酶解过程中，中性蛋白酶与风味蛋白酶总用量为5000U/g。
5.如权利要求1所述的一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法，其特征在于，第二步酶解过程中，溶液pH为7.0，反应温度55℃，酶解时间150min。
6.如权利要求1所述的一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法，其特征在于，低聚肽粗液滤清液用500nm陶瓷膜进行粗滤，收取滤过液，再用20nm陶瓷膜进行精滤，收取滤过液。
7.如权利要求1所述的一种从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法，其特征在于，浓缩液中加入活性炭的添加量为7g。
8.如权利要求1至7任意一项所述的从冷榨杏仁粕中制备杏仁低聚肽粉的方法获得杏仁低聚肽粉。
9.一种从冷榨杏仁粕中制备的杏仁低聚肽，相对分子质量为100~800。经分析获得该肽的氨基酸组成及序列为QIVSISPA(Gln-Ile-Val-Ser-IlE-Ser-Pro-Ala)。
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